專(zhuān)利名稱(chēng)：：快速篩選高表達(dá)目的蛋白的酵母的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及快速篩選高表達(dá)目的蛋白的酵母的方法。
背景技術(shù)：
：甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母(簡(jiǎn)稱(chēng)甲醇酵母)是最近十年逐漸發(fā)展起來(lái)的一種可用于表達(dá)外源基因特別是真核生物基因的理想系統(tǒng)。這類(lèi)酵母分屬假絲酵母(Canda)，漢遜酵母(Hansenula)，畢赤酵母(Pichia)和球擬酵母(Torulopsis)4個(gè)屬，它們都能在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。與釀酒酵母相比，甲醇酵母具有遺傳性質(zhì)穩(wěn)定、表達(dá)量高、分泌效率高和適于大規(guī)模發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)。多形漢遜酵母(Hansenula)是這類(lèi)酵母中的佼佼者，是當(dāng)前國(guó)際上公認(rèn)的最為理想的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一。目前已構(gòu)建了多種多形漢遜酵母營(yíng)養(yǎng)型突變體菌株和相應(yīng)的攜帶這些突變體功能互補(bǔ)的同源或異源基因的載體。同時(shí)，G418、腐草霉素或零霉素抗性的基因也被作為篩選標(biāo)記基因應(yīng)用于多形漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)中。多數(shù)蛋白質(zhì)的表達(dá)存在基因劑量效應(yīng)，外源基因高拷貝重組菌往往能提高外源蛋白的產(chǎn)量，不同篩選標(biāo)記和篩選方法在多拷貝高表達(dá)重組菌的篩選中起到至關(guān)重要的作用。常用的篩選標(biāo)記主要有抗性篩選(例如G418和腐草酸素)和營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選(例如LEU2或URA3)。利用轉(zhuǎn)化子對(duì)G418和腐草酸素的抗性程度篩選重組菌，雖然能夠篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。但是存在操作繁瑣，成本高，基因容易丟失等缺點(diǎn)。利用釀酒酵母的LEU2或URA3基因作為選擇標(biāo)記，盡管能應(yīng)用無(wú)機(jī)培養(yǎng)基在發(fā)酵整個(gè)過(guò)程中給予壓力避免外源基因丟失，但是其拷貝數(shù)相對(duì)較低，存在操作繁瑣(培養(yǎng)基配制)，篩選工作量大，成本高等缺點(diǎn)。而且有時(shí)高拷貝不一定高表達(dá)?？傮w來(lái)說(shuō)，以上常用的篩選方法很難實(shí)現(xiàn)目的蛋白高表達(dá)重組菌的快速篩選。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種快速篩選高表達(dá)目的蛋白的酵母的方法。該方法是基于將酸性α-淀粉酶的編碼基因作為篩選標(biāo)記基因。將酸性α-淀粉酶的編碼基因作為篩選標(biāo)記基因，首先需要構(gòu)建以所述酸性α-淀粉酶的編碼基因作為篩選標(biāo)記的出發(fā)載體，然后將外源基因插入到所述的出發(fā)載體中，獲得以酸性α-淀粉酶的編碼基因作為篩選標(biāo)記的重組表達(dá)載體，將該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，在含有淀粉的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述酸性α-淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生的透明圈，通過(guò)淀粉顯色可以直觀的根據(jù)透明圈半徑大小簡(jiǎn)便快捷初步篩選目的蛋白高表達(dá)陽(yáng)性克隆。以所述酸性α-淀粉酶的編碼基因作為篩選標(biāo)記的出發(fā)載體，包含原核復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒和目的基因表達(dá)盒；所述外源基因表達(dá)盒自上游至下游依次含有啟動(dòng)子、目的基因和終止子；所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒自上游至下游依次含有啟動(dòng)子、酸性α-淀粉酶的編碼基因和終止子。其中，所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒還可含有兩個(gè)IoxP序列；所述酸性α-淀粉酶的編碼基因位于所述兩個(gè)IoxP序列之間，在Cre重組酶的作用下可有效去除酸性α_淀粉酶的編碼基因。所述載體還可含有血紅蛋白基因表達(dá)盒，所述血紅蛋白基因表達(dá)盒自上游至下游依次含有FMD啟動(dòng)子、血紅蛋白基因序列和終止子，所述FMD啟動(dòng)子的核苷酸序列可為序列表中的序列1，所述血紅蛋白基因的核苷酸序列可為序列表中的序列2。血紅蛋白基因表達(dá)盒可以表達(dá)血紅蛋白，在貧氧情況下，含有血紅蛋白的重組菌可以高效表達(dá)目的蛋白，更利于工業(yè)生產(chǎn)。所述載體還含有抗性基因表達(dá)盒，所述抗性基因表達(dá)盒自上游至下游依次含有IoxP序列、抗性基因和IoxP序列。所述抗性基因?yàn)閆eocin抗性基因。所述載體的結(jié)構(gòu)如圖3所示。本發(fā)明所提供的快速篩選高表達(dá)目的蛋白的酵母的方法，包括如下步驟將上述的載體導(dǎo)入酵母菌中獲得重組菌，所述重組菌在含有可溶性淀粉的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，單克隆周?chē)a(chǎn)生直徑為0.3-1.Ocm透明圈的重組菌為高表達(dá)目的蛋白的酵母。其中，所述方法中，還包括將Cre重組酶基因?qū)胨鲋亟M菌中。將Cre重組酶基因?qū)胫亟M菌中可用本領(lǐng)域已知的多種方法，如將pHFMD-ZL2RlA-Cre(+)載體導(dǎo)入重組菌中，pHFMD-ZL2RlA_Cre(+)的結(jié)構(gòu)如圖5所示，Cre重組酶基因?qū)胫亟M菌表達(dá)Cre重組酶，Cre重組酶可將抗性基因和酸性α-淀粉酶的編碼基因去除，得到的重組菌不含有篩選標(biāo)記基因，使重組菌成為食品級(jí)產(chǎn)品。本發(fā)明的快速篩選高表達(dá)目的蛋白的酵母的方法，以酸性α-淀粉酶的編碼基因作為篩選標(biāo)記可以宏觀上篩選目的蛋白高表達(dá)轉(zhuǎn)化子，并且篩選方法快速便捷，可在目的蛋白生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。圖1為pHGAPZA載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為pHAPZA-amy載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為pHFMDZ-Hb-HBVAg-Thyα^amy載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為碘蒸汽熏染結(jié)果。圖5為PHFMD-ZL2RlA-Cre(+)載體結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用試劑均可從商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所述百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、酸性α-淀粉酶基因作為篩選標(biāo)記1.構(gòu)建以酸性α-淀粉酶基因作為篩選標(biāo)記的表達(dá)載體根據(jù)曲霉酸性α-淀粉酶基因，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，模板為黑曲霉AspergillusnigerAS3.795(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)所用引物的核苷酸序列如下Sl:5，-ATAAGAATGCGGCCGCGGATGAGATTATCGACTTCGAG-3’，S2:5，-GCTCTAGAACAGTAACCGACCACTCC-3’。PCR擴(kuò)增體系為50ul；擴(kuò)增程序?yàn)?4°C5min；94°Clmin,56°C45sec，72°C，2min，30個(gè)循環(huán)；再72°C延伸IOmin0PCR擴(kuò)增得到5’端加上了NotI酶識(shí)別位點(diǎn)，3’端加上XbaI酶識(shí)別位點(diǎn)的黑曲霉酸性α-淀粉酶基因片段。對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列4，編碼序列表中序列5所示的蛋白。將該黑曲霉酸性α-淀粉酶基因片段用NotI和XbaI酶切后，插入到pHGAPZA(圖1)(HouhuiSong,YongLi,WeihuanFang,YunfengGeng,XuWang,Minffang,BingshengQiu,DevelopmentofasetofexpressionvectorsinHansenulapolymorpha,BiotechnologyLetters,Volume25,Issue23,Dec2003,Pages1999-2006)(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)的NotI和XbaI酶識(shí)別位點(diǎn)之間，獲得載體pHAPZA-amy(圖2)。將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體pHAPZA-amy，用BgLII/BamHI雙酶切，回收含有黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的表達(dá)框(含有GAP啟動(dòng)子、黑曲霉酸性α-淀粉酶基因連接片段和終止子)，然后用BgLII酶切pHM0XZR25S-HBVAg-Thyαi后并脫磷酸化，根據(jù)BgLII與BamHI是同尾酶的原理，將回收的片段插入到pHM0XZR25S-HBVAg-Thyα工中得到表達(dá)載體pHM0XZR25S-HBVAg-Thyα「amy。pHM0XZR25S-HBVAg-Thyα！載體的構(gòu)建方法見(jiàn)專(zhuān)利ZL200610007869.4。BgLII/BamHI酶切pHFMDZR25S_Hb后回收含有血紅蛋白的表達(dá)框(該表達(dá)框含有FMD啟動(dòng)子、血紅蛋白基因序列和終止子)；pHFMDZR25S-Hb載體的構(gòu)建方法見(jiàn)專(zhuān)利ZL200610089305.X。BglII酶切pHFMDZ-HBVAg-Thyα「amy載體脫磷酸化后與含有血紅蛋白的表達(dá)框連接，得到重組載體pHFMDZR-Hb-HBVAg-Thyαramy(圖3)，重組載體pHFMDZR-Hb-HBVAg-Thyα「amy是以黑曲霉酸性α-淀粉酶基因作為篩選標(biāo)記的表達(dá)載體。2.pHFMDZR-Hb-HBVAg-Thyα^amy在多形漢遜酵母菌中的表達(dá)多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)AS2.2412(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)單克隆接種于5mlYPD液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，取2ml菌液加入200ml預(yù)溫至370C的YPD中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl=1.2，室溫6000rpm離心5min，棄上清，用500mlTED(IOOmmol/LTris-HCl；50mMEDTA；25mmol/LDTT，pH=8.0)懸浮細(xì)胞。在37°C搖床，200rpm搖15min，4°C離心6000rpm，5min，棄上清，用200ml預(yù)冷的270mmol/L的蔗糖輕輕懸浮細(xì)胞，4°C離心6000rpm，5min,棄上清，用IOOml預(yù)冷的270mmol/L的蔗糖輕輕懸浮細(xì)胞，4°C離心6000rpm，5min，棄上清，用Iml預(yù)冷的270mmol/L的蔗糖輕輕懸浮細(xì)胞，分裝成IOOul/管，在IOOul的感受態(tài)細(xì)胞中加入IOOng質(zhì)粒DNA(pHFMDZR-Hb-HBVAg-Thyαramy)，輕輕混勻后加入2mm孔徑的電擊杯中，電擊參數(shù)50uF，100Q，l.5KV,電擊后立即加Λ940ul的YPDTM(lg/100ml酵母提取物；lg/100ml蛋白胨；2g/100ml葡萄糖；lmmol/LMgCL2)，吸取至5ml的小管中，37°C搖床，200rpm培養(yǎng)lh，取IOOul涂于含有Zeocin抗生素(終濃度100ug/ml)的YPDS(lg/100ml酵母粉，2g/100ml葡萄糖，2g/100ml蛋白胨，lg/100ml可溶性淀粉)平板，37°C培養(yǎng)2-3天，在平板上出現(xiàn)大、中、小三種不同類(lèi)型的菌落。用碘蒸汽熏染。以轉(zhuǎn)pHM0XZR25S-HBVAg-Thya載體的多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)AS2.2412作為對(duì)照。碘蒸汽熏染結(jié)果見(jiàn)圖4，轉(zhuǎn)pHFMDZR-Hb-HBVAg-Thyα「amy載體的平板上產(chǎn)生大小不相同的透明水解圈，對(duì)照平板上未出現(xiàn)透明水解圈。用下述兩對(duì)引物對(duì)產(chǎn)生透明水解圈的菌落進(jìn)行PCR鑒定，引物為HBsAg-up-EcoRI和TA4，HBsAg-up-EcoRI和TA4的核苷酸序列如下HBsAg-up-EcoRI:5，CGGAATTCATGGAGAACATCACATCAGG3，；TA4:5，cgggatccgcggccgcgttctcagcctcctcaacaacctccttcttc3，。反應(yīng)程序?yàn)?4°C5min;94°Clmin,56°C45sec，72°C，lmin，30個(gè)循環(huán)；再72°C延伸IOmin0以序列3所示的DNA片段為探針進(jìn)行Southern雜交。PCR和Southern雜交鑒定結(jié)果表明，透明圈較大的菌落都是含有乙肝表面抗原融合蛋白基因的拷貝數(shù)高的克隆。提取透明圈大的菌落和小的菌落酵母的基因組DNA利用PCR方法檢測(cè)黑曲霉酸性α-淀粉酶基因是否插入，引物為Sl和S2。PCR的反應(yīng)程序?yàn)?4°C5min；94°Clmin,56°C45sec，72°C，lmin，30個(gè)循環(huán)；再72°C延伸IOmin0PCR擴(kuò)增得到1.6kb的產(chǎn)物為黑曲霉酸性α-淀粉酶基因插入到酵母基因組中。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，產(chǎn)生透明水解圈的菌落的基因組DNA中都能擴(kuò)增出1.6kb的片段。分別挑取透明圈大(直徑為0.3-0.5cm)的單克隆1個(gè)和透明圈小(直徑為0.1-0.2cm)的單克隆2個(gè)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，方法如下將單克隆接入YPD液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12h后，按照5%比例(體積百分含量比)接種到新鮮的YPD發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時(shí)，加入甲醇，使其終濃度為0.5%(體積百分含量比)，再培養(yǎng)48小時(shí)后，收獲發(fā)酵液，4°C12000rpm離心3min收集上清，得到HBVAg-Thyα融合蛋白，對(duì)HBVAg-Thyα融合蛋白進(jìn)行ELISA分析和乙肝表面抗原免疫活性的檢測(cè)。ELISA分析所用的抗體為乙肝表面抗原檢測(cè)試劑盒中的酶標(biāo)結(jié)合液，用乙肝表面試劑盒(乙肝表面抗原實(shí)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于華美生物工程公司)進(jìn)行乙肝表面抗原免疫活性的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。表2:pHFMDZR-Hb-HBVAg-Thyαramy發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，透明圈的大小與乙肝表面抗原基因的表達(dá)量的高低相關(guān)聯(lián)。形成透明圈比較大的轉(zhuǎn)化子目的蛋白的表達(dá)量較高。黑曲霉酸性α-淀粉酶基因可以作為宏觀上篩選目的蛋白高表達(dá)轉(zhuǎn)化子的快速便捷的方法。三、α-淀粉酶基因和Zeocin抗性基因的去除步驟一獲得的512bp的HARS，用SalI酶切后連接到同樣酶切的載體pHFMDZ_A上獲得質(zhì)粒pHFMDZ-RA。pHFMDZ-AWI^JMilfMB；KHouhuiSong,YongLi,WeihuanFang,YunfengGeng,XuWang,MinWang,BingshengQiu,DevelopmentofasetofexpressionvectorsinHansenulapolymorpha,BiotechnologyLetters,Volume25,Issue23,Dec2003,1999-2006。其次，用EcoRI和XhoI分別雙酶切pSH47(Giildener，U.，Heck,S.，F(xiàn)iedler,Τ.，Beinhauer,J.,andHegemann,J.H.Anewefficientgenedisruptioncassetteforrepeateduseinbuddingyeast.NucleicAcidsResearch,1996,24:2519_2524.)(購(gòu)自德國(guó)EUR0SCARF)和pHFMDZ-RA質(zhì)粒，回收Cre重組酶基因片段和pHFMDZ-RA載體片段后進(jìn)行連接，獲得載體pHFMD-ZRIA-Cre。以pHIPX4質(zhì)粒(KlassNicoFaber,PeterHaima,ChristineGietl，etal.ThemethylotrophicyeastHansenulapolymorphacontainsaninducibleimportpathwayforperoxisomalmatrixproteinswithanN-terminaltargetingsignal(PTS2proteins).CellBiology,1994,9112985-12989.)(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)(EukaryoticMirobiology,GBB,UniversityofGroningen,J.A.K.W.Kiel^gEHg)為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物PCR獲得LEU2基因片段，引物的核苷酸序列如下LEU2-up-BamHICGGGATCCagcttcgaggagaacttctag；LEU2-down-BamHI:CGGGATCCcgctatttcagcttttcatc。PCR產(chǎn)物用BamHI進(jìn)行酶切并回收，然后與BglII單酶切并去磷酸化的pHFMD-ZRIA-Cre載體相連接，將LEU2基因片段正向插入載體命名為pHFMD-ZL2RlA-Cre(+)，pHFMD-ZL2RlA-Cre(+)載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖5所示。按照步驟二的轉(zhuǎn)化方法將PHFMD-ZL2R1A-Cre(+)轉(zhuǎn)入步驟二的高表達(dá)乙肝表面抗原的多形漢遜酵母中，轉(zhuǎn)化后的菌涂布于SC篩選平皿W.67g/100mlYNB,2g/100ml葡萄糖，相應(yīng)的嗜好氨基酸混合物(2.0g/L硫酸腺嘌呤，2.0g/LL-精氨酸鹽酸鹽，2.Og/LL-組氨酸鹽酸鹽，2.0g/L異亮氨酸，2.0g/LL-賴(lài)氨酸鹽酸鹽，2.Og/L蛋氨酸，3.Og/L苯丙氨酸，6.Og/LL-高絲氨酸，3.Og/L色氨酸，2.Og/L酪氨酸，1.2g/L尿嘧啶，9.Og/L纈氨酸)]上，37°C培養(yǎng)3天，得到單克隆。挑取SC平皿上的克隆接種YPD培養(yǎng)基37°C過(guò)夜培養(yǎng)，24h后加入甲醇誘導(dǎo)，加入量為10μ1甲醇/mL培養(yǎng)基，誘導(dǎo)24h后，菌體涂布YPD和YPD+Zeocin(100yg/mL)培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)3天，比較兩塊平皿的菌落數(shù)可以看出抗性的丟失程度，選擇丟失率較高的YPD平皿上部分單菌落分別點(diǎn)種到Y(jié)PD和YPD+Zeocin(100yg/mL)平皿上面進(jìn)行培養(yǎng)。引物Sl和S2進(jìn)行PCR驗(yàn)證α-淀粉酶基因的丟失，最終得到不含篩選標(biāo)記的乙肝表面抗原融合蛋白基因高表達(dá)陽(yáng)性克隆。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所<120>快速篩選高表達(dá)目的蛋白的酵母的方法<130>CGGNARW92084<160>5<210>1<211>643<212>DNA<213>人工序列〈220〉〈230〉<400>1aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaattt60agaggcggcgaatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgg120gcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaaIoOtataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggc240gcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctg300acagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcgacggga360aaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaatag420gctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaatagcaagttccggggtgtctcactgg480tgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacac540tcgactaccatccgggtctctcagaggggggaatggcactataaataccgcctccttgcg600ctctctgccttcatcaatcaaatcatgaaggttgtactagttc643<210>2<211>466<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈230〉<400>2ccatggaccaacaaactattaacattattaaggctactgttccagttttgaaggagcacg60gtgttactattactactactttctacaagaacttgttcgctaagcacccagaggttagac120cattgttcgacatgggtagacaagagtctttggagcaaccaaaggctttggctatgactg180ttttggctgctgctcaaaacattgagaacttgccagctattttgccagctgttaagaaga240ttgctgttaagcactgtcaagctggtgttgctgctgctcactacccaattgttggtcaag300agttgttgggtgctattaaggaggttttgggtgacgctgctactgacgacattttggacg360cttggggtaaggcttacggtgttattgctgacgttttcattcaagttgaggctgacttgt420acgctcaagctgttgagcaccaccaccaccaccactgagcggccgc466<210>3<211>783<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈230〉〈400>3atggagaacatcacatcaggattcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttc60ttgttgacaagaatcctcacaataccgcagagtctagactcgtggtggacttctctcaat120tttctagggggatcacccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcac180tcaccaacctcctgtcctccaatttgtcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgtttt240atcatattcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttattggttcttctggattat300caaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcaacaacaaccagtacgggacca360tgcaaaacctgcacgactcctgctcaaggcaactctatgtttccctcatgttgctgtaca420aaacctacggatggaaattgcacctgtattcccatcccatcgtcctgggctttcgcaaaa480tacctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgtt540cagtggttcgtagggctttcccccactgtttggctttcagctatatggatgatgtggtat600tgggggccaagtctgtacagcatcgtgagtccctttataccgctgttaccaattttcttt660tgtctctgggtatacattggcggcggcggctctaagagatctgacgctgctgttgacact720tcttctgagattactactaaggacttgaaggagaagaaggaggttgttgaggaggctgag780aac783<210>4<211>1518<212>DNA〈213〉黑曲霉(Aspergillusniger)<400>4atgagattatcgacttcgagtctcttcctttccgtgtctctgctggggaagctggccctc60gggctgtcggctgcagaatggcgcactcagtcgatttacttcctattgacggatcggttc120ggtaggacggacaattcgacgacagctacatgcgatacgggtgaccaaatctattgtggt180ggcagttggcaaggaatcatcaaccatctggattatatccagggcatgggattcacggcc240atctggatctcgcctatcactgaacagctgccccaggatactgctgatggtgaagcttac300catggatattggcagcagaagatatacgacgtgaactccaacttcggcactgcagatgac360ctcaagtccctctcagatgcgcttcatgcccgcggaatgtacctcatggtggacgtcgtc420cctaaccacatgggctacgccggcaacggcaacgatgtagactacagcgtcttcgacccc480ttcgattcctcctcctacttccacccatactgcctgatcacagattgggacaacttgacc540atggtccaagattgttgggagggtgacaccatcgtatctctgccagacctgaaactgccgtgagaacaatctggtatgactgggtagccgacctggtatccaattattca660gtcgacggactccgcatcgacagtgtcctcgaagtcgaaccagacttcttcccgggctac720caggaagcagcaggtgtctactgcgtcggcgaagtcgacaacggcaaccctgccctcgac780tgcccataccagaaggtcctggacggcgtcctcaactatccgatctactggcaactcctc840tacgccttcgaatcctccagcggcagcatcagcaacctctacaacatgatcaaatccgtc900gcaagcgactgctccgatccgacactactcggcaacttcatcgaaaaccacgacaatccc960cgtttcgcctcctacacctccgactactcgcaagccaaaaacgtcctcagctacatcttc1020ctctccgacggcatccccatcgtctacgccggcgaagaacagcactactccggcggcaag1080gtgccctacaaccgcgaagcgacctggctttcaggctacgacacctccgcagagctgtac1140acctggatagccaccacgaacgcgatccgcaaactagccatctcagctgactcggcctac1200attacctacgcgaatgatgcattctacactgacagcaacaccatcgcaatgcgcaaaggc1260acctcagggagccaagtcatcaccgtcctctccaacaaaggctcctcaggaagcagctac1320accctgaccctcagcggaagcggctacacatccggcacgaagctgatcgaagcgtacaca1380tgcacatccgtgaccgtggactcgagcggcgatattcccgtgccgatggcgtcgggatta1440ccgagagttcttctgcccgcgtccgtcgtcgatagctcttcgctctgtggcgggagcgga1500agattatacgtcgagtaa1518<210>5<211>505<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillusniger)<400>5MetArgLeuSerThrSerSerLeuPheLeuSerValSerLeuLeuGly151015LysLeuAlaLeuGlyLeuSerAlaAlaGluTrpArgThrGlnSerlie202530TyrPheLeuLeuThrAspArgPheGlyArgThrAspAsnSerThrThr354045AlaThrCysAspThrGlyAspGlnlieTyrCysGlyGlySerTrpGln505560GlylielieAsnHisLeuAspTyrlieGlnGlyMetGlyPheThrAla65707580lieTrplieSerProlieThrGluGlnLeuProGlnAspThrAlaAsp859095GlyGluAlaTyrHisGlyTyrTrpGlnGlnLyslieTyrAspValAsn100105110SerAsnPheGlyThrAlaAspAspLeuLysSerLeuSerAspAlaLeu115120125HisAlaArgGlyMetTyrLeuMetValAspValValProAsnHisMet130135140GlyTyrAlaGlyAsnGlyAsnAspValAspTyrSerValPheAspPro145150155160PheAspSerSerSerTyrPheHisProTyrCysLeulieThrAspTrp165170175AspAsnLeuThrMetValGlnAspCysTrpGluGlyAspThrlieVal180185190SerLeuProAspLeuAsnThrThrGluThrAlaValArgThrlieTrp195200205TyrAspTrpValAlaAspLeuValSerAsnTyrSerValAspGlyLeu210215220ArglieAspSerValLeuGluValGluProAspPhePheProGlyTyr225230235240GlnGluAlaAlaGlyValTyrCysValGlyGluValAspAsnGlyAsn245250255ProAlaLeuAspCysProTyrGlnLysValLeuAspGlyValLeuAsn260265270TyrProlieTyrTrpGlnLeuLeuTyrAlaPheGluSerSerSerGly275280285SerlieSerAsnLeuTyrAsnMetlieLysSerValAlaSerAspCys290295300SerAspProThrLeuLeuGlyAsnPhelieGluAsnHisAspAsnPro305310315320ArgPheAlaSerTyrThrSerAspTyrSerGlnAlaLysAsnValLeu325330335SerTyrliePheLeuSerAspGlylieProlieValTyrAlaGlyGlu340345350GluGlnHisTyrSerGlyGlyLysValProTyrAsnArgGluAlaThr355360365TrpLeuSerGlyTyrAspThrSerAlaGluLeuTyrThrTrplieAla370375380ThrThrAsnAlalieArgLysLeuAlalieSerAlaAspSerAlaTyr385390395400lieThrTyrAlaAsnAspAlaPheTyrThrAspSerAsnThrlieAla405410415MetArgLysGlyThrSerGlySerGlnVallieThrValLeuSerAsn420425430LysGlySerSerGlySerSerTyrThrLeuThrLeuSerGlySerGly435440445TyrThrSerGlyThrLysLeulieGluAlaTyrThrCysThrSerVal450455460ThrValAspSerSerGlyAsplieProValProMetAlaSerGlyLeu465470475480ProArgValLeuLeuProAlaSerValValAspSerSerSerLeuCys485490495GlyGlySerGlyArgLeuTyrValGlu50050權(quán)利要求酸性α-淀粉酶的編碼基因作為篩選標(biāo)記基因的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述酸性α-淀粉酶是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列5的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有α“淀粉酶活性由a)衍生的蛋白質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述酸性α-淀粉酶的編碼基因是如下1)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列4；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA片段雜交且編碼具有α-淀粉酶活性的蛋白的DNA分子；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性，且編碼具有α-淀粉酶活性的蛋白的DNA分子。4.一種載體，包含原核復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒和目的基因表達(dá)盒；所述目的基因表達(dá)盒自上游至下游依次含有啟動(dòng)子、目的基因和終止子；所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒自上游至下游依次含有啟動(dòng)子、酸性α-淀粉酶的編碼基因和終止子。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒還含有兩個(gè)IoxP序列；所述酸性α-淀粉酶的編碼基因位于所述兩個(gè)IoxP序列之間。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于所述載體還含有血紅蛋白基因表達(dá)盒，所述血紅蛋白基因表達(dá)盒自上游至下游依次含有FMD啟動(dòng)子、血紅蛋白基因和終止子。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于所述載體還含有抗性基因表達(dá)盒，所述抗性基因表達(dá)盒自上游至下游依次含有IoxP序列、抗性基因和IoxP序列。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于所述載體的結(jié)構(gòu)如圖3所示。9.篩選高表達(dá)目的蛋白的酵母的方法，包括如下步驟是將權(quán)利要求4到8中任一所述的載體導(dǎo)入酵母菌中獲得重組菌，所述重組菌在含有可溶性淀粉的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，單克隆周?chē)a(chǎn)生直徑為0.3-1.Ocm透明圈的重組菌為高表達(dá)目的蛋白的酵母。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述方法中，還包括將Cre重組酶基因?qū)胨鲋亟M菌中的步驟。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種快速篩選高表達(dá)目的蛋白的酵母的方法。該快速篩選高表達(dá)目的蛋白的酵母的方法基于以酸性α-淀粉酶的編碼基因作為篩選標(biāo)記基因。本發(fā)明還公開(kāi)了以所述酸性α-淀粉酶的編碼基因作為篩選標(biāo)記基因的載體。本發(fā)明的快速篩選高表達(dá)目的蛋白的酵母的方法，是將所述的載體導(dǎo)入酵母菌中獲得重組菌，所述重組菌在含有可溶性淀粉的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，單克隆周?chē)a(chǎn)生直徑為0.3-0.5cm透明圈的重組菌為高表達(dá)目的蛋白的酵母。本發(fā)明的方法可以宏觀上篩選目的蛋白高表達(dá)轉(zhuǎn)化子，并且篩選方法快速便捷，可在目的蛋白生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N15/64GK101805745SQ20091007775公開(kāi)日2010年8月18日申請(qǐng)日期2009年2月16日優(yōu)先權(quán)日2009年2月16日發(fā)明者宋浩雷,牛振東,邱并生申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所