專利名稱：在玉蜀黍中功能性表達(dá)酵母硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ynt1)以改善硝酸鹽吸收的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)內(nèi)容的領(lǐng)域主要涉及分子生物學(xué)。具體而言，本發(fā)明涉及用于改善植物中的氮利用效率和/或氮吸收的方法和組合物。
背景技術(shù)：
硝酸鹽是植物從土壤吸收的主要氮源。為滿足食物、飼料、纖維和燃料的全球供應(yīng)的需求，農(nóng)民們往往施加過(guò)量的氮肥以增加作物如玉蜀黍的谷粒產(chǎn)量。為避免硝酸鹽污染和減少耕作成本，需要能更有效地吸收/利用硝酸鹽的植物特別是玉蜀黍(maize)，以保持糧食供應(yīng)并保護(hù)我們的環(huán)境。硝酸鹽從土壤吸收至植物根細(xì)胞中，是一個(gè)逆著質(zhì)膜的電化學(xué)勢(shì)梯度的主動(dòng)過(guò)程。硝酸鹽一旦在根細(xì)胞中就會(huì)1)被細(xì)胞質(zhì)酶硝酸鹽還原酶還原成亞硝酸鹽，接著被葉綠體中的亞硝酸鹽還原酶還原成氨，然后摻入到氨基酸中；2)被吸收和貯存在液泡中；3) 被轉(zhuǎn)運(yùn)到木質(zhì)部以供長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)饺~中；和4)被排出根細(xì)胞。硝酸鹽移動(dòng)的所有步驟都由硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)推動(dòng)。根據(jù)對(duì)硝酸鹽的親和力，硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分成兩類低親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)和高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)。低親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)(LATS)在土壤硝酸鹽濃度大于ImM時(shí)起作用，而高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)(HATQ在土壤硝酸鹽濃度低于 ImM時(shí)發(fā)揮主要作用。根據(jù)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能發(fā)揮是否需要硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)蛋白，還可將高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)分成兩組。單組分HATS含有具有典型的運(yùn)載體類型的結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，該結(jié)構(gòu)具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，而雙組分HATS則包含額外的具有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的小的相關(guān)蛋白(Tong Y等人，Plant J.，(2005)41 :442-450)。單組分HATS見(jiàn)于真菌和紅藻， 而雙組分HATS據(jù)報(bào)道存在于綠藻和植物中。植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)可以是組成型的或者由硝酸鹽誘導(dǎo)。植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白充當(dāng)硝酸鹽響應(yīng)性信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組分，而獨(dú)立于硝酸鹽吸收的根生長(zhǎng)調(diào)節(jié)已有報(bào)道 (Little等人，PNAS(2005) 102 :13693-13698)。改善植物的氮利用效率和硝酸鹽吸收將是合乎需要的；但是，通過(guò)過(guò)表達(dá)煙草內(nèi)源高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)改善硝酸鹽吸收的嘗試卻失敗了 (Fraisier 等人，Plant J.，(2000)23 :489-496)。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，來(lái)自安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NT)即 YNTl當(dāng)在擬南芥(Arabidopsis)和玉蜀黍植物體內(nèi)表達(dá)時(shí)以及在體外測(cè)定法中，已顯示參與氮吸收。本發(fā)明提供NT多核苷酸、經(jīng)密碼子優(yōu)化的NT基因編碼序列、相關(guān)的多肽以及本發(fā)明NT序列的所有保守修飾變體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及增加植物的產(chǎn)量的方法。在一個(gè)方面，該方法包括將包CN 102549149 A
含編碼酵母NT (如YNT1)或保守修飾變體的多核苷酸的構(gòu)建體引入植物細(xì)胞中?？蓪⒃摱嗪塑账峥刹僮鞯剡B接至在植物中有功能的啟動(dòng)子以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成轉(zhuǎn)基因植物。該NT在該轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞中以足以增加NT活性的水平表達(dá)。在一個(gè)方面，該NT在該轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞中以足以增加植物產(chǎn)量的水平表達(dá)。本發(fā)明提供方法來(lái)改變作物植物特別是玉蜀黍的遺傳組成，使得這些作物在當(dāng)前的施肥狀況下產(chǎn)出更高和/或在肥料輸入顯著減少的情況下產(chǎn)出不變。從而，這類發(fā)明的效用在于既提升產(chǎn)量又減少肥料成本，相應(yīng)地對(duì)環(huán)境的影響也減少。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含編碼YNTlNT蛋白或其變體的分離多核苷酸序列的分離核酸。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是包含選自以下的核苷酸序列的分離的多核苷酸 (a)包含SEQ ID NO 3的核苷酸序列；和(b)與SEQ ID NO 3具有至少70%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有NT活性的多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含所描述的核酸的重組表達(dá)盒。另外，本發(fā)明涉及含有該重組表達(dá)盒的載體。此外，含有該重組表達(dá)盒的載體可有利于該核酸在宿主細(xì)胞申的轉(zhuǎn)錄和翻譯。本發(fā)明還涉及能夠表達(dá)本文所述的NT多核苷酸(包括例如YNTl和經(jīng)密碼子優(yōu)化的YNTl基因編碼序列)的宿主細(xì)胞。有多種宿主細(xì)胞可以使用，如但不限于微生物、 動(dòng)物、植物或昆蟲(chóng)細(xì)胞。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的核酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。優(yōu)選的含有本發(fā)明多核苷酸的植物包括但不限于玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、西紅柿和稷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物為玉蜀黍植物。另一個(gè)實(shí)施方案是獲自該植物的轉(zhuǎn)基因種子，其包含被可操作地連接至能驅(qū)動(dòng)在該植物中的表達(dá)的啟動(dòng)子的本文所述NT多核苷酸。本發(fā)明的植物與對(duì)照植物相比可具有改變了的NT。在一些植物中，該NT在根組織或營(yíng)養(yǎng)組織中被改變。本發(fā)明的植物可具有包括但不限于以下的表型中的至少一種根質(zhì)量增加、根長(zhǎng)度增加、葉大小增加、穗大小增加、種子大小增加、胚乳大小增加和生物量增加或者它們的組合。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是這樣的植物，其已在某個(gè)基因組座位被遺傳修飾，使得該基因組座位編碼了編碼YNTl或其變體的NT多肽。提供了用于提高該NT在植物中的活性的方法。該方法可包括將編碼YNTl的NT多核苷酸引入該植物中。提供了用于降低或消除NT多肽在該植物中的水平的方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼玫瑰紫菜(Porphyra perforata)硝酸鹽還原酶(PPNR)的多核苷酸，特別是編碼其中氨基酸位置551處的丙氨酸已被甘氨酸置換的 PPNR(A551G)和其中氨基酸位置551處的丙氨酸已被甘氨酸置換且氨基酸位置561處的絲氨酸已被天冬氨酸置換的PPNR(A551GS561D))的多核苷酸。這種硝酸鹽還原酶(NR)多核苷酸包括但不限于經(jīng)密碼子優(yōu)化的多核苷酸，例如經(jīng)玉蜀黍密碼子優(yōu)化的編碼PPNR A551G S561D的多核苷酸(其在本文中稱為PPNR A551G S561D M0)。本發(fā)明的NR多核苷酸可單獨(dú)地，或者與一條或多條本發(fā)明的YNTl多核苷酸堆疊(stacked)用于轉(zhuǎn)化植物，并用于方法中來(lái)改善植物中的NUE、硝酸鹽吸收、氮同化、根生物量或者它們的組合。本發(fā)明還提供包含至少一種本發(fā)明YNTl多核苷酸或NR多核苷酸的表達(dá)盒。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)染子重組表達(dá)盒的宿主細(xì)胞，該重組表達(dá)盒包含可操作地連接至任何編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸的在植物中有功能的啟動(dòng)子。還提供的是包含至少一個(gè)本發(fā)明表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化的植物、植物部分、植物細(xì)胞和種子。由以下描述，本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)及各方面對(duì)于技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。但是，應(yīng)理解，以下描述和具體實(shí)施方案雖然指示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，不過(guò)僅以示例的方式給出。本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了以下描述和閱讀了本公開(kāi)內(nèi)容的其他部分，各種落入本公開(kāi)的發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的變化形式和修改形式將會(huì)是顯而易見(jiàn)的。


由以下“具體實(shí)施方式
”以及構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的附圖和序列表，將能更充分地
理解本發(fā)明。圖1為表達(dá)ZM-RM2 =ADHI內(nèi)含子YNT1的玉蜀黍轉(zhuǎn)基因植株在3個(gè)地點(diǎn)在常氮 (NN)條件下進(jìn)行的田地產(chǎn)量試驗(yàn)的結(jié)果的圖示。在3個(gè)地點(diǎn)測(cè)試了七個(gè)事件，在2個(gè)地點(diǎn)測(cè)試了三個(gè)事件。這里示出了相對(duì)于無(wú)效事件(null)的相對(duì)產(chǎn)量(％ )。圖2為表達(dá)ZM-RM2 =ADHI內(nèi)含子YNT1的玉蜀黍轉(zhuǎn)基因植株在3個(gè)地點(diǎn)在低氮 (LN)條件下進(jìn)行的田地產(chǎn)量試驗(yàn)的結(jié)果的圖示。在3個(gè)地點(diǎn)測(cè)試了七個(gè)事件，在2個(gè)地點(diǎn)測(cè)試了三個(gè)事件。這里示出了相對(duì)于無(wú)效事件(null)的相對(duì)產(chǎn)量(％ )。圖3A-3B示出了 YNTl開(kāi)放閱讀框(SEQ ID NO 1)和YNTlMO開(kāi)放閱讀框(SEQ ID NO 3)的核苷酸序列比較。圖4A-4E示出了野生型玫瑰紫菜硝酸鹽還原酶(PPNR)開(kāi)放閱讀框(SEQ ID NO: 6)、玫瑰紫菜硝酸鹽還原酶(PPNR) A55IG開(kāi)放閱讀框(SEQ ID NO :4)、玫瑰紫菜硝酸鹽還原酶(PPNR) A551G S561D MO開(kāi)放閱讀框(SEQ ID NO 8)的核苷酸序列比較。圖5A-5B示出了野生型玫瑰紫菜硝酸鹽還原酶(PPNR) (SEQ ID NO 7)、玫瑰紫菜硝酸鹽還原酶(PPNR) A55IG(SEQ ID NO 5)和玫瑰紫菜硝酸鹽還原酶(PPNR)A551G S561D MO(SEQ ID NO 9)的氨基酸序列比較。
具體實(shí)施例方式除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。除非另外提出，否則本文所采用或所考慮的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。材料、方法和實(shí)例僅為示例性的而不是限制性的。如下內(nèi)容以舉例說(shuō)明的方式給出而無(wú)意于限制本發(fā)明的范圍。下文將參考附圖更完整地描述本發(fā)明，其中示出了本發(fā)明的一些但并非全部實(shí)施方案。確實(shí)，這些發(fā)明方案可以以許多不同的形式來(lái)體現(xiàn)，不應(yīng)被認(rèn)為局限于本文給出的實(shí)施方案；提供這些實(shí)施方案是為了使本公開(kāi)內(nèi)容能滿足適用的法律要求。類似的編號(hào)在全文中是指類似的要素。借助前面的描述和隨附的附圖中給出的教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)想到本發(fā)明的許多修改形式和其他實(shí)施方案。因此，應(yīng)當(dāng)了解，本發(fā)明不限于所公開(kāi)的特定實(shí)施方案，并旨在將修改形式和其他實(shí)施方案包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。雖然本文采用了特定術(shù)語(yǔ)，但它們僅以一般性和描述性含義使用而不出于限制目的。本發(fā)明涉及酵母硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(YNTl)序列及其變體在植物中的表達(dá)。雖然其他的旨在通過(guò)過(guò)表達(dá)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)改善植物中的硝酸鹽吸收的嘗試遭遇了失敗(參見(jiàn)例如Fraisier等人，Plant J.，(2000)23 :489-496)，但本文證實(shí)由根偏好啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)而表達(dá)酵母硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(YNTl)的玉蜀黍轉(zhuǎn)基因株系，在田地常氮產(chǎn)量試驗(yàn)中其產(chǎn)量比非轉(zhuǎn)基因同胞株系(無(wú)效株系(null))有改善，在溫室低氮條件下其產(chǎn)量潛力比無(wú)效株系有改善。分別參見(jiàn)圖1和2及實(shí)施例9和10。此外，也證實(shí)YNTl轉(zhuǎn)基因玉蜀黍植株在溫室中低氮條件下在籽苗期(seedling stage)具有改善的植物干物質(zhì)和增加的氮濃度。參見(jiàn)下文實(shí)施例9。因此，本文所述的表達(dá)YNTl或其變體的植株可以當(dāng)在正常或有限的氮肥力下生長(zhǎng)時(shí)具有改善的硝酸鹽吸收，或者可以增強(qiáng)植物的氮利用效率(NUE)。如本文別處所述，所述方法包括在植物中表達(dá)本文所述的NT多核苷酸。這種多核苷酸包括那些編碼YNT1、經(jīng)密碼子優(yōu)化的YNTl基因編碼序列及這些序列的變體的多核苷酸。例如，適用于本文所述方法的NT包括NT序列經(jīng)優(yōu)選以在特定植物(如玉蜀黍)中表達(dá)的編碼部分。還可通過(guò)對(duì)該多核苷酸序列進(jìn)行工程改造使得它能使用特定植物偏好的密碼子，來(lái)對(duì)該特定植物優(yōu)化表達(dá)。本文所用的“偏好的密碼子”是指特定宿主細(xì)胞在使用核苷酸密碼子來(lái)確定給定的氨基酸方面所表現(xiàn)的偏好。特定宿主的氨基酸的偏好密碼子是最常編碼該宿主中的該氨基酸的單一密碼子。特定氨基酸的玉蜀黍偏好密碼子可由來(lái)自玉蜀黍的已知基因序列得出。例如，當(dāng)植物為玉蜀黍時(shí)，可通過(guò)評(píng)估來(lái)自玉蜀黍植株的已知基因并確定特定密碼子的使用頻率，來(lái)確定偏好的密碼子用法。另參見(jiàn)Murray等人，Nuc 1 eic Acids Research, 17 :477-498(1989)中的表4。例如，丙氨酸的玉蜀黍偏好密碼子是GCC，因?yàn)楦鶕?jù)Murray等人(出處同上)中的沈個(gè)玉蜀黍基因的匯集序列，該密碼子有36%的概率編碼丙氨酸，相比之下GCG為M%，GCA為13%，GCT為27%。將Murray等人的表4復(fù)制于下。在一些情況中，為了使用玉蜀黍偏好的密碼子在玉蜀黍中進(jìn)行表達(dá)，將對(duì)NT序列中的每個(gè)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，例如在該多核苷酸的NT序列包含該特定NT多肽的100 %玉蜀黍偏好密碼子序列的情況中。例如，SEQ IDNO 3 (YNTlMO)的NT多核苷酸具有這樣的核苷酸序列，其包含100%的玉蜀黍偏好密碼子序列并編碼具有與天然YNTl蛋白(SEQ ID NO 2) 所產(chǎn)生的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。因此，對(duì)NT多核苷酸的序列進(jìn)行修飾以便優(yōu)化玉蜀黍表達(dá)。在一些情況中，可對(duì)NT多核苷酸序列進(jìn)行修飾，使得多核苷酸的開(kāi)放閱讀框的總G+C含量為編碼NT的開(kāi)放閱讀框的序列的總長(zhǎng)度的60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%或更多。在另一個(gè)方面，可對(duì)NT序列進(jìn)行修飾，使得限制位點(diǎn)、隱蔽型內(nèi)含子供體或受體位點(diǎn)或兩者、RNA不穩(wěn)定性位點(diǎn)及長(zhǎng)同源堿基段(base stretch)或者它們的組合被消除。表1.序列
序列名稱序列標(biāo)識(shí)號(hào)YNTl開(kāi)放閱讀框野生型多核苷酸SEQ ID NO 1YNTl野生型多肽SEQ ID NO 權(quán)利要求
1.一種分離的或重組的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NT)多核苷酸，所述多核苷酸包含選自以下的成員(a)包含已被置換的核苷酸的多核苷酸，其中所述核苷酸置換為圖3所示置換中的一者或多者，并且其中所述多核苷酸編碼具有NT活性的多肽；(b)包含SEQID NO 3中所示序列的多核苷酸；(c)在嚴(yán)格條件下與(a)的多核苷酸雜交的、在長(zhǎng)度上包含至少30個(gè)核苷酸的多核苷酸，其中所述條件包括在40-45%甲酰胺、IM NaClU % SDS中在37°C下雜交并在0. 5X-1X SSC中在55-60°C下洗滌，并且其中所述多核苷酸編碼具有NT活性的多肽；(d)與SEQID NO :3具有至少70%序列同一性的多核苷酸，其中所述序列同一性百分?jǐn)?shù)是基于整個(gè)編碼區(qū)域并且通過(guò)BLAST 2. 0在默認(rèn)參數(shù)下測(cè)定，并且其中所述多核苷酸編碼具有NT活性的多肽；(e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性從(a)-(d)中的任一項(xiàng)得到的分離的多核苷酸；和(f)與(a)-(e)中任一者的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼能使植物在較低肥力下產(chǎn)量或氮利用效率提高的NT多肽。
3.一種載體，所述載體包含至少一條根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸。
4.一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含至少一條可操作地連接至啟動(dòng)子的根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
5.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。
7.—種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自擬南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、甘蔗和稷。
9.一種由根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子，其中所述種子包含所述表達(dá)盒。
10.一種增加植物中的產(chǎn)量的方法，所述方法包括以下步驟(a)向植物細(xì)胞中引入包含NT多核苷酸的構(gòu)建體，其中所述NT多核苷酸可操作地連接至在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，并且其中所述NT多核苷酸選自(i)包含已被置換的核苷酸的多核苷酸，其中所述核苷酸置換是圖3所示置換中的一者或多者，并且其中所述多核苷酸編碼具有NT活性的多肽；( )編碼包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(iii)包含SEQID NO :1或3的編碼區(qū)所示的序列的多核苷酸；(iv)在中等嚴(yán)格性條件下與選自(i)和(ii)的多核苷酸雜交的、長(zhǎng)度包含至少30個(gè)核苷酸的多核苷酸，其中所述條件包括在40-45%甲酰胺、IM NaCl U % SDS中在37°C下雜交和在0. 5X-1X SSC中在55-60°C下洗滌，并且其中所述多核苷酸編碼具有NT活性的多肽； 和(ν)與至少一條選自SEQ ID NO :1和3的核苷酸序列具有至少70%序列同一性的多核苷酸，其中所述序列同一性百分?jǐn)?shù)是基于整個(gè)編碼區(qū)并且通過(guò)BLAST 2. 0在默認(rèn)參數(shù)下測(cè)定，并且其中所述多核苷酸編碼具有NT活性的多肽；和(vi)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性從(i)-(v)中任一者得到的多核苷酸；以及(b)從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述NT在所述轉(zhuǎn)基因植物中以足以保持或增加在所述轉(zhuǎn)基因植物中的產(chǎn)量的水平表達(dá)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中產(chǎn)量增加包括根生長(zhǎng)增強(qiáng)、種子大小增加、苗生物量增加、種子重量增加、所述植物具有胚大小增加的種子、葉大小增加、籽苗活力增加、穗絲露出增強(qiáng)、穗大小增加或葉綠素含量增加。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所述植物在受限氮肥力下生長(zhǎng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物的氮利用效率增加。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中與所述植物內(nèi)源性的NT多肽的活性相比，所述NT多核苷酸所編碼的NT多肽的NT活性增加。
15.根據(jù)權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述NT多核苷酸的表達(dá)由根偏好啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述根偏好啟動(dòng)子選自微管蛋白啟動(dòng)子 (pTUB)、玉蜀黍泛素啟動(dòng)子(ZM UBI)、玉蜀黍根金屬硫蛋白啟動(dòng)子(ZM-RM2)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白.2啟動(dòng)子(LTP2)、香蕉條紋病毒啟動(dòng)子截短型啟動(dòng)子(BSV(TR))、玉蜀黍NAS2啟動(dòng)子 (ZM-NAS2)和香蕉條紋病毒啟動(dòng)子全長(zhǎng)型啟動(dòng)子(BAV(FL))。
17.根據(jù)權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所述NT多核苷酸的所述多核苷酸被組成型表達(dá)。
18.根據(jù)權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所述NT多核苷酸的所述多核苷酸被誘導(dǎo)型表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所述NT多核苷酸的所述多核苷酸以細(xì)胞特異性、組織特異性或器官特異性的方式表達(dá)。
20.根據(jù)權(quán)利要求10-19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述構(gòu)建體還包含第二多核苷酸， 其中所述第二多核苷酸編碼硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、硝酸鹽還原酶或根蛋白質(zhì)，并且其中所述第二多核苷酸可操作地連接至在植物細(xì)胞中有功能的第二啟動(dòng)子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第二多核苷酸選自YNT1、優(yōu)化的或部分優(yōu)化的 YNTl、YNRl、PPNR A551G 禾口 ZM-CKXg。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其中所述第二啟動(dòng)子選自玉蜀黍根金屬硫蛋白啟動(dòng)子(ZM-RM2)、玉蜀黍NAS2啟動(dòng)子、香蕉條紋病毒啟動(dòng)子截短型啟動(dòng)子(BSV(TR))、玉蜀黍磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶啟動(dòng)子(ZM-PEPC)和玉蜀黍泛素啟動(dòng)子(ZM-UBI)。
23.根據(jù)權(quán)利要求10-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
24.根據(jù)權(quán)利要求10-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述植物的產(chǎn)量與對(duì)照植物相比較，其中所述對(duì)照植物不含所述NT多核苷酸。
25.—種調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中的NT蛋白的水平的方法，所述方法包括(a)用可操作地連接至驅(qū)動(dòng)在植物中的表達(dá)的啟動(dòng)子的微生物NT多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述多核苷酸處于有義取向；以及(b)將所述多核苷酸表達(dá)一段時(shí)間，所述時(shí)間足以調(diào)節(jié)所述植物細(xì)胞中的所述微生物 NT蛋白。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述植物細(xì)胞為擬南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、甘蔗或稷植物細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或沈所述的方法，其中所述微生物NT蛋白得到增加。
28.—種調(diào)節(jié)植物中的NT蛋白的水平的方法，所述方法包括(a)用可操作地連接至驅(qū)動(dòng)在植物中的表達(dá)的啟動(dòng)子的微生物NT多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述多核苷酸處于有義取向；以及(b)使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成轉(zhuǎn)化植物，所述轉(zhuǎn)化植物能以足以調(diào)節(jié)所述植物中的NT蛋白的水平的量表達(dá)所述微生物NT多核苷酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中所述植物為擬南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、 卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、甘蔗或稷。
30.根據(jù)權(quán)利要求觀或四所述的方法，其中相比于不含有所述微生物NT多核苷酸的對(duì)照植物，NT蛋白得到增加。
31.一種調(diào)節(jié)植物中的硝酸鹽吸收的方法，所述方法包括(a)將包含可操作地連接至驅(qū)動(dòng)在植物中的表達(dá)的啟動(dòng)子的根據(jù)權(quán)利要求10所述的 NT多核苷酸的重組表達(dá)盒引入植物細(xì)胞中；以及(b)在植物細(xì)胞生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)所述植物；其中所述植物細(xì)胞中的氮吸收得到調(diào)節(jié)。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來(lái)自選自以下的植物玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、稷、花生和可可。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的方法，其中與非轉(zhuǎn)化的植物的硝酸鹽吸收活性相比， 所述硝酸鹽吸收活性得到增加。
34.根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物具有增強(qiáng)的根生長(zhǎng)。
35.根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物具有增加的持綠性。
36.根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物當(dāng)在受限氮肥力下生長(zhǎng)時(shí)具有增加的鮮重。
37.根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物具有增加的根構(gòu)型。
38.根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
39.根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物選自擬南芥、玉蜀黍、大豆、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、稷、花生、甘蔗和可可。
40.一種使植物硝酸鹽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與硝酸鹽吸收解偶聯(lián)的方法，所述方法包括在植物中表達(dá)微生物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述微生物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為真菌、酵母、細(xì)菌、放線菌、藻類或原生動(dòng)物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
42.根據(jù)權(quán)利要求4041所述的方法，其中所述微生物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由根據(jù)權(quán)利要求 10所述的NT多核苷酸編碼。
43.一種分離的或重組的硝酸鹽還原酶(NR)多核苷酸，所述多核苷酸包含選自以下的成員(a)編碼包含SEQID NO :5或9中所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含SEQID NO :4或9中所示序列的多核苷酸；和(c)在嚴(yán)格條件下與選自(a)和(b)的多核苷酸雜交的、長(zhǎng)度包含至少30個(gè)核苷酸的多核苷酸，其中所述條件包括在40-45%甲酰胺、IM NaCl U % SDS中在37°C下雜交和在 0. 5X-1X SSC中在55-60°C下洗滌，并且其中所述多核苷酸編碼具有NR活性并且包含A561G 置換、S561D置換或A561和S561D置換的多肽；和(d)與至少一條選自SEQID NO :4和9的核苷酸序列具有至少70%序列同一性的多核苷酸，其中所述序列同一性百分?jǐn)?shù)是基于整個(gè)編碼區(qū)并通過(guò)BLAST 2. 0在默認(rèn)參數(shù)下測(cè)定，并且其中所述多核苷酸編碼具有NR活性并包含A561G置換、S561D置換或A561和S561D 置換的多肽；和(e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性從(a)-(d)中任一者得到的分離的多核苷酸；(f)與(a)-(e)中任一者的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼能使在較低肥力下產(chǎn)量或氮利用效率提高的NR多肽。
45.一種載體，所述載體包含至少一條根據(jù)權(quán)利要求43或44所述的多核苷酸。
46.一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含至少一條可操作地連接至啟動(dòng)子的根據(jù)權(quán)利要求43 或44所述的多核苷酸。
47.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求46所述的表達(dá)盒。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。
49.一種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求46所述的表達(dá)盒。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自擬南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、甘蔗和稷。
51.一種得自根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的轉(zhuǎn)基因植物的種子，其中所述種子包含所述表達(dá)盒。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的種子，其中所述種子為擬南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、 卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、甘蔗或稷種子。
53.一種分離的多肽，所述多肽選自(a)包含SEQID NO :5或9所示氨基酸序列的多肽；(b)與至少一條選自SEQID NO :5和9的氨基酸序列具有至少70%同一性的多肽，其中所述多肽具有NR活性并且包含A561G置換、S561D置換或A561和S561D置換；(c)由SEQID NO :4或8所示核苷酸序列編碼的多肽；(d)由包含與至少一條選自SEQID NO 4和8的核苷酸序列具有至少70%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子編碼的多肽，其中所述多肽具有NR活性并且包含A561G置換、 S561D置換或A561和S561D置換；(e)由核酸分子所編碼的多肽，所述核酸分子在至少一次在0.2XSSC中在55°C下洗滌 20分鐘后與由至少一條選自SEQ ID NO :4或8的核苷酸序列組成的核酸探針雜交，其中所述多肽具有NR活性并且包含A561G置換、S561D置換或A561和S561D置換；(f)包含至少一條選自SEQID NO 5和9的氨基酸序列的至少200個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中所述多肽具有NR活性并且包含A561G置換、S561D置換或A561和S561D置換。
54.一種重組表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至啟動(dòng)子的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼根據(jù)權(quán)利要求53所述的多肽。
55.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含根據(jù)權(quán)利要求53所述的多肽。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的宿主細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞選自擬南芥、高粱、玉蜀黍、 水稻、小麥、大豆、向日葵、卡諾拉油菜、苜蓿、大麥、甘蔗和稷。
58.一種轉(zhuǎn)化的植物，所述植物從根據(jù)權(quán)利要求56所述的植物細(xì)胞再生。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的植物，其中所述植物為擬南芥、高粱、玉蜀黍、水稻、小麥、 大豆、向日葵、卡諾拉油菜、苜蓿、大麥、甘蔗或稷。
60.一種轉(zhuǎn)化的種子，所述種子來(lái)自根據(jù)權(quán)利要求58或59所述的植物。
61.一種調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中的NR蛋白的水平的方法，所述方法包括(a)用可操作地連接至驅(qū)動(dòng)在植物中的表達(dá)的啟動(dòng)子的根據(jù)權(quán)利要求43所述的NR多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述多核苷酸處于有義取向；以及(b)使所述多核苷酸表達(dá)一段時(shí)間，所述時(shí)間足以調(diào)節(jié)所述植物細(xì)胞中的所述NR蛋白。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述植物為擬南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、 卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、甘蔗或稷。
63.根據(jù)權(quán)利要求61或62所述的方法，其中NR蛋白得到增加。
64.根據(jù)權(quán)利要求61或62所述的方法，其中NR蛋白得到降低。
65.一種調(diào)節(jié)植物中的NR蛋白的水平的方法，所述方法包括(a)用可操作地連接至驅(qū)動(dòng)在植物中的表達(dá)的啟動(dòng)子的根據(jù)權(quán)利要求43所述的NR多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述多核苷酸處于有義取向；以及(b)使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成轉(zhuǎn)化植物，所述轉(zhuǎn)化植物能以足以調(diào)節(jié)所述植物中的NR蛋白的水平的量表達(dá)所述NR變體多核苷酸。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述植物為擬南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、 卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、甘蔗或稷。
67.根據(jù)權(quán)利要求65或66所述的方法，其中相比于不含有編碼所述NR的所述多核苷酸的對(duì)照植物，NR蛋白得到增加。
68.根據(jù)權(quán)利要求65或66所述的方法，其中相比于不含有編碼所述NR的所述多核苷酸的對(duì)照植物，NR蛋白得到降低。
69.一種增加植物中的產(chǎn)量的方法，所述方法包括以下步驟(a)將包含可操作地連接至在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子的根據(jù)權(quán)利要求43所述的 NR多核苷酸的構(gòu)建體引入植物細(xì)胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；(b)從所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中NR蛋白在所述轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞中以足以保持或增加在所述轉(zhuǎn)基因植物中的產(chǎn)量的水平表達(dá)。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中產(chǎn)量增加包括根生長(zhǎng)增強(qiáng)、種子大小增加、種子重量增加、所述植物具有胚大小增加的種子、葉大小增加、籽苗活力增加、穗絲露出增強(qiáng)、穗大小增加或葉綠素含量增加。
71.根據(jù)權(quán)利要求69或70所述的方法，其中所述植物在受限的氮肥力下生長(zhǎng)。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中所述植物的氮利用效率得到增加。
73.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中相比于所述植物內(nèi)源性的NR的活性，所述NR多核苷酸的NR活性得到增加。
74.根據(jù)權(quán)利要求69-73中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述NR多核苷酸的表達(dá)由磷酸烯醇式丙酮酸脫羧酶(PEPC)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。
75.根據(jù)權(quán)利要求69-73中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所述NR的所述多核苷酸被組成型表達(dá)。
76.根據(jù)權(quán)利要求69-73中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所述NR的所述多核苷酸被誘導(dǎo)型表達(dá)。
77.根據(jù)權(quán)利要求69-73中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所述NR的所述多核苷酸以細(xì)胞特異性、組織特異性或器官特異性的方式被表達(dá)。
78.根據(jù)權(quán)利要求69-77中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物為雙子葉植物。
79.根據(jù)權(quán)利要求69-77中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物為單子葉植物。
80.根據(jù)權(quán)利要求69-79中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述植物的產(chǎn)量與對(duì)照植物相比較，其中所述對(duì)照植物不含有編碼所述硝酸鹽還原酶(NR)的所述多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供涉及改變植物中的NT活性、氮利用或吸收的方法和組合物。本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生在低氮或常氮肥力下產(chǎn)量得到保持或增加的植物的方法。本發(fā)明提供分離的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NT)核酸及它們編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供重組表達(dá)盒、宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。用編碼所述NT酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物顯示出改善的性質(zhì)，例如產(chǎn)量增加。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102549149SQ201080037064
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日
發(fā)明者D·F·盧塞爾, 王海音 申請(qǐng)人:先鋒國(guó)際良種公司