專利名稱：監(jiān)視亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的dna轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在DNA甲基化分析期間監(jiān)視亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化的發(fā)展的方法。所述方法基于酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)與至少一種標(biāo)記的DNA報告分子的反應(yīng)， 所述報告分子在其序列中包含至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基。在尿苷殘基中未甲基化的胞嘧啶殘基的亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化之后，UNG從DNA骨架中除去尿嘧啶堿基，因而使得它對熱誘導(dǎo)的水解切割敏感。最后，檢測在這種斷裂過程期間從DNA報告分子上釋放的標(biāo)記物。尿嘧啶-DNA糖基化酶和尿嘧啶-N-糖基化酶有時縮寫為UNG或UDG，它們應(yīng)被理解為相似的或同義的。在任何情況下，在本申請中使用該術(shù)語來指明使得DNA骨架對熱誘導(dǎo)的水解切割敏感的酶。
背景技術(shù)：
DNA甲基化在各種生物體包括原核生物和真核生物的基因組中存在。在原核生物中， DNA甲基化在胞嘧啶和腺嘌呤堿基上發(fā)生，并涵蓋了宿主限制系統(tǒng)的一部分。然而在多細(xì)胞真核生物中，甲基化看起來限于胞嘧啶堿基，并且與被抑制的染色質(zhì)狀態(tài)和基因表達(dá)抑制相關(guān)(例如，在 Wilson, G. G. and Murray, N. Ε. (199lM/ / w. Rev. Genet. 25，585 - 627 中綜述)。在哺乳動物細(xì)胞中，DNA甲基化主要在CpG 二核苷酸處發(fā)生，其不均勻地分布，并且在基因組中減量出現(xiàn)(underr印resented)。在許多啟動子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了通常未甲基化的 CpGs 的簇(稱為 CpG 島)(例如，在 Li, E. (2002)#ai. Rev. Genet. 3，662-673 中綜述)。已經(jīng)在幾種人類癌癥中證明了引起異常的基因沉默的DNA甲基化的改變(例如，在 Robertson, K. D. and ffolffe, Α. P. (2000) JVat. Rev. Genet. 1，11-19 中綜述)。證明了啟動子的超甲基化是引起腫瘤阻抑基因滅活的常見的機(jī)制(Bird，A. P. (2002)^5 Dev. 16，6-21)。存在各種方法用于實(shí)驗(yàn)上測定個體基因中的差異性甲基化(例如，在Rein，Τ. et al. QWmNucleic Acids Res. 26，2255_2洸4中綜述)。這些技術(shù)尤其地包括亞硫酸氫鹽測序、甲基化特異性PCR (MSP)、Methylight和焦磷酸測序。進(jìn)行上述技術(shù)的一個共同的先決條件是要分析的DNA的亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 (也稱為亞硫酸氫鹽修飾)。特別地，未甲基化的胞嘧啶殘基被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜍諝埢陌奏さ侥蜞奏さ膩喠蛩釟潲}介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的三步驟反應(yīng)方案在

圖1中示意地顯示。簡言之，在微酸性條件下胞嘧啶被磺化為胞嘧啶亞硫酸氫鹽。自發(fā)地發(fā)生水解脫氨成為尿嘧啶-亞硫酸氫鹽。后者然后在堿性條件下脫磺酸成尿嘧啶。由于在亞硫酸氫鹽處理期間甲基化的胞嘧啶殘基不被轉(zhuǎn)化為尿苷殘基，未甲基化的CpG島中的DNA序列被有效地改變(C到U)，而甲基化的DNA保持了它的原始序列。然而，對于基于DNA甲基化狀態(tài)分析的有效的診斷結(jié)果，希望的是DNA以最大效率轉(zhuǎn)化，也就是說理想地，給定DNA序列中存在的100%的未甲基化的胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿苷殘基。
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亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化一般使用商業(yè)上可獲得的反應(yīng)試劑盒進(jìn)行。在這些測試系統(tǒng)中，DNA通常在相對高的反應(yīng)溫度(例如，60°C )下孵育長時間(在很多情況下，過夜)。 在孵育的這個時間期間，重復(fù)的加熱步驟到95°C是變性DNA所必需的。在很多情況下，通過簡單地使得反應(yīng)運(yùn)行看來適當(dāng)?shù)谋M量多次，孵育時間應(yīng)當(dāng)達(dá)到最高的DNA轉(zhuǎn)化效率，和/或孵育時間是可容忍的，同時維持一定水平的DNA質(zhì)量。另一方面，還明顯的是，延長的加熱時期最后引起DNA的降解，因而引起DNA產(chǎn)量和完整性的降低。這對于任何下游的分析可能是致命的，例如，如果樣品中的DNA濃度低的話。然而，要分析的不同的樣品DNA或不同的應(yīng)用可能需要獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，以實(shí)現(xiàn)最大效率。例如，與純化的樣品DNA相比，使用具有非純化DNA的粗溶胞產(chǎn)物具有更高的不確定性。在粗溶胞產(chǎn)物中，存在著可能潛在地與亞硫酸氫鹽相互作用的其他物質(zhì)，因而干擾 DNA轉(zhuǎn)化反應(yīng)。鑒于上述考慮，“一個孵育時間滿足所有情況”的一般方法顯然是不合理的，因?yàn)楫?dāng)分析易于轉(zhuǎn)化的DNA樣品(例如，純化的DNA分子)時，這將由于延長的熱暴露而引起不必要的DNA質(zhì)量損失。反之亦然，即使有的話，復(fù)雜樣品(例如，粗溶胞產(chǎn)物、體液、冷凍的活檢組織)中的DNA可能僅相當(dāng)小程度地被轉(zhuǎn)化。當(dāng)前，還沒有主動地監(jiān)視亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化的進(jìn)行和發(fā)展的方法。然而， 提供這樣的方法將幫助精確地確定每個單獨(dú)反應(yīng)的終點(diǎn)(即，100%完成)，因而容許從一般化的方案變?yōu)闃悠诽禺愋缘姆磻?yīng)條件?？梢员苊獠槐匾暮瓦^度的加熱孵育時間，從而改
善DNA質(zhì)量。因而，對于克服上述限制、容許精確監(jiān)視亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化的方法存在著持續(xù)的需求。特別地，需要相應(yīng)的方法，其允許為分析的每個樣品DNA設(shè)置個體化的反應(yīng)條件，從而改善差異化DNA甲基化分析的結(jié)果。發(fā)明概述
本發(fā)明的一個目的是提供用于在DNA甲基化分析期間監(jiān)視亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化的發(fā)展的新的方法。更具體地，一個目的是提供容許轉(zhuǎn)化終點(diǎn)的精確測定的方法。此外，一個目的是提供一種方法，其允許反應(yīng)條件的精確控制以及匹配，所述反應(yīng)條件應(yīng)用于所采用的樣品DNA的特定要求，從而引起獲得的DNA質(zhì)量的總體改善。這些目的以及根據(jù)確保性描述將變得顯而易見的其他目的通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方式由從屬權(quán)利要求的主題來限定。在一個方面中，本發(fā)明涉及在DNA甲基化分析期間監(jiān)視亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化的方法，包括
(a)提供要分析的樣品DNA和至少一種DNA報告分子，其中所述至少一種DNA報告分子包含
(i)在它的核苷酸序列中至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基；以及
(ii)至少一種標(biāo)記物(label)；
以及其中所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子在相互流體連接的、空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室中提供；
(b)向所述空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室添加亞硫酸氫鹽，從而介導(dǎo)所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶殘基向尿苷殘基的轉(zhuǎn)化；
(c)向所述至少一種DNA報告分子添加尿嘧啶-DNA-糖基化酶，從而介導(dǎo)步驟(b)中獲得的尿嘧啶堿基從DNA骨架上脫除；
(d)通過熱處理來斷裂步驟(c)中獲得的DNA;以及
(e)檢測在步驟(d)期間從所述至少一種合成的DNA報告分子釋放的至少一種標(biāo)記物。在一個實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括
(f)將(e)中獲得的結(jié)果與參考值比較。在另一個實(shí)施方式中，檢測步驟在給定的時期內(nèi)重復(fù)至少一次。優(yōu)選地，步驟(e)中獲得的結(jié)果用于控制根據(jù)步驟(b)的反應(yīng)的發(fā)展。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述至少一種DNA報告分子是合成的寡核苷酸。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述至少一種合成的DNA報告分子被固定在支持物上。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述尿嘧啶-DNA-糖基化酶是熱穩(wěn)定的。在一個具體的實(shí)施方式中，步驟(c)、(d)和(e)在提供所述至少一種DNA報告分子所采用的同一反應(yīng)區(qū)室中進(jìn)行。在可選擇的實(shí)施方式中，步驟(c)、(d)和(e)中的任一個或多個在至少一個進(jìn)一步的空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室中進(jìn)行，所述反應(yīng)區(qū)室與提供所述至少一種DNA報告分子所采用的反應(yīng)區(qū)室是流體連接的。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方式中，至少任何一個，并且優(yōu)選地，所有反應(yīng)區(qū)室裝備有一個或更多個溫度控制單元，用于控制和調(diào)節(jié)反應(yīng)區(qū)室內(nèi)的溫度。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，反應(yīng)區(qū)室之間的空間分隔通過半透膜、優(yōu)選地大小排阻膜或微量滲析膜的方式實(shí)現(xiàn)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，相互流體連接的至少兩個空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室被整合到傳感設(shè)備、優(yōu)選地連續(xù)傳感設(shè)備中。在另一個方面，本發(fā)明涉及在此限定的方法用于分析樣品DNA的甲基化狀態(tài)的用途。優(yōu)選地，進(jìn)行DNA甲基化狀態(tài)的分析用于診斷癌癥。圖簡述
圖1示意地描繪了從胞嘧啶(左側(cè))到尿嘧啶(右側(cè))的亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的一般的三步驟反應(yīng)方案。在微酸性條件下胞嘧啶被磺化為胞嘧啶-亞硫酸氫鹽。自發(fā)地發(fā)生水解脫氨成為尿嘧啶-亞硫酸氫鹽。后者然后在堿性條件下脫磺酸成尿嘧啶。圖2示意地描繪了在DNA的延伸中在尿苷殘基上尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的反應(yīng)。如果胞嘧啶被脫氨基成尿嘧啶，尿苷殘基僅可在DNA中存在，引起DNA中的突變。UNG 從DNA的糖-磷酸骨架上除去尿嘧啶堿基。雖然DNA骨架保持完整，產(chǎn)生的無堿基位點(diǎn)對于提高溫度下的水解切割是敏感的。圖3示意地描繪了根據(jù)本發(fā)明的方法的原理。提供的是至少一種標(biāo)記的DNA報告分子，在它的核苷酸序列中包含未甲基化的胞嘧啶殘基，所述胞嘧啶殘基通過添加重硫酸鹽的方式轉(zhuǎn)化為尿苷殘基(1.)。用UNG處理DNA引起尿嘧啶堿基從DNA骨架上脫除(2.)， 因而使得它在這些無堿基位點(diǎn)對熱誘導(dǎo)的斷裂敏感(3.)。任選地分離從至少一種DNA報告分子上釋放的標(biāo)記物(4.)，并通過合適的分析方法來檢測。圖4描繪了在示范性的傳感設(shè)備中進(jìn)行的根據(jù)本發(fā)明方法的一個實(shí)施方式的示意圖，所述傳感設(shè)備具有相互流體連接的至少五個空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室。這個實(shí)施方式的詳細(xì)說明在實(shí)施例1中給出。圖5示意地描繪了在具有相互流體連接的至少兩個空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室的示范性的傳感設(shè)備中，通過利用固定在固相支持物(即，珠子表面)上的DNA報告分子的部分， 離散的數(shù)據(jù)點(diǎn)的采集。圖A-C說明了部分釋放的示意性的時間系列。圖D代表了測定DNA 轉(zhuǎn)化效力的可能的曲線。細(xì)節(jié)在實(shí)施例3中給出。圖6描繪了在示范性的傳感設(shè)備中進(jìn)行的根據(jù)本發(fā)明方法的另一個實(shí)施方式的示意圖，所述傳感設(shè)備具有相互流體連接的至少兩個分隔的反應(yīng)區(qū)室。采用的一種DNA報告分子固定在反應(yīng)區(qū)室之一的表面上。圖A說明了樣品DNA和DNA報告分子的亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。圖B顯示了在適合的溫度和緩沖條件下從儲存器添加UNG。圖C顯示了“轉(zhuǎn)化的” DNA報告分子的熱誘導(dǎo)的斷裂。這個實(shí)施方式的詳細(xì)說明在實(shí)施例4中給出。圖7描繪了在示范性的傳感設(shè)備中進(jìn)行的根據(jù)本發(fā)明方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式的示意圖，所述傳感設(shè)備具有相互流體連接的至少兩個分隔的反應(yīng)區(qū)室。使用的UNG酶是熱穩(wěn)定的，因而可以與至少一種DNA報告分子一起提供，所述DNA報告分子固定在反應(yīng)區(qū)室之一的表面上。這個實(shí)施方式的詳細(xì)說明在實(shí)施例5中給出。詳細(xì)說明
本發(fā)明基于出乎意料地發(fā)現(xiàn)，通過組合酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)與至少一種標(biāo)記的DNA報告分子的反應(yīng)，報告分子在它的序列中包含至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基， 可以建立用于在DNA甲基化分析期間監(jiān)視亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化的發(fā)展的有效的方法。在下文說明性描述的本發(fā)明可以在缺少沒有在此具體公開的任何一個或多個要素、一個或多個限制的情況下適當(dāng)進(jìn)行。將針對特定的實(shí)施方式和參考某些圖描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不受此限制，而是僅由權(quán)利要求限制。描述的圖僅是示意性的并被認(rèn)為是非限制性的。當(dāng)術(shù)語“包括”在本說明書和權(quán)利要求中使用時，它不排除其他要素或步驟。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“由……組成”被認(rèn)為是術(shù)語“包含”的優(yōu)選的實(shí)施方式。如果在下文中，某一組被限定為包含至少一定數(shù)量的實(shí)施方式，這也被理解為公開了一種組，其優(yōu)選地僅由這些實(shí)施方式組成。在提及單數(shù)名詞時使用不定冠詞或定冠詞例如“一(a、an)”、“該(the)”的情況下，這包括該名詞的復(fù)數(shù)，除非特別聲明了其他情況。在本發(fā)明的上下文中術(shù)語“約”表示精確性的區(qū)間，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解仍然確保了所討論的特征的技術(shù)效果。該術(shù)語一般表明從所指明數(shù)值的士 10%和優(yōu)選地士 5% 的偏離。此外，在說明書中和在權(quán)利要求中，術(shù)語第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等等，是用于區(qū)分相似的要素，而不必描述次序或時間順序。要理解的是，這樣使用的術(shù)語在合適的狀況下是可互換的，且在此描述的本發(fā)明的實(shí)施方式能夠以不同于在此描述或說明的其他順序來操作。術(shù)語的進(jìn)一步的定義將在以下在使用該術(shù)語的上下文中給出。單獨(dú)地提供以下術(shù)語或定義來幫助理解本發(fā)明。這些定義不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為具有小于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的范圍。
在一個方面，本發(fā)明涉及在DNA甲基化分析期間監(jiān)視亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化的方法，包括
(a)提供要分析的樣品DNA和至少一種DNA報告分子，其中所述至少一種DNA報告分子包含
(i)在它的核苷酸序列中至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基；以及
(ii)至少一種標(biāo)記物；
以及其中所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子在相互流體連接的、空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室中提供；
(b)向所述空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室添加亞硫酸氫鹽，從而介導(dǎo)所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶殘基向尿苷殘基的轉(zhuǎn)化；
(c)向所述至少一種DNA報告分子添加尿嘧啶-DNA-糖基化酶，從而介導(dǎo)步驟(b)中獲得的尿嘧啶堿基從DNA骨架上脫除；
(d)通過熱處理來斷裂步驟(c)中獲得的DNA；以及
(e)檢測在步驟(d)期間從所述至少一種合成的DNA報告分子釋放的至少一種標(biāo)記物。如在此使用的，術(shù)語“樣品DNA”是指包含一個或更多個DNA分子的任何樣品，一旦DNA分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶殘基被轉(zhuǎn)化成尿苷殘基，則要分析所述DNA分子的差異甲基化狀態(tài)。DNA分子可以是天然發(fā)生的或合成的化合物(例如，通過重組DNA技術(shù)或通過化學(xué)合成產(chǎn)生的)，且可以是單鏈的或雙鏈的。DNA分子可以具有任何長度。一般地，長度在10 bp到100000 bp之間變動，優(yōu)選在100 bp到10000 bp之間，特別優(yōu)選在500 bp到5000 bp之間。樣品DNA中包含的DNA分子可以以純化的形式存在(例如，在適合的緩沖溶液中提供的，例如本領(lǐng)域已知的TE或PBS)，或可以包括在未純化的、部分純化的或富集的樣品溶液中。這樣的未純化的樣品的實(shí)例包括粗的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物、體液(例如，血液、血清、唾液和尿液)、溶解的組織，等等。在某些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括純化這樣的未純化的樣品中存在的 DNA。純化一般在亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化完成之后實(shí)現(xiàn)。純化DNA的方法和相應(yīng)的設(shè)備(任選地作為自動化系統(tǒng)或工作平臺的整合部分)是本領(lǐng)域公知的，且可從許多供應(yīng)商商業(yè)上獲得。如在此使用的，術(shù)語“DNA報告分子”是指在它的核苷酸序列中包含至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基和至少一個標(biāo)記物的DNA分子，其用作實(shí)際的底物，用于監(jiān)視引起可檢測標(biāo)記物釋放的亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化。用至少一種DNA報告分子進(jìn)行本發(fā)明的方法， 也就是說，用一種或更多種這樣的分子。在采用超過一種DNA報告分子的情況下，它們一般是相同類型的(即，具有相同的核酸序列和/或標(biāo)記物)。然而，還可能的是使用不同類型的 DNA報告分子(即，具有不同的核酸序列和/或標(biāo)記物)。一般地，本發(fā)明中使用的DNA報告分子是具有10到150個核苷酸長度，例如，15到 80個核苷酸、15到60個核苷酸或15到40個核苷酸的核酸分子。DNA報告分子可以是天然發(fā)生的分子，或優(yōu)選地，合成的分子(例如，通過重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成產(chǎn)生的)。優(yōu)選地， 本發(fā)明中使用的報告分子是單鏈核酸分子。然而，也可以采用雙鏈分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一種DNA報告分子是合成的寡核苷酸(S卩，單鏈的)。
為了進(jìn)行檢測反應(yīng)，DNA報告分子包含一個或更多個可檢測標(biāo)記物。如在此使用的，術(shù)語“標(biāo)記物”是指任何化合物或部分，其包含一種或更多種合適的化學(xué)物質(zhì)或酶，其直接或間接地產(chǎn)生可檢測化合物，或化學(xué)、物理或酶反應(yīng)中的信號。如在此使用的，該術(shù)語將被理解為包括可檢測標(biāo)記物以及與一種或更多種這樣的可檢測標(biāo)志物偶聯(lián)的任何化合物。 此外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，干擾通過標(biāo)記物的可檢測信號產(chǎn)生的部分(例如，猝滅劑“劫持” 得自熒光團(tuán)的激發(fā)的發(fā)射，只要猝滅劑和熒光團(tuán)相互非常靠近)也屬于標(biāo)記物。標(biāo)記物可以被摻入或附著于報告分子上，例如，以修飾的和/或標(biāo)記的核糖核苷酸、脫氧核苷酸或雙脫氧核苷酸的形式。標(biāo)記物可以附著到DNA報告分子的序列內(nèi)的5’ -末端和/或3’ -末端和 /或任何內(nèi)部核苷酸?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的可檢測標(biāo)記包括任何化合物，其在化學(xué)、物理或酶反應(yīng)中直接或間接地產(chǎn)生可檢測的化合物或信號。標(biāo)記可以通過本領(lǐng)域公知的方法來實(shí)現(xiàn)(參見， 例如 Sambrook, J. et al.Iecular, Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;以及 Lottspeich, F. , and Zorbas H. (l^^Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/ Berlin, Germany)。標(biāo)記物可以特別地選自熒光標(biāo)記物、酶標(biāo)記物、著色標(biāo)記物、產(chǎn)色標(biāo)記物、發(fā)光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、半抗原、生物素、金屬絡(luò)合物、金屬和膠體金。所有這些類型的標(biāo)記物是本領(lǐng)域中充分確立的。由這樣的標(biāo)記物介導(dǎo)的物理反應(yīng)的實(shí)例是在輻射或激發(fā)時熒光或磷光的發(fā)射，或在使用放射性標(biāo)記物時X-射線的發(fā)射。堿性磷酸酶、辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶以及β-內(nèi)酰胺酶是酶標(biāo)記物的實(shí)例，其催化產(chǎn)色反應(yīng)產(chǎn)物的形成，并且它們可以用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，可檢測標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。許多熒光標(biāo)記物是本領(lǐng)域充分確立的，且可從不同的供應(yīng)商商業(yè)上獲得(參見，例如 The Handbook-Α Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, IOth ed. (2006)， Molecular Probes, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CAj USA)。對于檢測這樣的標(biāo)記物，用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的設(shè)備可以包括檢測系統(tǒng)，其適合于測定指示標(biāo)記物的存在和/或量的值。適合的檢測系統(tǒng)的選擇取決于幾個參數(shù)，例如用于檢測的標(biāo)記物的類型或進(jìn)行的分析的種類。各種光學(xué)的和非光學(xué)的檢測系統(tǒng)是本領(lǐng)域充分確立的。例如，可以在本發(fā)明中使用的熒光檢測方法特別地包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)和熒光相關(guān)光譜法。在特定的實(shí)施方式中，檢測使用FRET或BRET進(jìn)行，它們基于熒光或生物發(fā)光猝滅劑對的各自形成。例如，在 Liu, B. et al. (2005)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102， 589-593 中也描述了 FRET 的運(yùn)用。例如，在 Xu, Y. et al. (1999)/￥oc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 151-156 中詳述了 BRET 的運(yùn)用。至少一種DNA報告分子可以以未結(jié)合的形成來提供(即，在溶液中的游離分子)。在特定的實(shí)施方式中，DNA報告分子被固定在支持物上(S卩，附著于基質(zhì))。一般地，支持物是固體部件，例如，固體表面。DNA報告分子對支持物的附著可以通過DNA報告分子與給定支持物部件的任何直接的(例如，通過報告分子中包含的錨定基團(tuán))或間接的(例如，通過介導(dǎo)結(jié)合的捕獲分子)相互作用實(shí)現(xiàn)。這種相互作用可以是共價的或非共價的結(jié)合，且一般是可逆的。例如，碳二亞胺化學(xué)作用可以用于共價地將DNA報告分子偶聯(lián)到活化的表面。然后為此提供在DNA報告分子的5’或3’末端的適合的胺接頭。用于實(shí)現(xiàn)DNA報告分子的固定的各種其他已確立的化學(xué)作用是本領(lǐng)域已知的。DNA報告分子可以固定在移動支持物上，優(yōu)選地珠子，例如磁性珠子、聚苯乙烯珠子和乳膠珠子。這樣的移動支持物部件可以在用于進(jìn)行所述方法的傳感設(shè)備的流體流動中轉(zhuǎn)移。另一方面，還可能的是將DNA報告分子直接固定在反應(yīng)區(qū)室的內(nèi)表面上，或，例如，排布在反應(yīng)區(qū)室中、但不能自由地轉(zhuǎn)移的顯微鏡載玻片、晶片或陶瓷材料上。在某些實(shí)施方式中，將檢測反應(yīng)的結(jié)果與參考值比較，例如，用固定量的標(biāo)記物獲得的值(例如，作為內(nèi)部對照提供的)，或與來自文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)比較。優(yōu)選地，檢測步驟在給定的時間內(nèi)重復(fù)至少一次，例如，30分鐘、60分鐘、120分鐘、6小時、12小時、24小時、48小時，等等。多次重復(fù)是可能的，例如，2、5、8、10、15、20、30
次，等等。重復(fù)可以在給定的時期內(nèi)以固定時間間隔進(jìn)行。然而，重復(fù)之間的時間間隔也可以變化，例如，隨著亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化達(dá)到完成而變得更短，以精確地測定反應(yīng)的終點(diǎn)。換句話說，在檢測期間獲得的結(jié)果被用于控制DNA轉(zhuǎn)化的發(fā)展。如果至少一種DNA 報告分子的亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化完成，認(rèn)為的是同樣適用于樣品DNA。
在本發(fā)明中，所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子在相互流體連接的、空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室中提供。也就是說，樣品DNA在第一反應(yīng)區(qū)室中提供，且至少一種DNA報告分子在第二反應(yīng)區(qū)室中提供，兩個區(qū)室代表獨(dú)立的實(shí)體。如在此使用的，術(shù)語“反應(yīng)區(qū)室” (也稱為“反應(yīng)室”)是指用于容納液體樣品的任何結(jié)構(gòu)。這樣的結(jié)構(gòu)的各種構(gòu)造(例如，具有立方體的或圓柱形的三維形狀)是本領(lǐng)域公知的。然而，反應(yīng)區(qū)室不是獨(dú)立的(self-contained)，而是相互流體連通的，也就是說， 成分的至少一部分可以在區(qū)室之間的流體流動中轉(zhuǎn)移。例如，這可以通過經(jīng)由微流通道連接反應(yīng)區(qū)室的方式實(shí)現(xiàn)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，反應(yīng)區(qū)室之間的空間分隔通過半透膜、優(yōu)選地大小排阻膜或微量滲析膜的方式實(shí)現(xiàn)。這樣的半透膜容許小分子通過屏障，而保留較大的分子(即，超過膜的性質(zhì)所決定的給定尺寸界限)。根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方案來進(jìn)行向空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室添加亞硫酸氫鹽(例如，亞硫酸氫鈉，但任何其他鹽同樣是適合的)，用于介導(dǎo)樣品DNA和至少一種DNA報告分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶殘基向尿苷殘基的轉(zhuǎn)化。試劑也可從不同的供應(yīng)商商業(yè)上獲得。在圖1中示意地描繪了一般反應(yīng)方案。DNA轉(zhuǎn)化一般在40-70°C之間，優(yōu)選 55-65°C之間，特別優(yōu)選在60°C的反應(yīng)溫度下進(jìn)行。孵育期可以在幾分鐘到幾小時(例如，過夜)之間變化(特別是取決于要分析的樣品)，或甚至更久。樣品DNA和至少一種DNA報告分子的DNA轉(zhuǎn)化在空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室中并行地 (即，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下)發(fā)生。所需要的各自試劑可從特定的儲存器添加到反應(yīng)區(qū)室之一和/或兩者中，在所述反應(yīng)區(qū)室中提供了各自的DNA分子。為了調(diào)整特定的反應(yīng)溫度，進(jìn)行本發(fā)明所采用的至少任何一個、優(yōu)選地所有反應(yīng)區(qū)室裝備有一個或更多個溫度控制單元，用于控制和調(diào)節(jié)反應(yīng)區(qū)室內(nèi)的溫度。這樣的溫度控制單元可以包含一個或更多個獨(dú)立的加熱和/或冷卻元件，其可以直接接觸所使用的設(shè)備的一個或更多個反應(yīng)區(qū)室。各種熱控制系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的，且可從不同的供應(yīng)商獲得。酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)通常在PCR反應(yīng)中使用，來阻止來自先前反應(yīng)的潛在污染性PCR產(chǎn)物的“遺留(carry-over)”。它可從許多供應(yīng)商商業(yè)上獲得，且作用于單鏈以及作用于雙鏈的DNA。UNG是細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)構(gòu)的一部分，任務(wù)是除去尿苷殘基。如果胞嘧啶脫氨基為尿嘧啶，尿苷僅可以在DNA中存在，引起DNA中的突變。該酶從DNA的糖-磷酸鹽骨架上除去尿嘧啶堿基，反應(yīng)在圖2中示意性說明。這個反應(yīng)是所謂的堿基切除修復(fù)機(jī)制的一部分，在這種情況下阻止DNA中的胞嘧啶脫氨基突變。任何已知的尿嘧啶-DNA-糖基化酶都可以在本發(fā)明中采用。所述酶被添加到至少一種DNA報告分子，而不是樣品DNA。取決于所采用的特定的酶，在建立的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下在DNA骨架上發(fā)生酶反應(yīng)(S卩，在亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化期間獲得的尿嘧啶堿基的脫除)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用熱穩(wěn)定的UNG，特別是來自嗜熱生物的UNG酶。這樣的熱穩(wěn)定的UNG酶是本領(lǐng)域已知的(例如，Sartori，A. A. et al(200lV； Biol. Chem. 276， 29979-29986 ；Sartori, A. A. et al (2002)EMBO J. 21，3182-3191)。它們甚至在超過 90°C的溫度下維持高活性。UNG介導(dǎo)的酶反應(yīng)可以在提供至少一種DNA報告分子的同一反應(yīng)區(qū)室中進(jìn)行，或在進(jìn)一步的(即，第三個)反應(yīng)區(qū)室中進(jìn)行，所述反應(yīng)區(qū)室是空間上分隔的、但是與其中提供至少一種DNA報告分子的區(qū)室流體連通。必需的試劑可以從與各自的反應(yīng)區(qū)室流體連通的特定儲存器中提供。在UNG處理之后獲得的DNA報告分子仍然具有完整的DNA骨架，但是具有已經(jīng)移除了尿嘧啶堿基的一個或多個無堿基位點(diǎn)。這些無堿基位點(diǎn)在提高的溫度下，例如，90°C到 95°C之間的溫度下對水解切割是敏感的。在本發(fā)明中，熱誘導(dǎo)的斷裂可以進(jìn)行各種時期，例如，10秒、30秒、1分鐘、2分鐘、5 分鐘，這取決于存在的DNA的類型和量。本領(lǐng)域技術(shù)人員充分了解如何選擇孵育時間。熱誘導(dǎo)的斷裂步驟可以在其中提供至少一種DNA報告分子的同一反應(yīng)區(qū)室中進(jìn)行(任選地在其中還發(fā)生UNG介導(dǎo)的反應(yīng))，或在另一個空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室中進(jìn)行。后一區(qū)室可以是其中發(fā)生UNG介導(dǎo)的反應(yīng)的同一反應(yīng)區(qū)室(S卩，第三個反應(yīng)區(qū)室)，或是與第二區(qū)室和/或第三區(qū)室空間上分隔的、但流體連通的進(jìn)一步的(即，第四個)區(qū)室。最后，檢測步驟可以在其中提供至少一種DNA報告分子的同一反應(yīng)區(qū)室中進(jìn)行 (以及任選地其中還發(fā)生UNG介導(dǎo)的反應(yīng)和熱誘導(dǎo)的斷裂)，或在另一個空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室中進(jìn)行。后一區(qū)室可以是已如上描述的第三區(qū)室或第四區(qū)室，或它可以是與第二區(qū)室和/或第三區(qū)室和/或第四區(qū)室空間上分隔、但流體連通的進(jìn)一步的(即，第五個)區(qū)室。根據(jù)本發(fā)明的方法的原理在圖3中示意性地概括。在某些實(shí)施方式中，相互流體連接的至少兩個空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室被整合到傳感設(shè)備、優(yōu)選地連續(xù)傳感設(shè)備中。進(jìn)而，傳感設(shè)備可以是自動化平臺或工作站的整合部分， 所述自動化平臺或工作站還包括，例如，用于DNA樣品純化、和/或用于隨后的差異甲基化分析的裝置(例如，用于進(jìn)行PCR反應(yīng)的熱循環(huán)儀)。這樣的平臺是本領(lǐng)域已知的和商業(yè)上可獲得的。在另一個方面，本發(fā)明涉及在此限定的方法用于分析樣品DNA的甲基化狀態(tài)的用途。換句話說，用于監(jiān)視亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化的發(fā)展的本方法是通過提供高質(zhì)量 (即，完全轉(zhuǎn)化的)DNA來確保下游應(yīng)用的準(zhǔn)確性和可靠性的先決條件。這樣的下游應(yīng)用包括亞硫酸氫鹽測序、甲基化敏感性單鏈構(gòu)像分析(MS-SSCA)、甲基化敏感性單核苷酸引物延伸(MS-SnuPE)、甲基化敏感性微陣列應(yīng)用、組合的亞硫酸氫鹽限制分析(COBRA)、甲基化敏感性實(shí)時PCR應(yīng)用，等等。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，DNA甲基化狀態(tài)的分析被用于診斷癌癥。通過附圖和以下的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，其僅僅是為了說明本發(fā)明的特定實(shí)施方式的目的，而無論如何不被看作是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例^MM 1 在連續(xù)傳感設(shè)各中監(jiān)視I硫酸氡龍介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化
在這個實(shí)施方式中，在示范性的連續(xù)傳感器中進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法，所述連續(xù)傳感器在圖4中示意性地說明。在這樣的情況下，希望的是所述方法的不同步驟在不同的空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室中發(fā)生。傳感設(shè)備的這種結(jié)構(gòu)防止了不同的方法步驟之間的干擾以及反應(yīng)成分之間的不相容性。例如，尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的酶活性可能在熱斷裂步驟期間顯著地降低。圖4中顯示的傳感設(shè)備具有至少五個空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室。在第一反應(yīng)區(qū)室中，提供樣品DNA。樣品DNA可以從這個區(qū)室中移除用于甲基化狀態(tài)的隨后的分析(未顯示)。第一區(qū)室連接到適合數(shù)量的儲存器，其含有用于DNA的制備和轉(zhuǎn)化的必要的成分(例如，亞硫酸氫鹽溶液)。第一反應(yīng)區(qū)室緊密鄰近于第二反應(yīng)區(qū)室定位，在第二反應(yīng)區(qū)室中至少一種DNA報告分子(即，標(biāo)記的合成的DNA寡核苷酸)。兩個反應(yīng)區(qū)室之間的空間分隔以一定方式實(shí)現(xiàn)，從而轉(zhuǎn)化試劑可以通過，但是樣品DNA被保留在第一室中，也就是說，通過半透性的屏障，例如，通過大小排除(過濾)膜。換句話說，兩個反應(yīng)區(qū)室是互相流體連通的。通過采用一個或更多個加熱(和/或冷卻)元件，可以控制第一和第二反應(yīng)區(qū)室中的溫度，以容許適合的反應(yīng)條件(例如，60°C)的調(diào)整。在第三反應(yīng)區(qū)室中，提供了 UNG酶，且發(fā)生尿嘧啶堿基從“轉(zhuǎn)化的”至少一種DNA報告分子上脫除。第二和第三反應(yīng)區(qū)室之間的空間分隔以這樣的方式實(shí)現(xiàn)，從而緩沖成分可以被替換或移動，例如，通過微量滲析膜的方式，來產(chǎn)生UNG酶的最佳反應(yīng)條件。在鄰近于第三區(qū)室定位的第四反應(yīng)區(qū)室中，在無堿基位點(diǎn)發(fā)生DNA報告分子的熱誘導(dǎo)的水解切割。第三和第四反應(yīng)區(qū)室之間的空間分隔以這樣的方式配置，從而UNG酶分子被保留，而DNA報告分子不保留，例如，通過(半透性的)大小排阻(過濾)膜的方式。在鄰近于第四區(qū)室定位的第五個反應(yīng)區(qū)室中，對前述斷裂步驟期間釋放的標(biāo)記物 (例如，熒光染料)進(jìn)行檢測。第四和第五反應(yīng)區(qū)室之間的空間分隔以這樣的方式配置，從而標(biāo)記物和斷裂的DNA報告分子可以通過第五反應(yīng)區(qū)室，但是任何完整的DNA報告分子被保留在第四反應(yīng)區(qū)室中，例如，通過(半透性的)大小排阻(過濾)膜的方式。在反應(yīng)方案開始時在第二反應(yīng)區(qū)室中提供的至少一種DNA報告分子的量優(yōu)選地是這樣，從而進(jìn)入隨后的反應(yīng)途徑的部分在分析的時間被認(rèn)為是恒定的。標(biāo)記物的檢測的數(shù)量則是DNA轉(zhuǎn)化的度量。標(biāo)記物產(chǎn)生的信號被標(biāo)準(zhǔn)化為進(jìn)入第三反應(yīng)區(qū)室的DNA報告分子的部分，例如， 通過核酸含量的UV測量的方式測定的。未轉(zhuǎn)化的、因而不被UNG和熱量的組合作用斷裂的DNA報告分子的部分被重新導(dǎo)回第二反應(yīng)區(qū)室。然后，這些DNA報告分子再次進(jìn)入轉(zhuǎn)化反應(yīng)。例如，這可以通過第四和第二反應(yīng)區(qū)室之間的連接(閉環(huán)結(jié)構(gòu)，未在圖4中示出)來實(shí)現(xiàn)。常規(guī)的微流設(shè)備可以用于限制液體和試劑的量，以及啟動系統(tǒng)。實(shí)施例2 兩倍標(biāo)記的DNA報告分子的使用
在根據(jù)本發(fā)明的方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，至少一種DNA報告分子(S卩，合成的寡核苷酸)包含第一和第二標(biāo)記物。所述第一標(biāo)記物是熒光染料，其可以選自多種商業(yè)上可獲得的染料。第二種標(biāo)記物是這種染料的適合的猝滅劑?？蛇x地，第二分子是另一種熒光染料，其與第一染料一起形成熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的供體-接受體對。在DNA報告分子的熱誘導(dǎo)的斷裂時，第一熒光染料與猝滅劑分子分離?？蛇x地， FRET供體-接受體對相互分離。然后在熱誘導(dǎo)的斷裂步驟中熒光信號已經(jīng)是可檢測的。因此，通過組合斷裂和檢測步驟，圖4中說明的傳感設(shè)備的至少五個反應(yīng)區(qū)室之一是可有可無的，產(chǎn)生所述設(shè)備的簡化的結(jié)構(gòu)。^MM 3 固定在珠子卜.的DNA報告分子的#用
對于某些應(yīng)用，可能優(yōu)選的是產(chǎn)生僅少數(shù)數(shù)據(jù)點(diǎn)，例如，來限制試劑的量、能量消耗，等等。在這樣的情況下，至少一種DNA報告分子(S卩，合成的寡核苷酸)包含附著于一個末端、 例如3’-末端的適合的標(biāo)記物，通過另一個末端、例如5’-末端固定在移動表面上，優(yōu)選的珠子，例如聚苯乙烯珠子或磁性珠子。在一個具體的實(shí)施方式中，珠子被保留在示范性的傳感設(shè)備的第二反應(yīng)區(qū)室中， 且在某些時間點(diǎn)，珠子的一部分可以被釋放進(jìn)入進(jìn)一步的一個或更多個區(qū)室。圖5中示意性地顯示了在具有兩個空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室的示范性的傳感設(shè)備中，通過利用固定在固相支持物(即，珠子表面)上的DNA報告分子的部分，離散的數(shù)據(jù)點(diǎn)的采集。圖A-C說明了部分釋放的示意性的時間系列。圖D代表了測定DNA轉(zhuǎn)化效力的可能的曲線。在第二反應(yīng)區(qū)室中固定在珠子上的DNA報告分子的使用還允許交換這個區(qū)室中的溶液，同時保留DNA報告分子。因而圖5顯示的傳感設(shè)備的第二和第三反應(yīng)區(qū)室之間緩沖液平衡的要求是可有可無的，且可以省略。此外，來自第二反應(yīng)區(qū)室的DNA報告分子的部分釋放容許更精確控制轉(zhuǎn)移到進(jìn)一步的一個或更多個反應(yīng)區(qū)室的DNA報告分子的絕對數(shù)量(因?yàn)槊總€珠子的DNA報告分子的數(shù)量以及每次釋放的珠子的數(shù)量是已知的)。進(jìn)而促進(jìn)了未轉(zhuǎn)化的/轉(zhuǎn)化的DNA報告分子的比例的計算。將珠子限制在第二反應(yīng)區(qū)室中可以通過，例如，與磁場的應(yīng)用一起使用磁性珠子， 或通過與AC電場以及介電泳力一起使用聚苯乙烯珠子來實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例4 在反應(yīng)區(qū)室的內(nèi)表面上固定的DNA報告分子的使用
在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，采用包含第一和第二反應(yīng)區(qū)室的傳感設(shè)備進(jìn)行本發(fā)明的方法。所述傳感設(shè)備在圖6中示意性地說明。第一反應(yīng)區(qū)室(其中提供樣品DNA)連接到含有亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化所需試劑的儲存
ο第二反應(yīng)區(qū)室連接到含有處于適合的緩沖液中的UNG酶的至少一個儲存器。至少一種DNA報告分子(S卩，標(biāo)記的合成的寡核苷酸)被固定在第二反應(yīng)區(qū)室的內(nèi)表面上，例如， 通過使用碳二亞胺化學(xué)作用，以及DNA報告分子的一個末端的氨基接頭。DNA報告分子的另一個末端用合適的標(biāo)記物，例如，熒光染料來修飾。第一和第二反應(yīng)區(qū)室是空間上分隔的，但是相互流體連通，從而容許緩沖液和/ 或轉(zhuǎn)化試劑的交換，但樣品DNA和酶不能通過，例如，通過半透性大小排除濾膜的方式。兩個反應(yīng)區(qū)室中的溫度可以調(diào)節(jié)到容許高效的亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化的水平。然而，第二反應(yīng)區(qū)室中的溫度可以獨(dú)立于第一反應(yīng)區(qū)室地調(diào)節(jié)，例如，通過使用第二加熱(和/或冷卻)元件。在第一個方法步驟中，兩個反應(yīng)區(qū)室中的緩沖條件和溫度都適合于轉(zhuǎn)化樣品DNA 和固定的DNA報告分子(圖6A )。在第二個步驟中，第二反應(yīng)區(qū)室中的溫度被降低，容許發(fā)生UNG反應(yīng)，例如，37°C。 然后，來自儲存器的UNG酶被應(yīng)用于第二區(qū)室(圖6B)。在第三步驟中，第二反應(yīng)區(qū)室中的溫度被提高，例如，提高到95°C，以在無堿基位點(diǎn)斷裂DNA報告分子(圖6C)。從斷裂的DNA報告分子上釋放的標(biāo)記物然后通過合適的檢測器來測量?？蛇x地，通過與TIRF、共焦掃描器等一起使用熒光標(biāo)記物，可以測量處在表面的仍然完整的DNA報告分子的標(biāo)記物。在第二反應(yīng)區(qū)室中的熱處理之后，溫度再次降低到第一反應(yīng)區(qū)室的溫度，以繼續(xù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)。在某些時間點(diǎn)，重復(fù)該方案，產(chǎn)生表示隨著時間的過去的轉(zhuǎn)化效率的不連續(xù)的曲線(類似于圖6D)。在第二區(qū)室中的UNG處理、熱誘導(dǎo)的斷裂和標(biāo)記物檢測期間，第一區(qū)室中的溫度一般被降低以停止樣品DNA的轉(zhuǎn)化。這容許兩個區(qū)室中獲得的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的更好的相關(guān)。因而，在這個實(shí)施方式中，進(jìn)行連續(xù)測量，并且更為精細(xì)的溫度控制是必需的，但是降低了所需區(qū)室的復(fù)雜性和數(shù)量。實(shí)施例5 熱穩(wěn)定的尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的使用
在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實(shí)施方式中，使用熱穩(wěn)定的UNG酶，其在熱斷裂期間保持活性。然而優(yōu)選地，使用來自嗜熱生物的UNG酶。這樣的熱穩(wěn)定的UNG酶是本領(lǐng)域已知的 (例如，Sartori, A. A. et al (2001)7； Biol. Chem. 276，29979-29986 ；Sartori, Α. Α. et aim奶EMBO J. 21，3182-3191)。它們甚至在超過90°C的溫度下保持高活性。傳感設(shè)備中的斷裂步驟在90°C到95°C之間的溫度下進(jìn)行。因而，在熱誘導(dǎo)的斷裂期間和之后， 熱穩(wěn)定的UNG酶保持活性。在這個實(shí)施方式中，在第二反應(yīng)區(qū)室中與DNA報告分子(S卩，標(biāo)記的合成的寡核苷酸)一起提供UNG酶，所述DNA報告分子被固定在區(qū)室的內(nèi)表面上。與第二反應(yīng)區(qū)室中的兩步驟溫度方案一起，沒有酶儲存器的雙區(qū)室傳感設(shè)備則是足夠的。兩個區(qū)室再次通過半透性大小排除濾膜的方式連接，以防止反應(yīng)區(qū)室之間酶和樣品DNA的交換。采用的傳感設(shè)備的例示在圖7中給出。檢測可以如上文實(shí)施例1-5描述的進(jìn)行。實(shí)施例6 樣品DNA純化
為了進(jìn)一步分析亞硫酸氫鹽介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的樣品DNA，例如，通過甲基化特異性PCR或任何其他適合的技術(shù)，樣品DNA必需以純化的形式提供。因而，例如，用于使用適合的結(jié)合緩沖液(例如，具有高含量的離液鹽)將DNA結(jié)合
13到二氧化硅膜上、用適合的緩沖液(例如，具有高含量的乙醇)洗滌結(jié)合的DNA，以及用適合的緩沖液(例如，水或其緩沖的溶液)洗脫DNA的裝置和試劑可以被包括在根據(jù)本發(fā)明的方法中。這可以通過提供附著到第一反應(yīng)區(qū)室的出口、含有所述二氧化硅膜的出口以及各自試劑溶液的儲存器來實(shí)現(xiàn)。在此說明性地描述的本發(fā)明可以在缺少沒有在此具體公開的任何一種或多種要素、一種或多種限制的情況下進(jìn)行。因而，例如，術(shù)語“包含”、“包括”、“含有”等等應(yīng)當(dāng)可擴(kuò)展地和無限制地閱讀。另外，在此采用的術(shù)語和表述被用作說明的術(shù)語，而不是限制的術(shù)語，在使用這樣的術(shù)語和表述時不意圖排除所顯示和描述的特征的任何等價物或其部分， 而是認(rèn)識到的是各種修飾在要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)是可能的。因而，要理解的是，雖然本發(fā)明已經(jīng)通過實(shí)施方式和任選的特征具體地公開，其中蘊(yùn)含的本發(fā)明的修改和變化可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員采用，這種修改和變化被認(rèn)為處于本發(fā)明范圍內(nèi)。在此已經(jīng)廣泛地和一般地描述了本發(fā)明。落入一般性公開的各種更窄的類別和亞屬分組也構(gòu)成本發(fā)明的部分。這包括帶有從所述屬中除去任何主題的條件性或否定性限制的本發(fā)明的一般性描述，無論所除去的材料是否在此具體地敘述。其他實(shí)施方式處于所附的權(quán)利要求之內(nèi)。此外，當(dāng)按馬庫什組的方式描述本發(fā)明的特征或方面時，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明也由此對于馬庫什組的任何獨(dú)立成員或成員的亞組描述。
權(quán)利要求
1.用于在DNA甲基化分析期間監(jiān)視亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化的方法，包括(a)提供要分析的樣品DNA和至少一種DNA報告分子，其中所述至少一種DNA報告分子包含(i)在它的核苷酸序列中至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基；以及(ii)至少一種標(biāo)記物；以及其中所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子在相互流體連接的、空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室中提供；(b)向所述空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室添加亞硫酸氫鹽，從而介導(dǎo)所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶殘基向尿苷殘基的轉(zhuǎn)化；(c)向所述至少一種DNA報告分子添加尿嘧啶-DNA-糖基化酶，從而介導(dǎo)步驟(b)中獲得的尿嘧啶堿基從DNA主干上脫除；(d)通過熱處理來斷裂步驟(c)中獲得的DNA；以及(e)檢測在步驟(d)期間從所述至少一種合成的DNA報告分子釋放的至少一種標(biāo)記物。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括(f)將(e)中獲得的結(jié)果與參考值比較。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述檢測步驟在給定的時間期內(nèi)重復(fù)至少一次。
4.權(quán)利要求1到3的任一項的方法，其中步驟(e)中獲得的結(jié)果被用于控制根據(jù)步驟 (b)的反應(yīng)的發(fā)展。
5.權(quán)利要求1到4的任一項的方法，其中所述至少一種DNA報告分子是合成的寡核苷酸。
6.權(quán)利要求1到5的任一項的方法，其中所述至少一種合成的DNA報告分子被固定在支持物上。
7.權(quán)利要求1到6的任一項的方法，其中所述尿嘧啶-DNA-糖基化酶是熱穩(wěn)定的。
8.權(quán)利要求1到7的任一項的方法，其中步驟(c)、(d)和(e)在提供所述至少一種DNA 報告分子所采用的同一反應(yīng)區(qū)室中進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1到7的任一項的方法，其中步驟(c)、(d)和(e)的任何一個或多個在與提供所述至少一種DNA報告分子所采用的反應(yīng)區(qū)室流體連接的至少一個進(jìn)一步的空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室中進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1到9的任一項的方法，其中至少任何一個、優(yōu)選地所有反應(yīng)區(qū)室裝備有一個或更多個溫度控制單元，用于控制和調(diào)節(jié)一個或更多個反應(yīng)區(qū)室內(nèi)的溫度。
11.權(quán)利要求1到10的任一項的方法，其中反應(yīng)區(qū)室之間的空間分隔通過半透膜、優(yōu)選地大小排阻膜或微量滲析膜的方式實(shí)現(xiàn)。
12.權(quán)利要求1到11的任一項的方法，其中相互流體連接的至少兩個空間上分隔的反應(yīng)區(qū)室被整合到傳感設(shè)備、優(yōu)選地連續(xù)傳感設(shè)備中。
13.權(quán)利要求1到12的任一項中限定的方法用于分析樣品DNA的甲基化狀態(tài)、或在分析樣品DNA的甲基化狀態(tài)時的用途。
14.權(quán)利要求13的用途，其中進(jìn)行DNA甲基化狀態(tài)的分析用于診斷癌癥。
15.權(quán)利要求1的報告分子在分析DNA甲基化狀態(tài)的過程中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及在DNA甲基化分析期間監(jiān)視亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化的發(fā)展的方法。所述方法基于酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)與至少一種標(biāo)記的DNA報告分子的反應(yīng)，所述報告分子在其序列中包含至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基。在尿苷殘基中未甲基化的胞嘧啶殘基的亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化之后，UNG從DNA骨架中除去尿嘧啶堿基，因而使得它對熱誘導(dǎo)的水解切割敏感。最后，檢測在這種斷裂過程期間從DNA報告分子釋放的標(biāo)記物。
文檔編號C12Q1/68GK102549168SQ201080042611
公開日2012年7月4日 申請日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者I.佩茨 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司