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      基于桿狀病毒生產(chǎn)不含污染性桿狀病毒毒粒的生物藥品的制作方法

      文檔序號:392851閱讀:671來源:國知局
      專利名稱:基于桿狀病毒生產(chǎn)不含污染性桿狀病毒毒粒的生物藥品的制作方法
      基于桿狀病毒生產(chǎn)不含污染性桿狀病毒毒粒的生物藥品本發(fā)明涉及利用基于桿狀病毒的系統(tǒng)來生產(chǎn)生物藥品的方法。這些方法有利地允許生產(chǎn)污染性桿狀病毒毒粒減少或沒有的生物藥品。經(jīng)過過去的二十年,桿狀病毒-昆蟲細胞技術已變成用于生產(chǎn)重組蛋白的非常常用的真核表達系統(tǒng),其不僅用于科學目的,而且越來越多地用于人類醫(yī)學和獸醫(yī)學(Condreay 和 Kost, 2007, van Oers,2006)。具體來說,源自于苜猜銀紋夜蛾(Autographacalifornica)多粒核多角體病毒(AcMNPV)的重組桿狀病毒被廣泛用于在培養(yǎng)的昆蟲細胞中大規(guī)模生產(chǎn)異源蛋白。頻繁使用該系統(tǒng)的主要原因是(1)外來蛋白的高表達水平,(2)昆蟲細胞能夠在懸浮培養(yǎng)中生長,因此易于規(guī)模放大,(3)在昆蟲細胞中合成的蛋白經(jīng)過翻譯后加工和修飾;(4)良好建立的病毒載體操作技術,其產(chǎn)生靈活的表達系統(tǒng),以及5)對人類無致病性,因為桿狀病毒的宿主范圍限于昆蟲和無脊椎動物。重組桿狀病毒載體正被用 來生產(chǎn)用于亞基疫苗目的的個體蛋白,但是也用于含有ー種或多種蛋白的更有序的結構,例如酶復合體、病毒或病毒樣粒子。病毒樣粒子(VLP)是高度組織化的結構,其由病毒來源的結構蛋白自組裝而來。這些穩(wěn)定和多用的納米粒子具有出色的輔助性質,能夠誘導先天和獲得性免疫應答(Ludwig
      &Wagner,2007)。在過去幾年中,利用VLP的結構穩(wěn)定性和對操作的耐受性,已將其應用于生物技術的其他分支,以攜帶和展示異源分子或用作新納米材料的構筑單元。對于免疫治療和預防應用來說,已在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中成功生產(chǎn)了許多類型的病毒樣粒子(VLP) (Noad & Roy, 2003, van Oers 等,2006, Ramqvist 等,2007)。第一種商業(yè)化實現(xiàn)的用于人類的桿狀病毒VLP技術是最近由GlaxoSmithKline上市的人類乳頭瘤病毒(HPV)疫苗,其預防性對抗HPV毒株16和18。通過重組桿狀病毒載體表達了這些HPV類型的每ー種的LI蛋白,并將得到的VLP組合以產(chǎn)生疫苗Cervarix (Harper等,2006)。目前,正進行巨大的努力以開發(fā)源于桿狀病毒的流感病毒樣粒子以及流感亞基疫苗,作為不基于卵和哺乳動物細胞培養(yǎng)的新一代。非復制型流感病毒樣粒子能夠有效引發(fā)針對來自于新出現(xiàn)的H5N1流感病毒分離株的蛋白的加寬的、跨進化枝的保護性免疫應答,產(chǎn)生用于人類的可能大流行的流感疫苗候選物,其可以被儲備用于H5N1流感爆發(fā)的情況(Bright等,2008)。在昆蟲細胞中生產(chǎn)的流感亞基疫苗已快要獲得FDA批準(Cox和Hollister,2009)。類似策略原則上可應用于針對大流行性流感例如最近爆發(fā)的豬流感的疫苗。為了基因治療目的,桿狀病毒-昆蟲細胞技術也被應用于生產(chǎn)感染性腺相關病毒載體(例如Urabe等,2002)和慢病毒載體(Lesch等,2008)。為了生產(chǎn)AAV載體,將昆蟲細胞用三種重組桿狀病毒共同感染,一種產(chǎn)生AAV復制酶(REP)蛋白,ー種帶有用于產(chǎn)生AAV病毒結構蛋白(VP1、VP2、VP3)的cap功能,第三種桿狀病毒包含具有攜帯和轉移轉基因的能力的AAV-ITR載體。最近發(fā)表了這種生產(chǎn)方法的改進形式,其基于僅僅使用重組桿狀病毒,其中ー種重組桿狀病毒攜帶AAV的r印和cap功能(Smith等,2009)。產(chǎn)生的AAV載體與在哺乳動物細胞中產(chǎn)生的載體在物理和生物性質上無法區(qū)分。AAV-ITR載體的產(chǎn)率達到每個Sf9昆蟲細胞5X IO4個,證實了該系統(tǒng)能夠以簡單方式生產(chǎn)大量AAV載體。目前,使用桿狀病毒來源的AAV載體用于例如脂蛋白脂肪酶缺陷的臨床試驗正在進行之中(AmsterdamMolecular Therapeutics B. V·)。作為生產(chǎn)慢病毒載體的備選的、可放大的方法(Lesch等,2008),用在昆蟲細胞中產(chǎn)生的四種重組桿狀病毒同時轉導哺乳動物293T細胞,以表達產(chǎn)生安全的慢病毒載體所需的所有元件。哺乳動物細胞培養(yǎng)基中未濃縮的慢病毒滴度平均為2. SXlO6TUmr1,與通過常規(guī)的四種質粒轉導方法生產(chǎn)的慢病毒的滴度相當。此外,進行了廣泛嘗試以將慢病毒載體生產(chǎn)方法轉變成更好的、可放大的基于昆蟲細胞的技術。Tjia等,1983,發(fā)現(xiàn)BV可以被哺乳動物細胞內化,并且甚至ー些病毒DNA到達細胞核。進ー步的研究顯示,桿狀病毒能夠進入哺乳動物細胞并介導大腸埃希式桿菌(Escherichia coli)氯霉素こ酰轉移酶在勞氏(Rous)肉瘤病毒啟動子下的表達(Carbonell等,1985)。這些發(fā)現(xiàn)導致開發(fā)了用于哺乳動物細胞的新的基于桿狀病毒的基因遞送載體(Boyce&Bucher, 1996, Hofmann 等,1995, Condreay 和 Kost, 2007, Kaikkonen 等,2008)。目前,有強烈證據(jù)表明桿狀病毒來源的基因遞送載體在抗生素選擇后能夠在哺乳動物細胞中介導外來基因的瞬時和穩(wěn)定表達(Lackner等,2008)。 關于桿狀病毒啟動子在哺乳動物細胞中的轉錄活性,仍然了解得不多。已證實,在哺乳動物細胞中,AcMNPV的反式激活蛋白IEl (Murges等,1997)以及早至晚期(ETL)啟動子(Liu等,2006a,b)有功能。其他未完全探索的領域包括桿狀病毒與哺乳動物免疫系統(tǒng)組分的相互作用。AcMNPV病毒能夠誘導抗病毒的細胞因子生產(chǎn),其保護細胞免于被水泡性口炎病毒和流感病毒感染(Abe等,2003,Gronowski等,1999)。AcMNPV還被樹突狀細胞和巨噬細胞上的Toll樣受體9識別,并且AcMNPV誘導抗腫瘤的獲得性免疫力(Kitajima &Takaku, 2008)。這些結果表明AcMNPV具有作為誘導先天和獲得性免疫力的有效病毒或腫瘤治療劑的潛力。盡管AcMNPV對小鼠中體液和適應性細胞介導的免疫的組分具有普遍的正效應,但桿狀病毒與人類免疫系統(tǒng)的相互作用可能稍有不同。此外,AcMNPV的免疫輔助性質應該與針對在昆蟲細胞中生產(chǎn)的目標疫苗/生物藥品的免疫應答完全分離開。在將桿狀病毒用于生產(chǎn)供治療目的的疫苗或病毒載體(例如AAV、慢病毒)的情形中,桿狀病毒的這些特點非常不利。因此,應該避免生產(chǎn)的生物藥品被兩種類型的桿狀病毒毒粒——芽生型毒粒(BV)和包埋型毒粒(ODV)污染。一般來說,重組蛋白可以在昆蟲細胞中作為胞質、膜結合或細胞外分泌型蛋白來生產(chǎn)。后ー種分泌蛋白被培養(yǎng)基中存在的桿狀病毒BV高度“污染”。在某些生產(chǎn)和純化構造中,將不想要的桿狀病毒毒粒與產(chǎn)生的重組生物藥品分離可能非常困難。例如,已顯示這些BV可能在使用桿狀病毒-昆蟲細胞技術生產(chǎn)的AAV載體的純化過程中引起問題(個人通信,O. Merten, Genethon)。另ー方面,還存在0DV,其在所有常規(guī)桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)中總是在被感染細胞的核內部形成,即使在因使用所需基因代替多角體蛋白的開放閱讀框而不形成包含體的情況下也是如此。類似地,這些毒粒在純化過程中可以隨著細胞內產(chǎn)生的重組蛋白或VLP共純化。概括來說,重組蛋白以及特別是VLP與桿狀病毒粒子的分離,需要大量努力并以高成本實現(xiàn)。此外,它引起重組蛋白生產(chǎn)效率的降低。因此,開發(fā)允許異源蛋白的高表達并在同時消除桿狀病毒BV和ODV產(chǎn)生的改進的桿狀病毒-昆蟲細胞技術是非常需要的,并且是本專利申請的主題。對于在昆蟲細胞中生產(chǎn)的所有種類的生物藥品來說,這樣的不含桿狀病毒毒粒的生產(chǎn)系統(tǒng)將呈現(xiàn)與現(xiàn)有系統(tǒng)相比的顯著改迸。
      本發(fā)明是基于鑒定有效的基于桿狀病毒-昆蟲細胞的方法,所述方法用于生產(chǎn)桿狀病毒毒粒的量減少或沒有的生物藥品。因此,本發(fā)明的ー個目的提供了用于生產(chǎn)生物藥品的方法,所述方法包含(a)用至少ー種桿狀病毒感染生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞,所述至少一種桿狀病毒包含編碼所述生物藥品的基因組;以及(b)將生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞維持在使所述生物藥品得以生產(chǎn)的條件下,其中所述至少一種桿狀病毒的每個基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷,或其中所述生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞包含使桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因失活的表達控制系統(tǒng)。在一個實施方案中,本發(fā)明涉及上述方法,其中通過突變,例如通過核苷酸取代、插入或缺失,使所述基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因有缺陷。在另ー個實施方案中,本發(fā)明涉及上述方法,其中生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞是重組昆蟲細胞,其包含表達對桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有特異性的dsRNA的構建物,所述dsRNA任選在誘導型啟動子的控制下表達。在另ー個實施方案中,本發(fā)明涉及上述方法,其中所述至少一種桿狀病毒在步驟(a)之前、在表達桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因的互補拷貝的桿狀病毒生產(chǎn)細胞中產(chǎn)生。在另ー個實施方案中,本發(fā)明涉及上述方法,其中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少一個基因選自vp80、vp39、vpl054和ρ6· 9。在另ー個實施方案中,本發(fā)明涉及上述方法,其中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因的有缺陷或失活,與來自野生型桿狀病毒載體的極晚期表達相比,不影響來自所述桿狀病毒的極晚期表達。在另ー個實施方案中,本發(fā)明涉及上述方法,其中所述至少一種桿狀病毒優(yōu)選源自于 AcMNPV 或家香(Bombyx mori ) (Bm) NPV0在另ー個實施方案中,本發(fā)明涉及上述方法,其中生物藥品是重組蛋白、重組病毒、源于病毒的載體或病毒樣粒子。在另ー個實施方案中,本發(fā)明涉及上述方法,其中生物藥品是重組AAV載體。此夕卜,本發(fā)明涉及上述方法,其中生物藥品是疫苗??梢允褂帽景l(fā)明的方法生產(chǎn)的疫苗的代表性實例包括但不限于流感病毒樣粒子或流感亞基疫苗以及針對人乳頭瘤病毒的疫苗。在另ー個實施方案中,本發(fā)明涉及上述方法,其中生物藥品由導入到重組桿狀病毒基因組中并在桿狀病毒啟動子、優(yōu)選為PlO或多角體蛋白啟動子控制下的至少ー個基因編碼。本發(fā)明的另ー個目的提供了桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)在生物藥品生產(chǎn)中的應用,其中所述桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)包含用至少ー種重組桿狀病毒感染的生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞,其中-所述或每個重組桿狀病毒包含編碼生物藥品或生物藥品的至少ー個組分的重組桿狀病毒基因組,并且-所述重組桿狀病毒基因組中所述桿狀病毒正確裝配所必需的至少ー個基因是有缺陷的,或者生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞包含使桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少一個基因失活的表達控制系統(tǒng)。本發(fā)明的另ー個目的涉及包含桿狀病毒基因組的桿狀病毒質粒,其中所述基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因是有缺陷的,優(yōu)選其中所述桿狀病毒基因組的vp80、vp39、p6. 9或vpl054有缺陷。在特定情況下,所述桿狀病毒質粒源于AcMNPV并缺少vp80 ORF。本發(fā)明的另ー個目的涉及重組AcMNPV桿狀病毒載體,其中所述桿狀病毒的基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因是有缺陷的,優(yōu)選其中所述桿狀病毒基因組的vp80、vp39、vpl054或ρ6· 9有缺陷。在特定情況下,本發(fā)明涉及缺少vp80 ORF的重組AcMNPV桿狀病毒。本發(fā)明的另ー個目的是用上面提到的重組AcMNPV桿狀病毒感染的昆蟲細胞。
      本發(fā)明的另ー個目的涉及昆蟲細胞,其包含表達特異性針對桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因、優(yōu)選針對vp80、vp39、vpl054和/或p6. 9的dsRNA的構建物,所述構建物優(yōu)選整合在昆蟲細胞的基因組中。本發(fā)明的另ー個目的涉及昆蟲細胞,其包含編碼桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的表達盒。具體來說,本發(fā)明涉及所述昆蟲細胞,其中由表達盒編碼的基因是vp80、vp39、vpl054 和/或 ρ6· 9。本發(fā)明的另ー個目的涉及用于生產(chǎn)桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷的桿狀病毒的方法,所述方法包含用包含桿狀病毒基因組的桿狀病毒質粒轉染昆蟲細胞的步驟,所述昆蟲細胞包含編碼桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的表達盒,其中所述基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因是有缺陷的,優(yōu)選其中所述桿狀病毒的基因組中νρ80、νρ39、ρ6. 9和/或νρ1054有缺陷,其中在所述桿狀病毒質粒中有缺陷的桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因是由包含在所述昆蟲細胞中的表達盒所編碼的基因。本發(fā)明涉及利用桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細胞中生產(chǎn)生物藥品,但是不同時產(chǎn)生污染性桿狀病毒毒粒。本發(fā)明的方法在很大程度上簡化了在昆蟲細胞中生產(chǎn)的生物藥品的下游處理。因此,本發(fā)明涉及利用為了避免產(chǎn)生污染性桿狀病毒毒粒而設計的桿狀病毒系統(tǒng)來生產(chǎn)生物藥品的方法。本發(fā)明的方法包含用編碼所述生物藥品的至少ー種桿狀病毒感染生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞。桿狀病毒是有包膜的節(jié)肢動物DNA病毒,其兩個成員是公知的用于在細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)重組蛋白的表達載體。桿狀病毒具有環(huán)狀雙鏈基因組(80-200kbp),其可以被エ程化以允許將大的基因組內含物遞送至特定細胞。用作載體的病毒一般是苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)多粒核多角體病毒(AcMNPV)或家香(Bombyx mori ) (Bm) NPV(Kato 等,2010)。桿狀病毒常用于感染昆蟲細胞以表達重組蛋白。具體來說,異源基因在昆蟲中的表達可以按照例如 U. S. 4,745,051、Friesen 等(1986)、EP 127,839、EP 155,476、Vlak 等(1988)、Miller 等(1988)、Carbonell 等(1988)、Maeda 等(1985)、Lebacq-Verheyden 等(1988)、Smith 等(1985)、Miyajima 等(1987)和 Martin 等(1988)中的描述來實現(xiàn)??捎糜诘鞍踪|生產(chǎn)的許多桿狀病毒毒株和變異體以及相應的許可性昆蟲宿主細胞,描述在Luckow等(1988)、Miller 等(1986)、Maeda 等(1985)和 McKenna (1989)中。
      根據(jù)本發(fā)明,可以使用源于常用于蛋白質和生物藥品的重組表達的桿狀病毒的任何基因組。例如,桿狀病毒基因組可以源自于例如AcMNPV、BmNPV、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera) (HearNPV)或甜菜夜蛾(Spodoptera exigua) MNPV,優(yōu)選源自于 AcMNPV 或BmNPV0具體來說,桿狀病毒基因組可以源自于AcMNPV克隆C6 (基因組序列=Genbank登記號 NC_001623. I - SEQ ID NO:I)。術語“生物藥品”打算是指使用生物技術生產(chǎn)的醫(yī)藥品。就此而言,生物藥品可以對應于重組生產(chǎn)的藥物,例如重組蛋白,尤其是重組激素或用作疫苗的重組蛋白、病毒例如治療性重組AAV或用于基因治療的其他病毒載體,以及病毒樣粒子(或VLP)。這樣的生物藥品打算給藥于需要的對象,用于在所述對象中預防性或治愈性治療疾病狀況,所述對象可以是人類或動物源的。生物藥品可以對應于單鏈蛋白或肽,例如在治療性重組蛋白的情況下,或者可以是復合體結構例如病毒或病毒樣粒子。在后兩種情況下,復合體的組分可以從各攜帶復合體結構的至少ー種組分的幾種重組桿狀病毒來表達,或者從其基因組已通過插入編碼復合 體的所有組分的序列進行了遺傳修飾的單ー桿狀病毒來表達。例如,為了生產(chǎn)重組AAV,可以使用包含三種桿狀病毒的系統(tǒng)編碼AAV Rep蛋白的桿狀病毒,編碼AAV Cap蛋白的桿狀病毒、和編碼在兩個AAV ITR之間包含治療基因的AAV-ITR基因組的桿狀病毒?,F(xiàn)在也有包含兩種桿狀病毒的系統(tǒng),其中編碼AAV Rep蛋白和AAV Cap蛋白的DNA序列由一個桿狀病毒提供。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中,編碼生物藥品的異源基因被置于桿狀病毒啟動子的控制之下。例如,異源基因被置于多角體蛋白或Pio啟動子或常用于在昆蟲細胞中進行表達的任何其他桿狀病毒啟動子(例如ie_l、p6. 9、gp64或Orchyia pseudotsugataCOp)MNPVie-2啟動子)的控制之下。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中,桿狀病毒啟動子選自極晩期表達啟動子,例如選自P10和多角體蛋白啟動子,優(yōu)選在多角體蛋白啟動子的控制之下。在本發(fā)明的方法中,在上述方法中利用的重組桿狀病毒的基因組缺乏桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因,或者所述基因的表達被阻止。本發(fā)明人已表明,這些基因的缺失或失活導致桿狀病毒的兩種形式,即芽生型毒粒和/或包埋型毒粒的減少或甚至完全不存在?!皸U狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因”是其在生產(chǎn)桿狀病毒的細胞中的缺陷或失活對于從所述細胞生產(chǎn)的BV和ODV的數(shù)量有負面影響的基因。這樣的基因可以如本文下面的實施例中所提供的來鑒定。具體來說,人們可以使用特異性針對特定桿狀病毒基因的雙鏈RNA,通過例如檢測桿狀病毒基因組中存在的報告基因在細胞培養(yǎng)物中的表達來評估缺乏所述特定基因對BV和ODV生產(chǎn)的影響,并因此確定桿狀病毒(單感染表型)的擴散或不存在擴散。或者,可以在對BV生產(chǎn)進行取樣時通過培養(yǎng)基中桿狀病毒結構蛋白或基因組序列的存在來檢測桿狀病毒毒粒。這兩種毒粒類型都可以通過電子顯微術來檢測。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中,桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因選自vp80、 vp39、vpl054和ρ6· 9。更優(yōu)選,基因選自νρ80和νρ39,所述基因優(yōu)選為νρ80。本發(fā)明提供了桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的失活。為此目的可以利用幾種策略,特別是突變,例如通過在重組桿狀病毒基因組中缺失所選基因;或者通過在打算用桿狀病毒感染的生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞中提供的表達控制系統(tǒng)降低所選基因的表達。優(yōu)選,表達控制系統(tǒng)包括通過RNA干擾來下調由所選基因編碼的蛋白的表達。在本發(fā)明的一個實施方案中,在本發(fā)明的方法中利用的所述至少一種桿狀病毒的基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷,特別是編碼vp80、vp39、vp 1054和/或ρ6· 9、優(yōu)選為νρ80和/或νρ39、更優(yōu)選為νρ80的基因有缺陷。更具體來說,所述基因組源自于AcMNPV,更具體來說源自于AcMNPV克隆C6基因組序列(Genbank登記號NC_001623. I-SEQ ID NO: I)。因此,一方面,本發(fā)明提供了如上說明的方法,其中桿狀病毒基因組編碼vp80、vp39、vpl054和/或ρ6· 9、優(yōu)選νρ80和/或νρ39、更優(yōu)選νρ80的基因有缺陷的AcMNPV基因組,特別是AcMNPV克隆C6基因組。正如本技術領域中公知并且在Genbank登記號NC 001623. I中指定的,這些基因的位置按照在AcMNPV克隆C6基因組(SPSEQ ID NO: I 中):vp80 為 89564-91639 位;vp39 (互補序列)為 75534-76577 位;vpl054 為45222-46319 位;p6. 9 (互補序列)為 86712-86879 位。應該指出,在生物藥品是包含各自由不同桿狀病毒編碼的各種不同亞基的復合體產(chǎn)物的情況下,所有被利用的重組桿狀病毒的基因組中所選的必需基因有缺陷,以便避免 ー個基因組被另ー個基因組互補。換句話說,當使用幾種桿狀病毒感染同一生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞時,這些桿狀病毒的每ー種中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的相同基因是有缺陷的。根據(jù)本發(fā)明,可以通過對基因進行突變以使所述基因有缺陷。桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的突變是導致完全缺乏有功能的必需基因產(chǎn)物的所述基因改變。因此,所述突變可以引起在從桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因所轉錄的mRNA的開放閱讀框中引入ー個或幾個終止密碼子,或者可以相當于桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的全部或部分缺失。桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因,可以通過在野生型基因的全部或部分序列中(例如在Genbank登記號NC_001623. I中提供的源自于AcMNPV的基因組的序列中)利用核苷酸取代、插入或缺失來進行突變。突變可以相當于基因的完全缺失,或所述基因的僅僅一部分缺失。例如,人們可以缺失桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的至少50%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、更加優(yōu)選至少90%。突變的桿狀病毒基因組可以使用本技術領域中公知的標準方法例如位點定向誘變(參見例如 Sambrook 等(1989))和 Lambda red 重組(Datsenko & Wanner, 2000)來產(chǎn)生。具體來說,可以如下面的實施例中所提供的來缺失桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因。概括來說,人們可以利用Suzuki等(2005)描述的突變的IoxP位點,用側翼帶有突變的LoxP位點的報告基因通過重組來全部或部分替換桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因。然后利用使用Cre重組酶的重組來切除報告基因(例如編碼氯霉素こ酰轉移酶的基因I cat))。該實施方案在下面的實施例中進行說明,并對其基因組已通過在AcMNPV基因組中缺失2074-bp的vp80 ORF片段進行修飾的桿狀病毒進行詳細描述。該具體的基因組是本發(fā)明的一部分,但是作為本發(fā)明的突變桿狀病毒基因組的非限制性實例提供。應該指出,桿狀病毒基因組的重組工程可以弓I起幾個序列例如克隆位點或重組位點(例如用Cre重組酶重組后ー個殘留的LoxP位點)的插入。這是無關緊要的,只要得到的基因組被制造成桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所選基因有缺陷即可。在其中所述至少一種桿狀病毒的基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷的這個實施方案中,生產(chǎn)生物藥品的細胞的初始感染所需的重組芽生桿狀病毒粒子的產(chǎn)生,需要利用拯救缺陷基因的特殊細胞,即這些生產(chǎn)桿狀病毒的細胞表達所選基因。換句話說,生產(chǎn)桿狀病毒的細胞表達在桿狀病毒基因組中有缺陷的桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因的互補拷貝。例如,可以建立組成型生產(chǎn)桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的產(chǎn)物的Sf9來源的細胞系。該重組細胞系被用于生產(chǎn)桿狀病毒毒種儲用物,而常規(guī)昆蟲細胞系如Sf9、Sf21或High-five細胞系可以用產(chǎn)生的桿狀病毒進行感染,用于生物藥品的異源表達。因此,本發(fā)明還涉及被修飾以表達桿狀病毒正確裝配所必需的基因的昆蟲細胞,所述基因在用于生產(chǎn)生物藥品的如上說明的桿狀病毒中被突變。這種用于生產(chǎn)在本發(fā)明的方法中利用的突變桿狀病毒載體的細胞系,被稱為“生產(chǎn)桿狀病毒的細胞”。當桿狀病毒基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因有缺陷吋,生產(chǎn)桿狀病毒的昆蟲細胞必須提供并表達所述基因以便互補所述缺陷并產(chǎn)生感染性桿狀病毒。在特定實施方案中,通過用編碼桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因的表達盒進行轉染,對用于生產(chǎn)桿狀病毒的昆蟲細胞進行修飾。在實施方案中,所述表達盒被整合在所述細胞的基因組中。人們也可以使用用至少ー個包含所述表達盒的質粒瞬時轉染的昆蟲細胞。術語“表達盒”是指包含目標基因編碼序列與表達控制序列功能性連接的構建物。這樣的表達盒可以是包含處于在所選昆蟲細胞中有功能的啟動子的控制之下的桿狀病毒毒 粒正確裝配所必需的基因的ORF的質粒,但是不含待互補的桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因和任選的允許所述基因表達的啟動子序列之外的其他桿狀病毒基因組序列(具體來說,表達盒不是桿狀病毒質?;蛉魏纹渌麠U狀病毒完整基因組)。示例性表達控制序列可以在啟動子、增強子、絕緣子等中選擇。在一個實施方案中,補償基因源自于其中已造成桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因有缺陷的桿狀病毒的基因組。在另ー個實施方案中,互補基因源自于與用于生產(chǎn)生物藥品的桿狀病毒基因組不同的桿狀病毒物種的基因組。例如,用于生產(chǎn)生物藥品的桿狀病毒可以源自于AcMNPV基因組,而導入到生產(chǎn)桿狀病毒的細胞中的互補基因源自于BmNPV或SeMNPV。更具體來說,桿狀病毒基因組可以被制造成vp80、vp39、vpl054和/或p6. 9有缺陷,并且生產(chǎn)桿狀病毒的細胞可以包含來自于能夠互補這些基因的BmNPV或SeMNPV的基因拷貝(例如如實施例中所提供,在AcMNPV基因組中缺失了p6. 9,而生產(chǎn)桿狀病毒的細胞提供了 SeMNPV p6. 9基因的拯救拷貝)。因此,本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷的桿狀病毒的方法,所述方法包括用包含桿狀病毒基因組的桿狀病毒質粒來轉染包含編碼桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的表達盒的昆蟲細胞的步驟,其中所述基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因有缺陷,優(yōu)選其中所述桿狀病毒的基因組中vp80或vp39、p6. 9和/或vpl054有缺陷,其中在所述桿狀病毒質粒中有缺陷的桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因,是由在所述昆蟲細胞中包含的表達盒編碼的基因。根據(jù)這種方法,在桿狀病毒基因組中有缺陷的基因由在昆蟲細胞中表達的基因來互補。將用桿狀病毒質粒轉染的細胞維持在使桿狀病毒毒粒得以產(chǎn)生的條件下。然后收集這些產(chǎn)生的桿狀病毒毒粒,其包含其中缺少了桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因的基因組,以備它們后續(xù)用于感染生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞,以生產(chǎn)生物藥品。在桿狀病毒的基因組中桿狀病毒毒粒裝配所必需的至少ー個基因有缺陷的實施方案中,生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞必須不能互補所述基因的缺陷。否則該缺陷將被生產(chǎn)生物藥品的細胞拯救,并且可能產(chǎn)生BV和ODV。桿狀病毒正確裝配所必需的基因的存在或不存在,可以例如通過用特異性針對所述基因的PCR來檢查所述細胞或通過檢測該基因的蛋白產(chǎn)物(例如通過用特異性針對所述基因產(chǎn)物的抗體進行western印跡分析)來監(jiān)測。打算用于感染細胞的所利用的桿狀病毒基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因已被造成缺陷,而所述細胞仍表達所述基因的功能產(chǎn)物,這樣的細胞決不能用作生物藥品生產(chǎn)細胞。在本發(fā)明的另ー個實施方案中,桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的表達受到 表達控制系統(tǒng)的控制。術語“表達控制系統(tǒng)”被定義為生產(chǎn)桿狀病毒的昆蟲細胞系統(tǒng)/生產(chǎn)生物藥品的細胞系統(tǒng)的修飾和/或病毒基因組的另一種適應,其引起桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的特異性調控。該系統(tǒng)可以是允許所述必需基因如期啟動或關閉的誘導型表達系統(tǒng)(例如Tet-OruTet-Off、基于蛻皮激素的系統(tǒng)(Dai等,2005)或含有桿狀病毒同源區(qū)(hr)的元件例如Aslanidi等,(2009)所描述的hr2系統(tǒng))、表達RNA干擾的構建物或它們的組合。在特定實施方案中,桿狀病毒正確裝配所必需的基因的表達通過RNA介導的沉默或RNA干擾來失活(Salem & Maruniak, 2007,Kanginakudru等,2007)。優(yōu)選,通過用編碼基因特異性雙鏈RNA (dsRNA)的構建物穩(wěn)定轉化細胞來沉默桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的表達,建立了昆蟲細胞來源的細胞系,特別是Sf9來源的細胞系。這種表達dsRNA的細胞系在用攜帯生物藥品的編碼基因的重組桿狀病毒感染后,被用于表達所述生物藥品。在該實施方案中,可以使用常規(guī)的Sf9、Sf21或High-Five細胞系(即細胞中不需要基因的互補拷貝)來生產(chǎn)重組桿狀病毒毒種儲用物,因為在這種情況下桿狀病毒基因組包含桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的野生型基因。在本發(fā)明的還ー個實施方案中,將桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因置于誘導型啟動子的控制之下,允許在受控條件下表達或阻遏所述基因。在優(yōu)選實施方案中,在本發(fā)明的方法中產(chǎn)生的桿狀病毒毒粒的數(shù)量,與原本使用包含桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所有基因的桿狀病毒基因組時由生產(chǎn)生物藥品的細胞所產(chǎn)生的桿狀病毒的數(shù)量相比,減少了至少50%。更優(yōu)選,桿狀病毒毒粒的數(shù)量與野生型桿狀病毒基因組相比減少了至少60%、至少70%、至少80%、至少90%,最優(yōu)選至少95%。如上所討論的,使用在現(xiàn)有技術中用于生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞/桿狀病毒系統(tǒng),其特征為與生物藥品并行地共同產(chǎn)生大量重組桿狀病毒(并且可以超過IO8 pfu/ml),需要仔細開發(fā)和優(yōu)化的下游處理方案來失活和消除這種桿狀病毒污染??梢酝ㄟ^增添引起污染性桿狀病毒的脂質層解體的去污劑的步驟,例如用于疫苗目的的病毒樣粒子的純化(豬細小病毒-VLP (Maranga等,(2002))或輪狀病毒-VLP (Mellado等,(2008))或不同AAV血清型的純化(Smith et al. 2009)的步驟來進行失活。已經(jīng)使用了其他有效的分離步驟離心(Wang等,(2000) ;Maranga等,(2002);Mellado等,(2008))、微過濾(Tellez,(2005))、桿狀病毒蛋白的負消除(例如Mellado等(2008))或正向親和層析(保留/捕獲生物藥品——污染性蛋白通流,例如通過伴刀豆球蛋白A層析捕獲輪狀病毒的vp7蛋白(Mellado等(2008)),通過固定化的金屬離子親和層析捕獲免疫原性嵌合rVP2H傳染性囊病病毒粒子(Wang等,(2000))或通過使用駱駝抗體的免疫親和層析捕獲不同AAV血清型(Smith等,2009)。具體來說,由于使用高特異性免疫配體,利用免疫親和性允許將待純化的生物藥品(例如特異性AAV)與任何污染物完全分離開,或者在桿狀病毒系統(tǒng)的情況下,與由于桿狀病毒與生物藥品平行地同時生產(chǎn)所引起的桿狀病毒的大量污染完全分尚開。這些參考文獻非常清楚地顯示需要這些不同處理步驟來失活和消除殘留的桿狀病毒污染物,因為沒有這些步驟,生物藥品仍然被各種桿狀病毒蛋白顯著污染,并且不能用于臨床目的。本發(fā)明的方法允許污染性桿狀病毒毒粒的數(shù)量顯著減少或者甚至完全不存在。結果,為了獲得用于臨床目的的生物藥品所必需的純化步驟數(shù)量減少(或者如果不產(chǎn)生桿狀病毒毒粒的話,甚至不需純化步驟)。因此,由于通過使用本發(fā)明的方法,極大降低了對消除 殘留桿狀病毒毒粒的需要,簡化了生物藥品的生產(chǎn)和純化方案。在仍將使用簡化的純化方案的情況下,專業(yè)技術人員可以選擇至少ー種上面指定的方法和方案來獲得純化的生物藥品O優(yōu)選,所選的必需基因是與原始桿狀病毒載體相比,其失活不影響桿狀病毒極晚期基因表達的基因。在AcMNPV基因組(和其他α-桿狀病毒)中,plO和多角體蛋白啟動子是極晚期表達啟動子,并且應該指出,在桿狀病毒/昆蟲細胞生產(chǎn)系統(tǒng)中,異源基因最通常被插入到這些非常強的啟動子的控制之下,以允許表達非常大量的重組蛋白。因此,不影響極晚期基因表達的桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的失活是優(yōu)選的。術語“不影響極晚期基因表達”是指下述事實,即來自于按照本發(fā)明修飾的桿狀病毒基因組中包含的極晚期桿狀病毒啟動子的重組蛋白表達水平,與從未修飾的基因組獲得的水平相比,為至少70%、更優(yōu)選高于80%、更優(yōu)選高于90%。應該提到的是,在本發(fā)明的方法中,來自于極晚期桿狀病毒啟動子的生物藥品表達水平甚至可能比使用未修飾載體獲得的水平高100%。在本發(fā)明者所測試的基因中,νρ80基因是特別優(yōu)選的,因為它的缺失不影響極晚期表達,同時它完全阻止了 BV的生產(chǎn),并導致ODV的前體——細胞內核衣殼的數(shù)量顯著降低。可以通過將報告基因例如編碼GFP的基因、特別是egfp或螢光素酶基因置于野生型AcMNPV載體中和必需基因已被失活的突變體AcMNPV基因組中的多角體蛋白或plO啟動子的控制之下,并通過比較來自這兩種基因組的報告基因產(chǎn)物的表達,來評估極晩期表達。優(yōu)選,當從處于PlO或多角體蛋白基因啟動子控制之下的報告基因測量時,來自帶有突變的桿狀病毒骨架的載體的極晚期表達,為使用野生型AcMNPV載體獲得的表達水平的至少60%,優(yōu)選高于80%,更優(yōu)選高于90%。本發(fā)明還涉及用于篩選桿狀病毒基因的方法,所述桿狀病毒基因的失活可用于在如上說明的昆蟲細胞-桿狀病毒系統(tǒng)中生產(chǎn)不含污染性桿狀病毒毒粒的生物藥品,所述方法包含a)提供含有桿狀病毒基因組的細胞的細胞培養(yǎng)物;b)將所述細胞培養(yǎng)物與用于失活所述桿狀病毒基因組的至少ー個被測桿狀病毒基因的手段相接觸,例如與RNA干擾相接觸;以及c)測試來自所述細胞培養(yǎng)物的毒粒形成,與來自未與所述手段接觸的細胞培養(yǎng)物的毒粒形成進行比較;其中如果被測基因的失活引起桿狀病毒毒粒形成的減少,則所述被測基因被選為可用于生產(chǎn)生物藥品。在特定實施方案中,用于本發(fā)明的篩選的方法還包含步驟d):測試來自與所述手段接觸的細胞培養(yǎng)物的極晚期基因表達,與來自未接觸所述手段的細胞培養(yǎng)物的極晚期基因表達進行比較;其中如果被測基因的失活引起桿狀病毒毒粒形成的減少并且如果被測基因不影響來自所述桿狀病毒基因組的極晩期基因表達,則所述被測基因被選為可用于生產(chǎn)生物藥品O本發(fā)明還涉及用于篩選桿狀病毒基因的方法,所述桿狀病毒基因的失活可用于在如上說明的昆蟲細胞-桿狀病毒系統(tǒng)中生產(chǎn)不含污染性桿狀病毒毒粒的生物藥品,所述方法包含-失活桿狀病毒基因組的至少ー個被測基因(例如通過在所述基因組中缺失所述 被測基因);-如上所說明來評估來自于所述桿狀病毒基因組的桿狀病毒的極晚期基因表達;-確定來自于含有所述桿狀病毒基因組的細胞的桿狀病毒毒粒生產(chǎn);其中如果基因的失活-引起桿狀病毒毒粒生產(chǎn)的減少,并且-不影響如上說明的來自于所述桿狀病毒基因組的極晩期基因表達,則所述基因被選為可用于生產(chǎn)生物藥品。在用于篩選其失活可用于生產(chǎn)生物藥品的桿狀病毒基因的方法的特定實施方案中,被測基因的失活使用特異性針對所述被測基因的dsRNA來執(zhí)行。具體來說,候選桿狀病毒基因可以通過用RNA干擾擊倒其表達以測試其在毒粒形成中的作用來進行鑒定?,F(xiàn)在將伴隨下面的實施例對本發(fā)明進行說明,所述實施例僅僅被提供為本發(fā)明的非限制性示例實施方案。


      圖I. dsRNA介導的基因沉默篩選。將昆蟲Sf9細胞在28°C下接種于24孔組織培養(yǎng)板(2X105細胞/孔)中的Iml Sf-900II SFM培養(yǎng)基中。兩小時后,去除培養(yǎng)基,并將細胞在標準條件下用帶有在多角體蛋白啟動子控制下的egfp基因的重組桿狀病毒(AcMNPV-EGFP)感染。(A)使用熒光顯微術確定極晚期基因表達水平。將細胞以moi=iotcid5(i單位/細胞進行感染,并在感染后(P. 1. )1小時用針對vpl054、vp39、vp80、dbp和ec_27的基因特異性dsRNA進行轉染。通過48h p. i.時的EGFP特異性熒光來檢查極晚期基因表達水平。使用特異性針對egfp和cat序列的dsRNA作為RNAi對照。(B)通過基于免疫印跡的測定法測量極晚期基因表達水平。將細胞用AcMNPV-EGFP以MOI=I進行感染,并且也在Ih p. i.時用基因特異性dsRNA進行轉染。在48h p. i.時,使用兔抗EGFP多克隆抗血清來分析極晚期基因表達水平。使用抗vp39和抗α-微管蛋白抗體作為內部対照。(C)在dsRNA處理過的細胞中滴定和檢測產(chǎn)生的芽生型毒粒。在P. i. 36小時收獲芽生型毒粒,并用于終點稀釋測定法以測量感染性毒粒的滴度或用于基于PCR的檢測以檢查病毒粒子的存在。(D) vp39和vp80下調的細胞中包埋型毒粒和桿狀結構的存在。將細胞在p. i. 36小時收獲,裂解,并將細胞裂解液超速離心通過ー層40%的蔗糖溶液(45,OOOrpm,I小吋,Beckman SW55)。將沉淀物重懸浮在去礦質水中,并通過負染色電子顯微術進行分析。標尺條表示lOOnm。圖2. AcMNPV vp80_null桿狀病毒質粒的構建。(A)在大腸桿菌中通過同源重組構建含有AcMNPV vp80開放閱讀框完全缺失的vp80_null桿狀病毒質粒的策略。第一歩,將包含vp80 ORF的2074-bp片段缺失,并用含有側翼帶有修飾的IoxP (LE和RE)位點的氯霉素(cat)抗性基因的序列盒代替。隨后,使用Cre/loxP重組系統(tǒng)從桿狀病毒質粒序列中消除抗生素抗性基因(cat)。p48基因的啟動子序列和he65基因的聚腺苷化信號保持原封未動。在野生型基因座和兩個vp80敲除基因型的PCR分析中,使用由單側箭頭所指示的寡核苷酸對來驗證vp80 ORF的缺失和氯霉素抗性基因盒的正確插入/缺失。它們的名字按照核苷酸序列坐標來命名。用于cat基因盒擴增的引物被命名 為cat-F和cat-R。(B)基于PCR檢測原始 AcMNPV 桿狀病毒質粒(Ac_wt)、Ac-vp80null (+cat)和 Ac_vp80null (-cat)桿狀病毒質粒中vp80基因座中序列修飾的存在或不存在。上圖證實了使用引物對90292/90889和cat-F/cat-R的vp80基因缺失和cat盒插入vp80基因座。下圖顯示了使用89507/91713引物對,對vp80基因座中的正確重組過程的基于PCR的驗證。圖3.使用轉染-感染測定法測定AcMNPV-vp80敲除和修復的桿狀病毒質粒構建物的病毒復制能力。(A)轉座到多角體蛋白基因座中的表達盒的示意圖。制造了 4種修復構建物(由其天然啟動子驅動的vp80,由多角體蛋白啟動子驅動的vp80,N-端帶有FLAG標簽的vp80和C-端帶有FLAG標簽的vp80,后二者都由其天然啟動子表達)。用于轉染測定的桿狀病毒質粒基因組骨架在左側標出。使用野生型AcMNPV (bM0N14272)桿狀病毒質粒作為病毒復制的陽性對照。Ac-gp64null桿狀病毒質粒被用作陰性對照,代表了具有“單細胞感染”表型的原型桿狀病毒質粒。(B)時間過程熒光顯微術,其顯示了用標出的桿狀病毒質粒構建物轉染的Sf9細胞中感染的傳播。在轉染后的指定時間點通過EGFP檢測來檢查病毒感染的進展。在P. t. 120小時時,收集細胞培養(yǎng)上清液以啟動二次感染。(C)二次感染測定。在P. i. 72小時時檢測EGFP以檢測感染的進展。圖4.從轉染時間過程測定法產(chǎn)生的AcMNPV_vp80null修復的桿狀病毒質粒構建物的生長曲線。將Sf9細胞用5. Oyg來自每種修復桿狀病毒質粒的DNA進行轉染。(a)由其天然啟動子驅動的vp80, (b)由多角體蛋白啟動子驅動的vp80, (c)N-端帶有FLAG標簽的vp80和(d)C-端帶有FLAG標簽的vp80,后兩者從vp80啟動子表達。在轉染后指定時間點收獲細胞培養(yǎng)上清液,并通過TCID5tl終點稀釋測定法分析感染性芽生型病毒的生產(chǎn)。通過監(jiān)測EGFP表達來確定感染力。點表示從三次獨立轉染得到的平均滴度,誤差條表示標準偏差。圖5. AcMNPV-vp80null突變體不能產(chǎn)生任何感染性/非感染性芽生型毒粒。將Sf9 細胞用 20 μ g 桿狀病韋質粒 DNA Ac- Δ vp80 (a)、Ac_wt (b)、Ac-Δ vp80_vp80 (C)、Ac- Δ νρ80-ρΗ-νρ80 (d)、Ac_ Δ vp80-FLAG_vp80 (e)或 Ac-Δ vp80-vp80_FLAG (f)獨立地進行轉染。P.t.5日時,將富含芽生型病毒的細胞培養(yǎng)上清液超速離心,并通過負染色電子顯微術觀察芽生型病毒(A)。標尺條表示200nm。并行地,也將收獲的芽生型毒粒在SDS-PAGE上分離、產(chǎn)生印跡并使用抗VP39抗體進行免疫檢測或用于基于PCR的檢測,以檢測病毒粒子的存在(B)。圖6· vp80基因無效的桿狀病毒質粒突變體形成少量核衣売,并且包埋型毒粒的生產(chǎn)不足。按照材料和方法中的描述將用Ac-Λ Vp80 (A至D)、Ac-AVp80-vp80 (E、F)或Ac-wt (G、H)轉染的Sf9細胞固定、染色、包埋并薄切片。(A)用Ac-vp80null桿狀病毒質粒突變體轉染的Sf9細胞的代表性概觀。(B)Ac-vp80null突變體在病毒發(fā)生基質中形成較少數(shù)量的核衣殼(C),并且在被轉染細胞的環(huán)區(qū)中沒有包埋型毒粒(D)。另ー方面,修復桿狀病毒質粒構建物Ac- Δ vp80-vp80完全再生了病毒發(fā)生基質中大量核衣殼的形成(E),并且在被轉染細胞的環(huán)區(qū)中正常外觀的包埋型毒粒(F)。用Ac-wt桿狀病毒質粒轉染的細胞的病毒發(fā)生基質(G)和環(huán)區(qū)(H)的代表性圖像。標尺條表示500nm??s寫Nc,核衣売;匪,核膜;Nu,核;RZ,環(huán)區(qū);Mi,線粒體;ODV,包埋型毒粒;VS,病毒發(fā)生基質。圖7.使用反式作用vp80基因對Ac_vp80null桿狀病毒質粒突變體進行功能互ネト。將Sf9細胞用pIZ-flag-vp80 (A)或pIZ (B)載體進行轉染,并進行基于博萊霉素(Zeocin)的篩選。轉染后3周,將多克隆博萊霉素抗性細胞群體接種到新的6孔板中,并用Ac-vp80null桿狀病毒質粒突變體進行轉染以檢查互補活性。在p. t. 72h和96h,通過EGFP特異性熒光監(jiān)測病毒繁殖。在p. t. 120小吋,收集細胞培養(yǎng)上清液,以在未處理的(野生型)Sf9細胞中啟動二次感染(右圖)。在p. i. 72小時時檢測EGFP以指示感染的進展。在p. i. 120小時時檢測EGFP以指示感染的進展。圖8. AcMNPV vp39_null桿狀病毒質粒的構建。(A)在大腸桿菌中通過同源重組構建含有AcMNPV vp39開放閱讀框部分缺失的vp39-null桿狀病毒質粒的策略。第一歩,將vp39 ORF的498-bp的內部片段缺失,并用含有側翼帶有修飾的IoxP (LE和RE)位點的氯霉素(cat)抗性基因的序列盒代替。隨后,使用Cre/loxP重組系統(tǒng)從桿狀病毒質粒序列中消除cat基因。lef-4和cg-30基因的啟動子序列不受影響。箭頭指示在野生型基因座和兩個vp39敲除基因型的PCR分析中用于驗證vp39 ORF的部分缺失和cat基因盒的正確插入/缺失的寡核苷酸對的位置。引物名稱按照核苷酸序列坐標來命名。(B)基于PCR檢測Ac-wt、Ac_vp39null (+cat)和Ac_vp39null (-cat)桿狀病毒質粒的vp39基因座中序列修飾的存在或不存在。圖顯示了使用75834/76420引物對,對vp39基因座中的正確重組過程的基于PCR的驗證。圖9.使用轉染-感染測定法測定AcMNPV-vp39敲除和修復的桿狀病毒質粒構建物的病毒復制能力。(A)基于Tn7轉座到多角體蛋白基因座中的表達盒的示意圖。(I)從多角體蛋白啟動子表達的vp39,(2)都由其天然啟動子驅動的雙基因νρ39和lef_4,(3)都由多角體蛋白啟動子驅動的雙基因vp39和cg-30,以及最后(4)由多角體蛋白啟動子驅動的N-端帶有FLAG標簽的vp39與從其天然以及更上游的多角體蛋白啟動子表達的cg_300RF的雙基因構建物。用于轉染測定的親本桿狀病毒質?;蚪M骨架在左側標出。使用野生型AcMNPV (bM0N14272)桿狀病毒質粒作為病毒復制的陽性對照。(B)時間過程熒光顯微術,其顯示了用標出的桿狀病毒質粒構建物轉染的Sf9細胞中感染的傳播。在轉染后的指定時間通過EGFP檢測來檢查病毒的進展。在p. t. 168小時時,收集細胞培養(yǎng)上清液以啟動二次感染。(C) 二次感染測定法。在p. i. 72小時時進行EGFP檢測以測量感染的進展。圖10. AcMNPV vpl054_null桿狀病毒質粒的構建。(A)在大腸桿菌中通過同源重組構建含有AcMNPV vpl054開放閱讀框缺失的Vpl054_null桿狀病毒質粒的策略。從vpl054ORF的3’ -端起955-bp的序列缺失,并用側翼帶有修飾的IoxP (LE和RE)位點的cat序 列盒代替。同吋,導入了單個點突變,將第一個翻譯密碼子ATG — Met改變成ACG — Thr,以防止翻譯成C-端截短的VP1054蛋白。這也意味著Ief-IO的32號內部AAT密碼子被突變成AAC, 二者都編碼Asn。隨后,使用Cre/loxP重組系統(tǒng)消除cat基因。在桿狀病毒質粒構建物中vpl054/lef-10的啟動子序列不受影響。由于Ief-IO基因的聚腺苷化信號被去除,因此在Ief-10 ORF的3 ’ -末端引入了帶有終止密碼子的新的合成poIy-A信號(TAATAAA)。箭頭表示在野生型基因座和兩個vpl054敲除基因型的PCR分析中用于驗證vpl054 ORF的缺失和cat基因盒的正確插入/缺失的寡核苷酸對的位置。(B)基于PCR檢測Ac-wt、Ac_vpl054null (+cat)和Ac_vpl054null (-cat)桿狀病韋質粒的vpl054基因座中序列修飾的存在或不存在。上圖顯示了使用引物對90292/90889和cat-F/cat-R證實vpl054基因的缺失和cat盒插入vpl054基因座中。下圖顯示了使用89507/91713引物對,對vpl054基因座中的正確重組過程的基于PCR的驗證。圖11.使用轉染-感染測定法測定AcMNPV-vpl054敲除和修復的桿狀病毒質粒構建物的病毒復制能力。(A)轉座到多角體蛋白基因座中的表達盒的示意圖。用于轉染測定法的桿狀病毒質?;蚪M骨架在左側標出。制造了兩種Ac-Vpl054null衍生構建物第一種構建物只攜帶PlO啟動子控制下的egfp標記基因,第二種構建物攜帶由其天然啟 動子序列指導的egfp標記和交疊的lef-10/vpl054基因座兩者(d)。使用野生型AcMNPV(bM0N14272)桿狀病毒質粒作為病毒復制的陽性對照(a)。Ac_gp64null桿狀病毒質粒被用作陰性對照,代表了具有“單細胞感染”表型的原型桿狀病毒質粒(b)。(B)時間過程熒光顯微術,其顯示了用標出的桿狀病毒質粒構建物轉染的Sf9細胞中感染的傳播。在轉染后的指定時間通過EGFP檢測來檢查病毒感染的進展。在p. t. 120小時時,收集細胞培養(yǎng)上清液以啟動二次感染。(C) 二次感染測定法。在p. i. 72小時時進行EGFP檢測以指示感染的進展。圖12.AcMNPV p6. 9_null桿狀病毒質粒的構建。(A)在大腸桿菌中通過同源重組構建含有AcMNPV vp6. 9開放閱讀框完全缺失的vp6. 9-null桿狀病毒質粒的策略。將vp6. 90RF的164-bp的片段缺失,并用側翼帶有修飾的IoxP (LE和RE)位點的cat抗性基因代替。隨后,使用Cre/loxP重組從桿狀病毒質粒序列中消除cat基因。p6.9基因的啟動子序列保持不受影響,這是因為其序列與p40 ORF交疊。箭頭指示在野生型基因座和兩個vp6. 9敲除基因型的PCR分析中使用的引物對的位置。(B)基于PCR檢測Ac_wt、Ac_vp6. 9null (+cat)和Ac_vp6. 9null (-cat)桿狀病韋質粒的νρ6· 9基因座中序列修飾的存在或不存在。上圖顯示了使用引物對cat-F/cat-R, cat盒在νρ6. 9基因座中的插入。下圖顯示了使用89507/91713引物對,對νρ6. 9基因座中的正確重組過程進行的基于PCR的驗證。圖13.使用轉染-感染測定法測定AcMNPV_vp6. 9敲除和修復的桿狀病毒質粒構建物的病毒復制能力。(A)轉座到多角體蛋白基因座中的表達盒的示意圖。制造了兩種修復構建物(AcMNPV p6. 9和SeMNPV p6. 9基因,二者都由AcMNPV p6. 9啟動子驅動)。用于轉染測定的桿狀病毒質?;蚪M骨架在左側標出。使用野生型AcMNPV (bM0N14272)桿狀病毒質粒作為病毒復制的陽性對照。Ac-gp64null桿狀病毒質粒被用作陰性對照,代表了具有“單細胞感染”表型的原型桿狀病毒質粒。(B)時間過程熒光顯微術,其顯示了用標出的桿狀病毒質粒構建物轉染的Sf9細胞中感染的傳播。在轉染后的指定時間通過EGFP檢測來檢查病毒感染的進展。在P. t. 120小時時,收集細胞培養(yǎng)上清液以啟動二次感染。(C)二次感染測定法。在P. i. 72小時時進行EGFP檢測以指示感染的進展。(D) AcMNPV_p6. 9null (a)、用 AcMNPV ρ6· 9 拯救的 AcMNPV-p6. 9null (b)和用 SeMNPV ρ6· 9 拯救的 AcMNPV-p6. 9null(c)構建物與野生型(Ac-wt)桿狀病毒質粒的生長曲線的比較。將Sf9細胞用5. Ομ g來自每種桿狀病毒質粒的DNA進行轉染,在轉染后指定時間點收獲細胞培養(yǎng)上清液,并通過TCID50終點稀釋測定法分析感染性芽生型病毒的產(chǎn)生。通過監(jiān)測EGFP表達來確定感染性。點表示從三次獨立轉染產(chǎn)生的平均滴度,誤差條表示標準偏差。圖14 :細胞、BV 和 ODV 中 Flag:vp80 的 Western 印跡分析感染的昆蟲細胞中vp80表達的時間過程。將Sf9細胞用Ac-Δ vp80_Flag · vp80修復病毒進行感染,并在指定時間點收獲。從P. i. 12h至72h,通過western印跡分析可以檢測到作為約95kDa條帶的Flag *VP80。此外,從p. i. 48h至72h,積累了 80kDa的第二個Flag ·νΡ80特異性條帶。使用微管蛋白作為內部上樣對照。(A)VP80與BV的核衣殼級分結合。P. i.兩日,通過在蔗糖梯度中等速超離心來純化BV,并通過基于Nonidet-P40的提取分離成核衣殼(Ne)和包膜(Env)級分。在Ne級分中檢測到作為雙帶的Flag ·νΡ80,其分子量 介于在被感染的Sf9細胞中檢測到的兩種變體(80-kDa和95-kDa)之間(上圖)。正確分離成Ne和Env級分通過抗VP39和抗GP64抗體來控制(下圖)。(B) VP80也是ODV-核衣殼的結構組分。將 Sf9 細胞用 Ac-Λ Vp80-Flag ·νρ80 (Μ0Ι=25)和 AcMNPV 毒株 Ε2 (M0I=5)病毒共感染。P. i. 5天,ODV從包涵體釋放,隨后分離成核衣殼(Ne)和包膜(Env)級分。Western印跡分析顯示VP80作為 80kDa的單一條帶存在于DV Ne級分中。正確分級成Ne和Env級分使用抗PIF-I抗血清來控制(下圖)。圖15.通過反式互補對BV生產(chǎn)缺陷的Ac_vp80null桿狀病毒質粒進行功能互補。(A)通過Western分析在轉基因的Sf9衍生細胞系(Sf9_vp80)中檢測FLAG:VP80。使用微管蛋白作為內部上樣對照。(B)在用Ac-Avp80桿狀病毒質粒轉染(i)或感染(ii)的Sf9-vp80細胞中,感染后的時間過程熒光顯微術(EGFP)(a,b)。在p. t. 120小時時,收集細胞培養(yǎng)上清液以在Sf9-vp80 (a)或Sf9 (b)細胞中啟動二次感染(右側的圖)。作為陰性對照,將Ac_AVp80在Sf9細胞中繁殖(C),使用在Sf9細胞中繁殖的Ac_wt (d)作為陽性對照。(C)感染性BV毒粒的比較性釋放。將Sf9-vp80細胞用Ac-AVp80桿狀病毒質粒轉染,并將Sf9細胞用Ac-AvpSO (陰性對照)或Ac-wt (陽性對照)桿狀病毒質粒進行轉染。在P.t.6日通過終點稀釋法對細胞培養(yǎng)上清液中的BV進行定量。顯示了三次獨立測定的代表性結果,誤差條表示SD。圖16.通過反式互補的復制缺陷型桿狀病毒毒種分析外來基因表達。將Sf9細胞用 Ac-wt、Ac-Avp80_Flag:vp80 或 Ac_Avp80 毒種(M0I=10TCID5Q 單位 / 細胞)感染,所有病毒都從極晚期PlO啟動子表達egfp。(A)在48h p. i.,通過Western印跡分析EGFP、Flag:VP80和GP64的存在。使用肌動蛋白作為內部上樣對照。(B)在72h p. i.時表達EGFP的細胞的顯微照片(上),以及在P. i 48和72h通過ELISA測量的EGFP的相對量(下)。(C)p. i. 72h時表達EGFP的細胞的顯微照片(上),以及通過TCID5。滴定來分析BV釋放以測試回復體基因型(下)。顯示了三次獨立測定的結果,并帶有誤差條(SD) (B和C)。圖17.為生產(chǎn)不含污染性桿狀病毒毒粒的生物藥品設計的新的桿狀病毒-昆蟲細胞技術方法。(A)昆蟲細胞的工程化,以表達必需病毒因子(vp80)來補償病毒中的vp80突變。轉基因Sf9細胞編碼vp800RF和抗性基因,允許基于抗生素篩選轉基因細胞。(B)BV和ODV毒粒生產(chǎn)缺陷的Ac- Δ vp80桿狀病毒質粒的產(chǎn)生。桿狀病毒質粒缺少整個vp80ORF。(C)在工程化Sf-vp80細胞中通過反式互補產(chǎn)生桿狀病毒毒種儲用物。將Sf9-vp80細胞用Ac-Λ vp80桿狀病毒質粒轉染以產(chǎn)生反式互補的病毒后代。在芽生型病毒繁殖后,在Sf9-vp80包裝細胞中生產(chǎn)高滴度病毒儲用物。(D)基于桿狀病毒的重組蛋白表達。將常規(guī)Sf9細胞用反式互補的芽生型病毒后代進行感染。從極晚期桿狀病毒啟動子(plO或polh)表達重組蛋白,其允許高水平的表達,同時不產(chǎn)生污染的桿狀病毒毒粒(BV/0DV)。
      實施例實施例I材料與方法昆蟲細胞和病毒將草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) (Sf9)細胞在標準條件下維持在 SF900-II無血清培養(yǎng)基(Invitrogen)中。帶有在極晚期多角體蛋白啟動子控制之下轉座到多角體蛋白基因座中的的egfp報告基因的重組桿狀病毒質粒(bacmic)來源的AcMNPV病毒(AcMNPV-EGFP),根據(jù)Plman等(2006)獲得。將病毒在Sf9細胞中進行繁殖,并通過終點稀釋測定法測定其滴度。dsRNA的體外合成用于合成dsRNA的方法與Ramadan等(2007)描述的方法類似,進行了少量修改。所有DNA模板使用具有與T7RNA聚合酶啟動子序列5’-gcttctaatacgactcactataggg_3’同源的25個核苷酸突出部分的引物,通進行PCR擴增。下面指明的引物序列提供在表I中。使用了下列引物來擴增這些基因引物vp39-F和vp39-R用于vp39 ;引物45510和46235用于 vpl054 ;引物 90292 和 90889 用于 vp80 ;引物 ec-27-F 和 ec-27-R 用于 odv_ec27 ;引物dbp-F和dbp-R用于dbp。為了測試RNAi研究的效率,我們使用弓I物gfp-F和gfp-R制造了針對egfp的dsRNA,并且為了獲得陰性對照,我們使用引物cat-F和cat_R制造了用于氯霉素こ酰轉移酶(cat)基因的dsRNA。使用Illustra GFX PCR DNA 和 Gel Band 純化試劑盒(GEHealthcare, Buckinghamshire, UK)純化 PCR 產(chǎn)物,并將其用作模板,使用 T7RiboMAX Express RNAi系統(tǒng)(Promega, Madison, WI, USA),按照制造商的方案進行dsRNA體外合成。簡單來說,使用約I μ g純化的DNA模板,在37°C下進行4小時的RNA合成。在合成后,通過用DNase消化來除去DNA模板。通過在70°C溫育10分鐘,然后緩慢冷卻至室溫( 30min),使互補的RNA鏈退火。通過RNase A處理(30min,37°C )來降解未退火的(單鏈)RNA分子。最后,將dsRNA用異丙醇沉淀,重懸浮在DEPC處理過的無菌水中至終濃度為0. 5-lmg/ml,并通過瓊脂糖凝膠電泳檢查其純度和完整性。將dsRNA以40 μ I的等份保持在-80°C下。在即將轉染之前,將dsRNA在冰上融化。桿狀病毒感染的昆蟲細胞中的RNAi程序在28°C下,將Sf9細胞接種到24孔組織培養(yǎng)板(2X105細胞/孔)中的ImlSf900-11無血清培養(yǎng)基中。2小時后,除去培養(yǎng)基,并將細胞在標準條件下用重組桿狀病毒AcMNPV-EGFP以IOTCID50單位/細胞的感染復數(shù)(Μ0Ι)感染Ih0感染后(p. i. ) I小時,通過基于Cellfectin (Invitrogen)的轉染,在Grace無血清培養(yǎng)基中將dsRNA (20 μ g/孔)導入到細胞中。4h后,將轉染混合物用Sf900-II無血清培養(yǎng)基替換。感染后將細胞在28°C下溫育總共48h,然后通過以IOOOXg離心5分鐘進行收獲,用于Western印跡和電子顯微術分析。但是,在P. i. 36h收獲五分之一的培養(yǎng)基,并用于通過終點稀釋測定法滴定芽生型毒?;蛴糜诓《綝NA的基于PCR的檢測。在所有實驗中,將對應于cat基因的dsRNA作為陰性對照。另ー方面,使用egfp基因特異性dsRNA作為用于RNAi程序的陽性對照。SDS-聚丙烯酰胺電泳和western印跡分析為了進行免疫檢測,將Sf9細胞在pH 6.8的125禮Tris - HC1、2%十二烷基硫酸鈉(SDS)、5%2-巰基乙醇、10%甘油、O. 001%溴酚藍中,在95°C下破碎IOmin。將蛋白在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中分離,然后通過半干電印跡轉移到Immobilon-P膜(Millipore)上。將膜在含有2%脫脂奶粉的IXPBS中阻斷30分鐘,然后在室溫下與兔多克隆抗GFP抗血清(Molecular Probes)、兔多克隆抗VP39抗血清或單克隆抗α-微管蛋白抗體(Sigma-Aldrich)溫育I小時,所有抗血清和抗體都在含有O. 2%奶粉的IXPBS中1/2000 稀釋。在IXPBS中洗滌(3Χ IOmin)后,將膜與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG或兔抗小鼠IgG抗體(Sigma)的1/4000稀釋液進行溫育。在AP緩沖液(IOOmM Tris-Cl [pH 9. 5],IOOmM NaCl, 5mM MgCl2)中進行最終洗滌(3X IOmin)后,使用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽硝基四氮唑藍(NBTV5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP) (Bio-Rad),按照制造商的說明書對印跡進行顯色。病毒基因組DNA的制備及其基于PCR的檢測在p. i.36h收集200微升細胞培養(yǎng)基并用于制備病毒DNA。通過以IOOOXg離心5分鐘,從樣品中除去細胞和細胞碎片。將含有芽生型毒粒的上清液定量轉移到新的無菌管中,并以12000Xg再次離心90分鐘。將沉淀的BV重懸浮在200 μ I含蛋白酶K (540 μ g/ml)的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl [pH 7. 5],ImM EDTA)中,并在55°C下溫育2h。相繼進行苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)和氯仿抽提。通過加入等量異丙醇使DNA沉淀,并將沉淀物用70%こ醇清洗。將DNA沉淀物溶解在15 μ I無菌水中,并將2 μ I最終的DNA溶液應用于使用上面提到的引物對νρ39基因序列進行的基于PCR的檢測。所有PCR反應在25 μ I體積中進行,其中包括2 μ I DNA, 200 μ M dNTP,IOpmol 每種引物,I. 5mM MgCl2 和 I. 5U GoTaq DNA聚合酶(Promega)。擴增條件如下初始變性在94°C進行2min,隨后進行30個循環(huán)的變性(94°C下30s)、引物退火(60°C下20s)和引物延伸(72°C下25s)。終結循環(huán)是72。。下7min。在所有PCR擴增中包含陰性對照以測試試劑中的污染物。將等份(3. 0μ I)的PCR產(chǎn)物在I. 2% (w:v)瓊脂糖凝膠中使用IXTAE緩沖液通過電泳進行分析,使用溴化こ錠(0. 5 μ g/ml)進行染色。無抗生素抗性基因的AcMNPV vp80_null桿狀病毒質粒的產(chǎn)生為了確定VP80蛋白在病毒后代產(chǎn)生中是否具有必不可少的作用,我們在大腸桿菌中通過同源重組構建了帶有vp80 ORF缺失的AcMNPV桿狀病毒質粒(源自于bM0N14272(來自Invitrogene))。為此,使用PCR引物vp80-K0_F和vp80_K0-R (參見表1),從包含側翼帶有突變LoxP位點的cat基因的質粒擴增了側翼帶有突變LoxP位點的cat基因(Suzuki等,2005)。將得到的含有側翼帶有突變LoxP位點的cat基因并且在vp800RF的5’或3’鄰近區(qū)含有AcMNPV的 50-bp同源序列的PCR片段用DpnI處理,并進行凝膠純化以消除模板質粒。然后將PCR產(chǎn)物轉化到按照下述方式制備的含有bM0N14272 (Invitrogen)和產(chǎn)Lambda RED重組酶的質粒pKD46的DHlO β大腸桿菌細胞中(Datsenko & Wanner, 2000)。將轉化的DHlO β -bM0N14272/pKD46大腸桿菌細胞,在有卡那霉素(50 μ g/ml)、氨芐青霉素(100μ g/ml)和 L-阿拉伯糖(I. 5mg/ml)的 50_mlLB(2. 0% 蛋白胨,O. 5% 酵母提取物,85. 5mMNaCl,[pH 7. O])培養(yǎng)基中,在30°C下生長至OD6tltl為^ O. 6,然后通過標準程序制造電感受態(tài)。將電穿孔的細胞在3ml LB培養(yǎng)基中在37°C下溫育3h,并在含濃度為6. 5 μ g/ml的氯霉素的LB瓊脂上鋪板。在37°C溫育48-h后,將氯霉素抗性菌落在有34 μ g/ml氯霉素的新鮮LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線。將板在37°C溫育過夜,挑選對氯霉素有抗性的菌落,以備通過PCR進ー步驗證相關基因型。使用引物90292和90889來證實vp80 ORF的不存在,并利用引物cat-F和cat-R來驗證桿狀病毒質粒中cat盒的存在(詳細序列在表I中)。為了從桿狀病毒質粒骨架上消除引入的抗生素抗性基因(cat),使用了 Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)。將從Jeanine Louwerse (LUMC Leiden,荷蘭)獲得的帶有Cre重組酶的質粒PCRE導入DH10b-bM0N14272-vp80null大腸桿菌細胞,隨后通過添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導CRE表達。簡單來說,將電穿孔的細胞在3ml LB培養(yǎng)基(2. 0%蛋白胨,O. 5%酵母提取物,85. 5mM NaCl, [pH 7. O])中在37°C下溫育3h,并在含50 μ g/ml卡那霉素、100 μ g/ml氨芐青霉素和2mM IPTG的LB瓊脂培養(yǎng)基上鋪板。在24_h溫育后,選擇對卡那霉素和 氨芐青霉素有抗性的菌落,通過PCR進ー步驗證所需基因型。在基于PCR的分析中,使用引物89507和91713 (表I)來驗證cat基因從桿狀病毒質粒骨架上的消除。陽性克隆也通過DNA測序來驗證。為了恢復轉座能力,將編碼轉座酶的輔助質粒pM0N7124 (Invitrogen)再引入到DHlO β -bM0N14272-vp80null大腸桿菌細胞中。最后,將egfp報告基因引入到vp80_null桿狀病毒質粒中以便于觀察它在昆蟲細胞中的行為。簡單來說,使用寡核苷酸gfp-Nhel-F和gfp-Sphl-R (表I)從質粒pEGFP-N3 (Clontech)通過PCR擴增egfp報告基因。使用CloneJET PCR克隆試劑盒(Fermentas),按照制造商的方案將PCR產(chǎn)物克隆到質粒pjetl. 2/Blunt中。然后使用NheI和SphI將egfp ORF從無錯誤的pjetl. 2-egfp上切下,并亞克隆到Nhel/SphI消化的pFastBacDUAL (Invitrogen)中,以產(chǎn)生質粒pFB-egfp。按照Bac-to-Bac手冊■ (Invitrogen)中所描述的,將含有在極晚期plO啟動子的轉錄控制之下的egfp報告基因的表達盒從pFB-egfp轉座到vp80_null桿狀病毒質粒的多角體蛋白基因座中。在得到的基因組中,完整的vp80 ORF已被移除(參見圖2)。這對應于在SEQ ID NO: I中提供的AcMNPV克隆C6基因組中,從89564至91637位核苷酸的2074bp缺失。修復的vp80_null桿狀病毒質粒的構建為了制備vp80修復供體載體,我們通過移除多角體蛋白啟動子并將其用含有vp80啟動子區(qū)和vp800RF的片段代替,對質粒pFB-egfp (上面提到的)進行修飾。首先,使用引物pvp80-StuI-F和vp80-XbaI-R (表1),從桿狀病毒質粒bM0N14272模板擴增了含有vp80啟動子和ORF序列兩者的2300-bp片段,并克隆到載體pjetl. 2/Blunt (Fermentas)中以形成pjetl. 2-pvp80-vp80o在DNA序列驗證后,通過Stul/Xbal雙消化將vp80盒從pjetl. 2-pvp80-vp80上切下,然后亞克隆到Bstll07I/XbaI消化并凝膠純化的pFB-egfp中,以產(chǎn)生供體質粒pFB-egfp-pvp80-vp80。平行地,構建其中vp800RF由極晚期多角體蛋白啟動子(polh)驅動的供體質粒pFB-egfp-polh-vp80。為此目的,使用引物vp80-SacI_F和vp80-XbaI-R (表I)擴增帶有vp800RF的2105-bp片段,并將其克隆到pjetl. 2/Blunt中以產(chǎn)生pjetl. 2-vp80。在最后步驟中,將vp800RF從pjetl. 2_vp80上切下(Sacl/Xbal),并亞克隆到Sacl/Xbal消化的pFB-egfp中以產(chǎn)生pFB-egfp-polH_vp80。為了克服與不能獲得抗VP80抗體相關的問題,執(zhí)行了 VP80的FLAG標簽裝飾(N-和C-端融合)以便于免疫檢測。N-端融合的FLAG-vp80序列通過雙步驟PCR策略、即所謂的融合PCR來產(chǎn)生。首先,使用弓I物pvp80-StuI-F和vp80_FLAG-Rl,從bM0N14272桿狀病毒質粒模板通過PCR擴增含有vp80啟動子和FLAG標簽的259_bp片段。在凝膠純化和DNA定量后,將259-bp片段在使用反向引物vp80-XbaI-R在bM0N14272桿狀病毒質粒模板上進行的第二步PCR擴增中用作正向引物。將最終的PCR產(chǎn)物(2324bp)克隆到載體pJet1. 2/Blunt(Fermentas)中以形成 pjetl. 2-pvp80-FLAG_vp80。DNA 序列驗證后,通過 Stul/Xbal雙消化將FLAG-vp80盒從pjetl. 2-pvp80-FLAG-vp80上切下,然后亞克隆到Bstll07I/XbaI消化并凝膠純化的pFB-egfp中,以產(chǎn)生供體質粒pFB-egfp-pvp80-FLAG_vp80。使用pvp80-StuI-F和vp80-FLAG-R從bM0N14272桿狀病毒質粒模板擴增C-端融合的vp80_FLAG
      盒。將2324-bp片段克隆到pjetl. 2/Blunt中,然后以與上述構建物類似的方式轉移到pFB-egfp 中 ο按照Bac-to-Bac方案(Invitrogen),將所有產(chǎn)生的供體質粒的插入片段轉座到vp80-null桿狀病毒質粒中。polh基因座中轉座陽性構建物的篩選通過基于三重PCR的測定法來進行,在所述測定法中使用了 M13正向和反向引物以及慶大霉素抗性基因特異性引物 GenR (表 I)。轉染-感染測定法按照Bac-to-Bac手冊■( Invitrogen),從攜帶有具有插入異源基因的桿狀病毒質粒的2到3個獨立菌落的I. 5-ml過夜細菌培養(yǎng)物制備桿狀病毒質粒DNA,并平行地進行分析。為了進行轉染,通過在Bac-to-Bac (Invitrogen)手冊■中所描述的基于Cellfectin 的轉染方案,在6孔板中使用I μ g每種桿狀病毒質粒DNA制備物來轉染I X IO6個Sf9細胞。在轉染后(P. t. )72h至120h,通過熒光顯微術檢查病毒繁殖。在p. t. 120h吋,將細胞培養(yǎng)基以2000 Xg離心5分鐘以除去細胞碎片,并將該澄清的上清液用于在6孔板中感染I. 5X IO6個Sf9細胞。在p. i.72h時,再次通過熒光顯微術監(jiān)測病毒感染的傳播。在所有實驗中,使用帶有在PlO啟動子控制之下的egfp報告基因的野生型bM0N14272桿狀病毒質粒作為陽性對照。也帶有在PlO啟動子控制之下的egfp報告基因的bM0N14272-gp64null桿狀病毒質粒用作陰性對照,因為它已失去在細胞間感染移動的能力(Lung等,2002)。細胞培養(yǎng)物中病毒繁殖的時間過程表征執(zhí)行了時間過程分析以比較AcMNPV_vp80null病毒和各種修復構建物與野生型AcMNPV桿狀病毒質粒(Ac-wt)相比的芽生型病毒生產(chǎn),它們都含有egfp。簡單來說,在28°C下,將Sf9細胞接種在6孔組織培養(yǎng)板(I X IO6個細胞/孔)中的Iml無血清Sf900_II培養(yǎng)基中。2小時后,除去培養(yǎng)基,并在Bac-to-Bac手冊'(Invitrogen)中推薦的標準條件下,將細胞用5 μ g桿狀病毒質粒DNA進行轉染。在p. t. 24、48、72、96和120h時收獲細胞培養(yǎng)上清液,并通過終點稀釋測定法分析感染性芽生型病毒的生產(chǎn),以確定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tlX感染通過監(jiān)測egfp表達(來自于P 10啟動子)來確定。計算源自于三次獨立轉染的感染滴度的平均值并作圖。透射電子顯微術
      將昆蟲Sf9細胞接種在25T三角瓶中(3. 5X106個細胞/瓶),并用20 μ gAc-Δ νρ80、拯救Ac-Δ νρ80_νρ80或Ac-wt桿狀病毒質粒構建物轉染。p. t. 48h后收獲細胞,并按照以前的描述進行制備,用于透射電子顯微術(van Lent等,1990)。使用PhilipsCMl2電子顯微鏡檢查樣品并照相。芽生型病毒生產(chǎn)測定法將昆蟲Sf9細胞接種到兩個25T三角瓶中(3. 5X106個細胞/瓶),并用20 μ g Ac- Δ vp80> Ac- Δ νρ80_νρ80、Ac- Δ νρ80_ρΗ_νρ80、Ac- Δ vp80-FLAG_vp80、Ac-Avp80-Vp80-FLAG或Ac-wt桿狀病毒質粒構建物轉染。p.t.5日,收獲富含BV的細胞培養(yǎng)上清液,并超速離心通過ー層10%蔗糖溶液(25,OOOrpm, I. 5小時,Beckman SW32)。將沉淀的芽生型毒粒重新懸浮在無菌去礦質水中并制備,用于負染電子顯微術、SDS-聚丙烯酰胺電泳或基于PCR的檢測(如上所述)。從感染細胞純化ODV和桿狀結構 通過電子顯微術(EM)分析感染/轉染的昆蟲細胞中ODV和桿狀結構的存在。為此,在p. i. 48h收獲昆蟲細胞,將其裂解,并將細胞裂解液超速離心通過40%蔗糖的TE(lmMTris-HCl pH 7. 4,O. ImMEDTA)緩沖液層(45,OOOrpm,I 小時,Beckman SW55)。將沉淀物重懸浮在無菌去礦質水中,并按照以前的描述通過負染色EM進行分析(van Lent等,1990)。Sf9衍生的表達vp80的轉基因細胞系的開發(fā)為了開發(fā)生產(chǎn)VP80蛋白的細胞系,使用引物vp80-SacI-F和vp80-XbaI_R (表I)擴增帶有vp800RF的2105-bp片段,并將其克隆到pjetl. 2/Blunt中以產(chǎn)生pjetl. 2_vp80。在下一步中,將vp800RF從pjetl. 2_vp80上切下(Sacl/Xbal)并亞克隆到Sacl/Xbal消化的pIZ (Invitrogen)中,以產(chǎn)生pIZ_vp80。將得到的質粒載體pIZ_vp80用Eco57I線性化并進行凝膠純化。將Sf9細胞接種在6孔板中(I X IO6個細胞/孔),并用10 μ g線性化載體轉染。轉染后24小時后,通過含有Zeocin (300 μ g/ml)的細胞培養(yǎng)基對細胞進行2至3周的篩選,直到在同樣條件下沒有對照Sf9細胞存活。然后將細胞作為未克隆的細胞系進行繁殖。AcMNPV vp39_null桿狀病毒質粒的產(chǎn)生和表征為了研究vp39基因在病毒后代產(chǎn)生和核衣殼裝配過程中的作用,我們按照與上面對于AcMNPV vp80null桿狀病毒質粒構建物提到的相同的程序,在大腸桿菌中通過同源重組構建了帶有vp39缺失的AcMNPV桿狀病毒質粒(bM0N14272)。因為vp390RF的序列與兩個側翼0RF(cg-30和lef-4)的啟動子序列交疊,因此為了避免cg-30和lef-4表達的失調控,只能缺失vp390RF的內部部分。為了達到這一點,使用PCR引物vp39-K0_和vp39-K0_R(表1),從包含側翼帶有突變LoxP位點的cat基因的質粒擴增了側翼帶有突變LoxP位點的cat基因。將得到的含有側翼帶有突變LoxP位點的cat基因和與vp390RF的內部區(qū)域同源的 50-bp序列的PCR片段用DpnI處理并凝膠純化,以消除模板質粒。然后將PCR產(chǎn)物轉化到按照上面提到的方式制備的含有桿狀病毒質粒bM0N14272 (Invitrogen)和產(chǎn)LambdaRED重組酶的質粒pKD46的 ΗΙΟβ大腸桿菌細胞中(Datsenko & Wanner, 2000)。在最后步驟中,使用引物75834和76420 (表I),將對卡那霉素有抗性的菌落進行基于PCR的分析,以驗證cat基因從桿狀病毒質粒骨架的插入/消除。陽性克隆通過獲得的PCR產(chǎn)物的DNA測序來進ー步驗證。按照本方案,vp390RF的內部部分(498nt=166aa)被移除,其坐標為圖9中所指示的75894-76391。修復的vp39_null桿狀病毒質粒的構建和分析為了制備vp39修復供體載體,我們通過導入在多角體蛋白啟動子控制之下的vp390RF來修飾質粒pFB-egfp(上面提到的)。起初,使用引物vp39-SacI_F和vp39_XbaI-R(引物序列參見表I)從bM0N14272模板擴增1073-bp的片段,并將其克隆到載體pjetl. 2/Blunt (Fermentas)中以形成pjetl. 2_vp39。在DNA序列驗證后,通過Sacl/Xbal雙消化 將vp390RF從pjetl. 2_vp39上切下,然后亞克隆到Sacl/Xbal消化并凝膠純化的pFB-egfp中,以產(chǎn)生供體質粒pFB-egfp-vp39。在不成功嘗試使用pFB_egfp_vp39拯救AcMNPVvp39null后,制備了ー組新的供體質粒。首先,使用引物vp39_StuI_F和lef-4-XbaI-R從桿狀病毒質粒bM0N14272模板通過PCR產(chǎn)生含有vp39和lef_40RF的2498-bp片段,并克隆到載體 pjetl. 2/Blunt(Fermentas)中以形成 pjetl. 2-vp39_lef-4。在 DNA 序列驗證后,通過Stul/Xbal雙消化將含有vp39和lef-4 ORF的片段從pjetl. 2-vp39-lef-4上切下,然后亞克隆到Stul/Xbal消化并凝膠純化的pFB-egfp中,以產(chǎn)生供體質粒pFB_egfp-vp39_lef-4。平行地,構建了供體質粒pFB-egfp-vp39_cg30,其中vp39和cg_300RF兩者都由極晚期多角體蛋白啟動子驅動,并且cg-300RF也能使用其位于vp39 ORF的3’ -末端內部的天然啟動子。簡單來說,使用引物cg30-XbaI-F和vp39-XbaI-R (上面提到的)擴增帶有vp39和cg-300RF兩者的1868-bp片段,并將其克隆到pjetl. 2/Blunt中以產(chǎn)生 pjet I. 2-vp39-cg30o 將 vp39/cg_30 盒作為 Sacl/Xba 亞克隆到 pFB-egfp 中以產(chǎn)生 pFB-egfp-vp39-cg30。此外,構建了類似的供體載體 pFB-egfp-FLAG-vp39_cg30,其中vp390RF在N-端帶有FLAG標簽。該載體的開發(fā)使用相同的策略,只是使用反向引物vp39-FLAG-SacI-R 代替 vp39_XbaI_R 引物來擴增 vp39/cg_30 盒。按照Bac-to-Bac試劑盒的方案(Invitrogen),將所有開發(fā)的供體質粒轉座到vp39-null桿狀病毒質粒中,并如上面對vp80修復桿狀病毒質粒所詳述的那樣進行篩選。如上對于vp80構建物所述進行功能分析。AcMNPV vpl054_null桿狀病毒質粒的產(chǎn)生和分析為了證實vpl054基因在病毒后代生產(chǎn)和核衣殼裝配中的必不可少的作用,我們按照與用于vpSOnull桿狀病毒質粒構建物相同的程序并進行了少量修改,在大腸桿菌中通過同源重組構建了帶有vpl054缺失的AcMNPV桿狀病毒質粒(bM0N14272)。因為vpl0540RF與必需的Ief-IOORF交疊,因此我們不能移除整個vpl054 0RF,而是只能移除ORF的955-bp核苷酸的3’-末端部分。為了防止在昆蟲細胞中翻譯C-端截短的VP1054突變體,我們決定將第一個翻譯密碼子ATG — Met突變成ACG — Thr0該單個核苷酸取代也將lef-10 ORF的內部32號密碼子(AAT)改變成AAC,但二者都編碼相同的氨基酸(Asn)。為了實現(xiàn)這一點,我們首先使用引物vpl054-K0-F和vpl054-K0-Rl從桿狀病毒質粒bM0N14272(Invitrogen)擴增了 vpl054 ORF 的 5’ -末端。該 214-bp 的 PCR 產(chǎn)物含有 vpl054 ORF 的ATG起始密碼子的突變,導入了用于lef-10 ORF的合成的終止/poly-A信號序列序列,并具有與cat盒同源的3’-末端序列突出端以便于第二步PCR,以及與vpl054 ORF的5’-末端同源的49-bp序列以在大腸桿菌中介導Lambda RED指導的同源重組。在凝膠純化和DNA定量后,第二步PCR中將214-bp的片段用作正向引物,反向引物為vpl054-K0-R2,以包含側翼帶有突變LoxP位點的cat基因的質粒作為模板。將得到的含有側翼帶有突變LoxP位點的cat基因、vpl054 ORF的突變5’ -末端和與vpl054 ORF的5’或3’鄰近區(qū)域同源的 50-bp序列的1230-bp PCR片段,用DpnI進行處理并凝膠純化,以消除模板質粒。該PCR產(chǎn)物與bM0N14272桿狀病毒質粒的重組按照上面對vp80突變體所述來進行。使用引物對cat-F/cat-R、45510/46235、以及45122和46441K,通過PCR來驗證卡那霉素抗性菌落,以檢查cat基因從桿狀病毒質粒骨架的插入/消除。插入位點也通過DNA測序來證實。該方法導致在SEQ ID NO: I所提供的AcMNPV克隆C6基因組中從45365至46319位核苷酸的955bp的缺失。所有引物序列在表I中給出。修復的vpl054_null桿狀病毒質粒構建物的構建為了制備vpl054修復供體載體,我們通過移除多角體蛋白啟動子并將其用含有vpl054啟動子區(qū)和vpl0540RF的片段代替,對質粒pFB-egfp (上面提到的)進行了修飾。首先,使用引物vpl054-Rep-F和vpl054-Rep-R從桿狀病毒質粒bM0N14272模板擴增含有vpl054啟動子和ORF序列兩者的1714-bp片段,并將其克隆到載體pjetl. 2/Blunt(Fermentas)中以形成 pjetl. 2-pvpl054_vpl054。在 DNA 序列驗證后,通過 Stul/Xbal 雙 消化將vpl054盒從pjetl. 2-pvpl054-vpl054上切下,然后亞克隆到Bstll07I/XbaI消化并凝膠純化的pFB-egfp中,以產(chǎn)生供體質粒pFB-egfp-pvpl054_vpl054。按照Bac-to-Bac方案(Invitrogen)將開發(fā)的供體質粒轉座到vpl054_null桿狀病毒質粒中并進行篩選。如上面對vp80桿狀病毒質粒所詳述的那樣來分析重組桿狀病毒質粒。AcMNPVp6. 9-null桿狀病毒質粒的產(chǎn)生和分析為了證實p6. 9在病毒后代產(chǎn)生中的必不可少的作用,我們在大腸桿菌中通過同源重組構建了帶有P6. 9缺失的AcMNPV桿狀病毒質粒(bM0N14272)。為此,使用PCR引物p6. 9-K0-F和p6. 9-K0-R,從包含側翼帶有突變LoxP位點的氯霉素抗性基因(cat)的質粒擴增了這種側翼帶有突變LoxP位點的cat基因。按照與用于其他突變體相同的程序獲得突變體病毒。對于最終獲得的突變體克隆的基于PCR的分析來說,使用引物對cat-F與cat-R以及86596與86995來檢查cat基因從桿狀病毒質粒骨架上的插入/消除。陽性克隆還通過DNA測序來證實。該方法導致在SEQ ID NO: I中提供的AcMNPV克隆C6基因組中從86716至86879位核苷酸的164bp的缺失。引物序列顯示在表I中。修復的p6. 9-null桿狀病毒質粒的構建和功能分析為了制備 ρ6· 9 修復供體載體,使用了 由 Marcel Westenberg (WageningenUniversity)構建的pFB-GFP-p6. 9載體。為了制造該載體,使用高保真擴展長模板PCR系統(tǒng)(Roche),利用引物 pp6. 9-F 和 pp6. 9-R 從質粒 pAcMP KHill-Perkins & Possee, 1990)擴增AcMNPVp6. 9啟動子序列。將PCR產(chǎn)物作為SalI片段克隆到通過事先將Bstll07I與StuI位點融合以缺失多角體蛋白啟動子的pFastBacl (Invitrogen)中,以獲得pFB 1_ρ6· 9。將來自于pFBl-p6. 9的p6. 9啟動子作為SnaBI/BamHI片段重新克隆到pFastBacDUAL(Invitrogen)的Bstll07I和BamHI位點中,由此缺失了多角體蛋白啟動子。隨后,將egfp報告基因克隆到XmaI位點中plO啟動子的下游,以獲得pFB_GFP-p6. 9。最后,通過使用高保真擴展長模板PCR系統(tǒng)和分別在5’和3’末端產(chǎn)生EcoRI和NotI的引物(表1),從AcMNPV桿狀病毒質粒(bM0N14272)或SeMNPV基因組DNA通過PCR擴增了 AcMNPV和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua) (Se) MNPV 的 ρ6· 9 基因。將 PCR 產(chǎn)物克隆到 pFB_GFP_p6. 9 的EcoRI/Notl位點中p6. 9啟動子的下游。對所有產(chǎn)生的克隆進行測序以驗證并入的p6. 9序列。按照Bac-to-Bac方案(Invitrogen),將這兩種開發(fā)的供體質粒的表達盒轉座到p6. 9-null桿狀病毒質粒中。如上對vp80構建物所描述的,通過基于三重PCR的測定法,篩選polh基因座中的轉座陽性構建物。按照對vp80構建物那樣執(zhí)行分析。結果AcMNPV vp80的沉默不影響桿狀病毒極晚期基因表達我們探索了在用AcMNPV-GFP感染期間,用不同dsRNA感染Sf9細胞的效果。為了引發(fā)所選桿狀病毒基因(vpl054、vp39、vp80、dbp和odv_ec27)的dsRNA誘導型沉默,我們使用基于T7RNA聚合酶的體外合成,產(chǎn)生了基因特異性dsRNA。然而,當我們開始這些研究吋,不清楚dsRNA轉染的何種量和時間點對沉默桿狀病毒基因來說最有效。為了確定在桿狀病毒感染的細胞中用于RNAi測定目的的最適dsRNA量,我們首先嘗試用不同量的dsRNA 來沉默egfp報告基因。這些初步測定顯示,使用每個細胞IOOpg dsRNA時獲得了最強有力的RNAi效應(數(shù)據(jù)未顯示)。同時,還證明了 RNAi處理對感染性芽生型毒粒后代的產(chǎn)生沒有負面影響。我們還嘗試了在兩個不同時間點、即感染前24h或p. i. Ih將dsRNA轉染到細胞中。結果證明,在p. i. Ih執(zhí)行的轉染與在感染前24h執(zhí)行的轉染相比,對于在桿狀病毒感染的晩期/極晚期時表達的基因的沉默來說更加有效(數(shù)據(jù)未顯示)。此外,為了確保擊倒是基因特異性的,將對應于cat基因的dsRNA作為RNAi陰性對照進行轉染。在這種情況下,與未轉染的昆蟲細胞相比,我們能夠觀察到桿狀病毒感染傳播的中度抑制。然而,當昆蟲細胞僅用轉染試劑進行處理時,也觀察到相同的現(xiàn)象。因此,我們可以得出結論,該效應可以通過轉染試劑的存在對細胞生存カ的負面影響(細胞毒性)來解釋。桿狀病毒基因的沉默篩選揭不出,vpl054> vp39、dbp和odv/ec_27的下調也與通過EGFP檢測所測量到的極晚期基因表達的降低或抑制相關(圖IA和1B)。在dbp-和odv/ec-27-靶向細胞中觀察到這種抑制的最高水平。這種效應的原因可以通過在桿狀病毒復制周期中產(chǎn)生的雙順反子和交疊的mRNA轉錄本來解釋。最后,該過程可能還涉及與序列相似性有限的靶的交叉反應。只有用vp80 dsRNA處理的細胞顯示出與未轉染細胞或者特別是cat dsRNA處理的細胞相似的EGFP表達水平。重要的是,在導入egfp特異性dsRNA的昆蟲細胞(陽性RNAi對照)中觀察到非常少的EGFP產(chǎn)生細胞,顯示出高轉染效率?;谖覀兊腞NAi篩選成果,在干擾桿狀病毒極晚期基因表達的情形中,vp80基因(基因座)似乎是用于基于RNAi的祀向的適合候選物。
      vp80的擊倒完全阻止了 BV和正常外觀的ODV的產(chǎn)生為了確定所選的候選基因(vpl054、vp39、vp80、dbp和odv/ec_27)在芽生型毒粒后代的生產(chǎn)中的作用,從dsRNA處理細胞的細胞培養(yǎng)基(36h p. i.)中檢測BV的存在?;诮K點稀釋的滴定證實了所有測試的基因對于感染性芽生型病毒后代的產(chǎn)生是必需的(圖1C)。我們不能在vp80-和dbp-靶向細胞中檢測到任何感染性BV。此外,基于PCR的測定表明在vp80-靶向細胞中也不產(chǎn)生缺陷型或非感染性病毒粒子。重要的是指出,結果還顯示,在RNAi對照(egfp-和cat-特異性dsRNA處理的細胞)中,與未轉染細胞相比,感染性BV的生產(chǎn)顯著降低。轉染試劑的細胞毒性再一次成為這種負面效應的推測原因。細胞裂解物的電子顯微術分析顯示,正如預期的,在用dsRNA-vp39處理的細胞中,ODV和桿狀結構的形成被完全抑制(圖1D)。在用dsRNA-vp80處理的昆蟲細胞中,ODV和桿狀結構的產(chǎn)生也顯著降低(圖1D)。然而,在vp80靶向細胞中,我們常常能夠發(fā)現(xiàn)畸形表型(尖形)的核衣売。另ー方面,將dsRNA-cat導入昆蟲細胞不引起ODV生產(chǎn)的任何變化。AcMNPV vp80基因對于病毒復制是必需的按圖2中的詳情構建了 AcMNPV缺失病毒。修復構建物被設計成使野生型vp80 ORF或在N-和C-端帶有FLAG-標簽的vp80基因連同其天然或多角體蛋白啟動子區(qū),與plO啟動子下的egfp基因一起被插入到多角體蛋白基因座中(圖3A)。為了研究vp80基因的功能,將Sf9細胞用敲除或修復桿狀病毒質粒構建物轉染,并通過熒光顯微術監(jiān)測EGFP表達。當將Ac-vp80null導入到Sf9細胞中時,在p. t. 72h至120h時沒有在細胞培養(yǎng)物中觀察到病毒繁殖。我們只能觀察到與Ac-gp64null桿狀病毒質粒的表型類似的“單細胞感染”表型(圖3B)。結果表明,Ac-vp80null能夠達到感染的極晚期,正如通過plO啟動子驅動的EGFP表達所證實的。從p. t. 72h至120小時,在用三種修復(從其天然啟動子驅動的vp80,從多角體蛋白啟動子驅動的vp80和從其天然啟動子驅動的N-端帶有FLAG標簽的vp80)構建物轉染的昆蟲細胞單層中,可以看到廣泛分布的EGFP表達,表明這些桿狀病毒質粒能夠產(chǎn)生的感染性芽生型毒粒的水平足以啟動與野生型桿狀病毒質粒類似水平的二次感染(圖 3B)。相反,在用C-端帶有FLAG標簽的vp80修復構建物轉染的昆蟲細胞中,到p. t. 72h時為止,只在最初感染的分離細胞中觀察到EGFP表達,表明這種桿狀病毒質粒構建物在病毒復制方面有缺陷(圖3B)。然而,到p. t. 96h時觀察到小型噬斑的形成,并且到p. t. 120h吋,發(fā)展出非常少的正常大小的噬斑。結果顯示C-端帶有flag標簽的突變體在芽生型病毒生產(chǎn)中受到強烈延遲,并顯示未修飾的C-端對于VP80的功能非常重要。在p. t. 5天時,去除細胞培養(yǎng)上清液并將其添加到新鮮鋪板的Sf9細胞中,然后溫育3天,以檢測從用這些桿狀病毒質粒轉染的細胞產(chǎn)生的病毒引起的感染。正如預期的,用來自使用修復構建物進行轉染的上清液溫育的Sf9細胞,顯示出大量EGFP表達細胞(圖3C)。然而,用來自C-端帶有FLAG標簽的構建物的上清液溫育的細胞,在EGFP陽性細胞的數(shù)量上顯示出顯著降低。另ー方面,在用來自于使用vp80敲除進行轉染的上清液溫育的昆蟲細胞中,直到72h時,在所分析的任何時間點都沒有檢測到EGFP表達(圖3C)。此外,為了表征vp80基因的缺失對AcMNPV感染的準確效果,在kciUAc- Δ vp80> Ac- Δ vp80-vp80Rep> Ac- Δ vp80-polh-vp80Rep> Ac- Δ vp80-FLAG-vp80Rep 和Ac-Δ vp80-vp80-FLAGRep之間比較了病毒在轉染的Sf9細胞中的繁殖。在指明的時間點,分析所有上述桿狀病毒質粒構建物的細胞培養(yǎng)上清液的BV生產(chǎn)(圖4)。正如預期的,修復的 Ac- Δvp80-vp80Rep 、Ac-Δvp80-polh_vp80Rep 、Ac-Δvp80-FLAG_vp80Rep 病毒顯示出與野生型病毒(Ac-wt)的繁殖一致的病毒復制動力學。與Ac-wt病毒或其他修復的病毒相比,由C-端帶有flag標簽的Ac-AVp80-vp80-FLAGR印病毒產(chǎn)生的芽生型毒粒減少到約O. 06%ο這些結果表明,vp80基因對于感染性BV的產(chǎn)生是必需的。已經(jīng)清楚地證明,vp80ORF的整個序列可以從桿狀病毒質粒骨架上完全缺失,并通過將vp80 ORF導入到基因組的異源位點(多角體蛋白基因座)中充分地拯救。我們還顯示,vp80基因表達可以由異源多角體蛋白啟動子序列來驅動,并對細胞培養(yǎng)物中病毒的復制沒有負面影響。此外,我們觀察到與VP80的C-端相反,N-端允許進行基因修飾(表位標簽標記)。我們注意到當與所有其他拯救或野生型病毒相比吋,C-端帶有FLAG標簽的VP80病毒的動力學被顯著延遲,表明了VP80C-端的功能重要性。BV和ODV兩者的產(chǎn)生需要VP80上面描述的結果表明Ac-vp80null突變體在感染性芽生型病毒的生產(chǎn)上徹底缺陷。然而,還存在著突變體仍能產(chǎn)生非感染性芽生型粒子的可能性。為了調查這種能力,將Sf9細胞用敲除、修復或野生型桿狀病毒質粒構建物進行轉染,并在p. t. 7天對細胞培養(yǎng)基進行超速離心以沉淀芽生型病毒。將形成的沉淀物通過負染色電子顯微術或通過基于Western印跡或PCR的檢測進行分析,以證實芽生型病毒的存在。在來自用Ac-vp80null突變體轉染的細胞的沉淀物中,沒有表現(xiàn)出完整的芽生型病毒、病毒樣粒子或其結構(例如主要衣殼蛋白VP39和病毒基因組序列)(圖5A和5B)。另ー方面,與源自于野生型病毒的芽生型病毒相比,所有被分析的修復構建物產(chǎn)生正常外觀的芽生型病毒(圖5A)。然而,在源自于C-端帶有FLAG標簽的vp80基因修復構建物轉染的細胞的沉淀物中,非常難以發(fā)現(xiàn)代表性芽生型毒粒。
      為了進一步表征vp80基因的缺失對桿狀病毒生命周期的影響,使用從桿狀病毒質粒轉染的細胞產(chǎn)生的超薄切片執(zhí)行了電子顯微術。Ac-Vp80null轉染的細胞典型地發(fā)展出桿狀病毒感染的細胞的表型,其具有膨大的核、片段化的宿主染色質、電子致密的病毒發(fā)生基質等(圖6A)。不存在VP80不阻止在病毒發(fā)生基質內形成正常外觀的核衣殼(圖6C)。所形成的核衣殼在表型上與由Ac-Vp80null修復或Ac_wt桿狀病毒質粒所產(chǎn)生的核衣殼沒有區(qū)別。然而,與用Ac-Vp80null修復或Ac_wt桿狀病毒質粒轉染的細胞相比,裝配的核衣殼的豐度相當?shù)?圖6E和6G)。此外,在Ac-vp80null桿狀病毒質粒轉染的細胞的核質的基質周區(qū)室(所謂的環(huán)區(qū))中,在包膜之前既不能觀察到包埋型毒粒也不能觀察到核衣殼束(圖6B和6D)。在核衣殼的成熟和/或它們從病毒發(fā)生基質的釋放/運輸期間,VP80似乎發(fā)揮作用。最后,VP80對高效核衣殼裝配可能多少有些貢獻,這可以用Ac-vp80null轉染的細胞的病毒發(fā)生基質中存在的少量核衣殼來解釋。當vp80基因被重新導回到桿狀病毒質粒突變體中時,可以在被轉染細胞的環(huán)區(qū)中看到大量核衣殼和包埋型毒粒(圖6F)。在Ac-Λ vp80-vp80修復桿狀病毒質粒轉染的細胞中產(chǎn)生的包埋型毒粒的豐度和形態(tài),與由野生型桿狀病毒質粒產(chǎn)生的相似(圖6F和6H)。VP80的功能可以通過反式作用型vp80基因來互補為了證明VP80的功能可以通過反式作用型vp80 ORF來互補,使用轉基因細胞系Sf9_vp80執(zhí)行了互補測定,該細胞系已用在黃杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)早期桿狀病毒ie-2啟動子控制下表達的vp80基因穩(wěn)定轉化。在測定中,Sf9和Sf9_vp80細胞兩者都用Ac-vp80nul I桿狀病毒質粒突變體轉染(圖7 )。在p. t. 72h和96h,通過EGFP特異性熒光來監(jiān)測病毒感染的傳播。在Sf9-vp80細胞中,我們能夠觀察到證實病毒擴散的病毒噬斑。另ー方面,在Sf9細胞中,正如以前在上文描述的,只能看到“單細胞感染”表型。在6天后,收獲細胞培養(yǎng)上清液,并將其用作接種物感染新鮮的Sf9細胞群。5天后,通過熒光顯微術監(jiān)測EGFP陽性細胞。在接收來自Sf9-vp80細胞的上清液的Sf9細胞中僅觀察到“單細胞感染”表型。正如推測的,在接收來自Sf9細胞的上清液的Sf9細胞中沒有檢測到EGFP信號。這些結果顯示,Ac-vp80null可以通過表達VP80的細胞(Sf9_vp80)來拯救,并且證實了觀察到的互補是由于從宿主細胞系表達的VP80蛋白,而不是來自于從所述細胞系獲取vp80基因。換句話說,該結果與對生產(chǎn)沒有污染性桿狀病毒毒粒的生物藥品(在我們的模型測定法中為EGFP蛋白)所提出的要求相符。vp39_null桿狀病毒質粒的產(chǎn)生和表征為了研究AcMNPV vp39基因在病毒感染期間的功能,通過vp39基因的部分缺失構建了 vp39-null AcMNPV桿狀病毒質粒。缺失構建物通過它對氯霉素的抗性來選擇,該抗性表明發(fā)生了 vp39基因的位點特異性缺失。在得到的vp39-null AcMNPV桿狀病毒質粒中,vp39基因的內部部分正確地被cat基因代替。隨后,通過Cre/LoxP重組來消除cat (圖8A)。根據(jù)AcMNPV克隆C6基因組序列(SEQ ID NO: I ),vp39序列被移除了從75894至76391位核苷酸。使用引物75834和76420,通過PCR驗證了 vp39缺失構建物的結構(圖8B)。當使用野生型AcMNPV桿狀病毒質粒作為模板時擴增到647-bp的DNA片段,而在AcMNPVvp39-null(+cat)模板上能夠擴增到1113-bp的DNA片段(圖8B)。當在PCR分析中使用消除了 cat盒的最終構建物AcMNPV-vp80null (-cat)時,只能檢測到短的183_bp的DNA片段(圖8B)。結果通過DNA測序來證實。
      vp390RF的功能作圖指出了 vp39與cg_300RF之間可推測的功能關系修復構建物被設計成使在多角體蛋白啟動子序列控制之下的野生型vp390RF與PlO啟動子控制的egfp基因一起被插入到多角體蛋白基因座中(圖9A)。為了調查vp39基因的功能,將Sf9細胞用敲除或修復桿狀病毒質粒構建物進行轉染,并通過熒光顯微術監(jiān)測EGFP表達。當Ac-vp39null被導入Sf9細胞時,從p. t. 72h至168h沒有觀察到病毒繁殖。我們只能觀察到與Ac-gp64null桿狀病毒質粒的表型類似的“單細胞感染”表型(圖9B)。這些結果表明,Ac-vp39null構建物能夠到達感染的極晚期,正如由plO啟動子驅動的EGFP表達所顯示的。出人意料的是,在用vp39修復(從多角體蛋白啟動子驅動的vp39, Ac- Δ vp39-polh-vp39Rep)構建物轉染的昆蟲細胞單層中,不能觀察到病毒繁埴(圖3B)。為此,我們決定制備三種額外的修復桿狀病毒質粒,其攜帯在其天然啟動子控制之下的vp39和lef-4 ORF兩者。當用這些修復構建物轉染昆蟲細胞時,同樣沒有發(fā)生病毒復制(圖9B),并從p. t. 72h至168h觀察到“單細胞感染”表型。有趣的是,在用帶有vp39 (或帶有FLAG標簽的vp39)和cg-30兩者的修復構建物轉染的昆蟲細胞單層中,我們能夠觀察到極小簇的EGFP陽性細胞(3-5個細胞)(圖9B)。然而,我們沒有看見與野生型載體(Ac_wt)相同的全價病毒復制。在p. t. 7天吋,收集細胞培養(yǎng)上清液并添加到新鮮鋪板的Sf9細胞中,然后將其溫育3天,以檢測由這里提到的所有桿狀病毒質粒轉染的細胞產(chǎn)生的病毒所引起的感染(圖9C)。正如預期,用來自Ac-wt轉染的上清液溫育的Sf9細胞顯示出大量表達EGFP的細胞。另一方面,用來自 Ac- Δ vp39_polh_vp39Rep 和 Ac- Δ vp39_vp39-lef_4Rep 構建物的上清液溫育的細胞沒有顯示任何EGFP陽性細胞。然而,在用來自Ac-Avp39-Vp39-cg30R印和Ac-Avp39-FLAG-vp39-Rep的上清液溫育的昆蟲細胞中,檢測到大量表達EGFP的細胞(圖9C)。這些結果表明了 vp39與cg-300RF之間的可能的功能關系是桿狀病毒復制所需要的。因為Vp390RF序列與兩側的ORF (lef-4和cg_30)的啟動子序列交疊,因此我們不能在我們的vp39null桿狀病毒質粒構建物中缺失整個vp390RF。因此也有可能可以表達vp39的C-和/或N-端截短的突變體,其可能作為競爭性抑制劑干擾正常的VP39蛋白。vpl054-null桿狀病毒質粒的構建和分析
      為了研究AcMNPV vpl054基因在病毒感染期間的功能,在大腸桿菌中通過同源重組從AcMNPV桿狀病毒質粒(bM0N14272)中部分缺失vpl054基因,構建了 vpl054_nullAcMNPV桿狀病毒質粒。缺失構建物通過它對氯霉素的抗性來選擇,所述抗性表明發(fā)生了vpl054基因的位點特異性缺失。在得到的vpl054-null AcMNPV桿狀病毒質粒中,vpl054基因的955-bp的3'-末端部分準確地被cat基因代替。隨后,使用Cre/LoxP重組系統(tǒng)從桿狀病毒質粒骨架中消除抗生素抗性表達盒(cat)(圖10A)。根據(jù)AcMNPV克隆C6基因組序列(SEQ ID NO: 1),缺失的序列從核苷酸坐標45365至46319被移除。通過PCR證實所有缺失構建物的結構(圖10B)。當vpl054基因存在吋,正如在親代野生型AcMNPV桿狀病毒質粒中那樣,使用引物45510和46235能夠擴增到775_bp的PCR產(chǎn)物,而在AcMNPVvpl054null (+cat)構建物的情況下,當cat基因被導入桿狀病毒質粒序列中時,使用cat_F和cat-R引物擴增只產(chǎn)生596-bp的PCR片段(圖10B)。正確的重組過程也通過使用引物45122和46441進行vpl054基因座的PCR作圖來證實。當使用野生型AcMNPV桿狀病毒質粒作為模板時,擴增到1320-bp的DNA片段,而在AcMNPV vpl054-null (+cat)模板上能夠擴增到1353-bp的DNA片段(圖10B)。當在PCR分析中使用消除了 cat盒的最終構建物AcMNPV-vpl054null(-cat)時,只能檢測到423_bp的DNA片段(圖10B)。陽性克隆通過DNA 測序成功地驗證。AcMNPV vpl054基因是病毒復制所必需的修復構建物被設計成使帶有其天然啟動子區(qū)的AcMNPV vpl0540RF與在plO啟動子控制下的egfp基因一起被插入到多角體蛋白基因座中(圖11A)。因為vpl054啟動子和ORF序列與lef-10 ORF交疊,因此修復構建物也能表達LEF-10。為了調查vpl054基因的功能,將Sf9細胞用vpl054敲除或修復桿狀病毒質粒構建物轉染,并通過熒光顯微術監(jiān)測EGFP表達。當Ac-vpl054null構建物被導入到Sf9細胞中時,在p. t. 72h至120h時在細胞培養(yǎng)物中沒有觀察到病毒繁殖。我們只能觀察到與Ac-gp64null桿狀病毒質粒的表型類似的“單細胞感染”表型(圖11B)。結果表明Ac-vpl054null能夠達到感染的極晚期,正如由PlO啟動子驅動的EGFP表達所證實的。換句話說,結果表明,晚期表達因子10、即LEF-10的表達在vpl054-null桿狀病毒質粒突變體中不受影響。從p. t. 72h至120小時,在用修復構建物(Ac-Avp1054-vpl054)轉染的昆蟲細胞單層中可以看到廣布的EGFP表達。結果表明修復桿狀病毒質粒能夠產(chǎn)生感染性芽生型毒粒,其水平足以引起與野生型桿狀病毒質粒類似水平的二次感染(圖11B)。在p.t.6天,取出細胞培養(yǎng)上清液并添加到新鮮鋪板的Sf9細胞中,然后將其溫育3天,以檢測由這些桿狀病毒質粒轉染的細胞產(chǎn)生的病毒所引起的感染。正如預期,用來自修復構建物轉染的上清液溫育的Sf9細胞顯示出大量表達EGFP的細胞(圖11C)。另ー方面,在與來自用Ac-vpl054null敲除進行的轉染的上清液一起溫育的昆蟲細胞中,在長達72h的所分析的任何時間點沒有檢測到EGFP表達(圖11C)。這些結果表明vpl054基因是感染性BV生產(chǎn)所必需的。已經(jīng)清楚地證明,vpl054ORF的955-bp的3’-末端序列部分可以從桿狀病毒質粒骨架上完全缺失,并通過將AcMNPVvpl0540RF導入到基因組的異源位點(多角體蛋白基因座)中來充分拯救。此外,結果證明了 vpl054基因的缺失不影響極晚期基因表達,正如由用Ac-vpl054null桿狀病毒質粒突變體轉染的細胞中的EGFP陽性細胞所證實的(圖11B)。p6. 9-null桿狀病毒質粒的產(chǎn)生和表征
      為了研究AcMNPV p6. 9基因在病毒感染期間的功能,在大腸桿菌中通過同源重組從AcMNPV桿狀病毒質粒(bM0N14272)缺失p6. 9基因,構建了 vp6. 9-null AcMNPV桿狀病毒質粒。該缺失構建物通過它對氯霉素的抗性來選擇,所述抗性表明發(fā)生了 P6. 9基因的位點特異性缺失。在得到的p6. 9-null AcMNPV桿狀病毒質粒中,p6. 9基因正確地被cat基因代替。隨后,使用Cre/LoxP重組系統(tǒng)從桿狀病毒質粒骨架中消除抗生素抗性盒(cat)(圖12A)。根據(jù)AcMNPV克隆C6基因組序列(SEQ ID NO: I),缺失的序列從翻譯起始密碼子(ATG —Met)至終止密碼子(TAT —Tyr)、即核苷酸坐標86716至86879被移除。p6. 9 orf的終止密碼子沒有被移除,因為其序列與側翼的lef-5 orf的終止密碼子交疊。通過PCR證實所有缺失構建物的結構(圖12B)。當p6. 9基因存在時,正如在親代野生型AcMNPV桿狀病毒質粒中那樣,在AcMNPV p6. 9null(+cat)構建物的情況下,當cat基因被導入桿狀病毒質粒序列中時,使用cat-F和cat-R引物只能擴增596_bp的PCR片段(圖12B)。正確的重組過程也使用引物86596和86995通過p6. 9基因座的PCR作圖來證實。當使用野生型AcMNPV桿狀病毒質粒作為模板時,擴增到400-bp的DNA片段,而在AcMNPV p6. 9-null (+cat)模板上能夠擴增到1220-bp的DNA片段(圖12B)。當在PCR分析中使用消除了 cat盒的最終構建物AcMNPV-p6. 9null (-cat)時,只能檢測到290_bp的短DNA片段(圖12B)。陽性克隆通過DNA測序成功地驗證。AcMNPVp6.9基因是病毒復制所必需的修復構建物被設計成使帶有AcMNPV p6. 9啟動子區(qū)的野生型AcMNPV或SeMNPVP6.90RF與plO啟動子控制下的egfp基因一起被插入到多角體蛋白基因座中(圖13A)。為了調查p6. 9基因的功能,將Sf9細胞用p6. 9敲除或修復桿狀病毒質粒構建物轉染,并通過熒光顯微術監(jiān)測EGFP表達。當Ac-p6. 9null被導入到Sf9細胞中時,在p. t. 72h至120h在細胞培養(yǎng)物中沒有觀察到病毒繁殖。我們只能觀察到與Ac-gp64null桿狀病毒質粒的表型類似的“單細胞感染”表型(圖13B)。結果表明Ac-p6. 9null能夠達到感染的極晚期,正如由PlO啟動子驅動的EGFP表達所證實的。從p. t. 72h至120小時,在用兩種修復構建物(Ac-Ap6. 9-Acp6. 9和Ac_Ap6. 9-Sep6. 9)轉染的昆蟲細胞單層中可以看到廣布的EGFP表達。結果表明這兩種修復桿狀病毒質粒能夠產(chǎn)生感染性芽生型毒粒,其水平足以引起與野生型桿狀病毒質粒類似水平的二次感染(圖13B)。在p. t. 6天,取出細胞培養(yǎng)上清液并添加到新鮮鋪板的Sf9細胞中,然后將其溫育3天,以檢測由這些桿狀病毒質粒轉染的細胞產(chǎn)生的病毒所引起的感染。正如預期,與來自用修復構建物轉染的上清液一起溫育的Sf9細胞顯示出大量表達EGFP的細胞(圖13C)。另ー方面,在與來自用Ac-p6.9null敲除進行轉染的上清液一起溫育的昆蟲細胞中,在長達72h的所分析的任何時間點沒有檢測到EGFP表達(圖13C)。此外,為了表征p6. 9基因的缺失對AcMNPV感染的準確影響,在Ac-wt、Ac-Ap6. 9、Ac-Ap6. 9-Acp6. 9R印、Ac-Ap6. 9-Sep6. 9Rep之間比較了病毒在被轉染Sf9細胞中的繁殖。在指定時間點,分析了所有上述桿狀病毒質粒構建物的細胞培養(yǎng)上清液的BV生產(chǎn)(圖13D)。正如預期,修復的Ac- Δ p6. 9~Acp6. 9Rep和Ac- Δ ρ6· 9_Sep6. 9Rep病毒顯不出與野生型病毒(Ac-wt)的繁殖相一致的病毒復制動力學。這些結果表明p6. 9基因是感染性BV生產(chǎn)所必需的。已經(jīng)清楚地證明,p6. 9 ORF的整個序列可以從桿狀病毒質粒骨架上完全缺失,并通過將AcMNPV vp80 ORF導入到基因組的異源位點(多角體蛋白基因座)中來充分拯救。我們還顯示,P6. 9基因可以通過源自于SeMNPV的ρ6· 9 ORF來有效互補(M. Westenberg)。此外,結果證明了 ρ6· 9基因的缺失不影響極晚期基因表達,正如由Ac-p6. 9null桿狀病毒質粒突變體轉染的細胞中的EGFP陽性細胞所證實的(圖15B)。實施例II.本發(fā)明人在下面的實施例中對本發(fā)明的最佳方式進行了修改。材料與方法無抗生素抗性基因的AcMNPV vp80_null桿狀病毒質粒的產(chǎn)生為了確定VP80蛋白在病毒后代產(chǎn)生中是否具有必不可少的作用,我們在大腸桿菌中通過同源重組構建了帶有vp80 ORF的缺失的AcMNPV桿狀病毒質粒(源自于bM0N14272 (來自Invitrogene))。為此,使用PCR引物vp80-K0_F和vp80_K0-R (參見表1),從包含側翼帶有突變LoxP位點的cat基因的質粒擴增了側翼帶有突變LoxP位點的cat基因(Suzuki等,2005)。將得到的含有側翼帶有突變LoxP位點的cat基因并且在vp80 ORF的5’或3’鄰近區(qū)含有AcMNPV的 50-bp同源序列的PCR片段用DpnI處理,并進行凝膠純化以消除模板質粒。然后將PCR產(chǎn)物轉化到按照下述方式制備的含有bM0N14272 (Invitrogen)和產(chǎn)Lambda RED重組酶的質粒pKD46的DHlO β大腸桿菌細胞中(Datsenko & Wanner, 2000)。將轉化的DHlO β -bM0N14272/pKD46大腸桿菌細胞,在含有卡那霉素(50 μ g/ml)、氨芐青霉素(100 μ g/ml)和L-阿拉伯糖(I. 5mg/ml)的50-ml LB (2. 0%蛋白胨,O. 5%酵母提取物,85. 5mMNaCl, [pH 7. O])培養(yǎng)基中,在30°C下生長至OD6tltl為^ O. 6,然后通過標準程序制成電感受態(tài)。將電穿孔的細胞在3ml LB培養(yǎng)基中在37°C下溫育3h,并在含濃度為6. 5yg/ml的氯霉素的LB瓊脂上鋪板。在37°C溫育48_h后,將氯霉素抗性菌落在有34 μ g/ml氯霉素的新鮮LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線。將板在37°C溫育過夜,挑選對氯霉素有抗性的菌落,以備通過PCR進ー步驗證相關基因型。使用引物90292和90889來證實vp80 ORF的不存在,并利用引物cat-F和cat-R來驗證桿狀病毒質粒中cat盒的存在(詳細序列在表I中)。為了從桿狀病毒質粒骨架上消除導入的抗生素抗性基因(cat),使用了 Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)。將從Jeanine Louwerse (LUMC Leiden,荷蘭)獲得的攜帶Cre重組酶的質粒pCRE導入DH10b-bM0N14272-vp80null大腸桿菌細胞,隨后通過添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導CRE表達。簡單來說,將電穿孔的細胞在3ml LB培養(yǎng)基(2. 0%蛋白胨,O. 5%酵母提取物,85. 5mM NaCl, [pH 7. O])中在37°C下溫育3h,并鋪于含50 μ g/ml卡那霉素、100 μ g/ml氨芐青霉素和2mM IPTG的LB瓊脂培養(yǎng)基上。在24_h溫育后,選擇對卡那霉素和氨芐青霉素有抗性的菌落,以備通過PCR進ー步驗證所需基因型。在基于PCR的分析中,使用引物89507和91713 (表I)來驗證cat基因從桿狀病毒質粒骨架上的消除。陽性克隆也通過DNA測序來驗證。為了恢復轉座能力,將編碼轉座酶的輔助質粒pM0N7124 (Invitrogen)再引入到DHlO β -bM0N14272-vp80null大腸桿菌細胞中。最后,將egfp報告基因弓丨入到vp80_nulI桿狀病毒質粒中以便于觀察它在昆蟲細胞中的行為。簡單來說,使用寡核苷酸gfp-Nhel-F和gfp-Sphl-R (表I)從質粒pEGFP-N3 (Clontech)通過PCR擴增egfp報告基因。使用CloneJET PCR克隆試劑盒(Fermentas),按照制造商的方案將PCR產(chǎn)物克隆到質粒pjetl. 2/Blunt中。然后,使用NheI和SphI將egfp ORF從無錯誤的pjetl. 2-egfp上切下,并亞克隆到Nhel/SphI消化的pFastBacDUAL (Invitrogen)中,以產(chǎn)生質粒pFB-egfp。按照Bac-to-Bac手冊■( Invitrogen)中所描述的,將含有在極晚期plO啟動子的轉錄控制之下的egfp報告基因的表達盒從pFB-egfp轉座到vp80_null桿狀病毒質粒的多角體蛋白基因座中。在得到的基因組中,完整的vp80 ORF已被移除(參見圖2)。這對應于在SEQ IDNO: I中提供的AcMNPV克隆C6基因組中從89564至91637位核苷酸的2074bp的缺失。修復的vp80_null桿狀病毒質粒的構建為了制備vp80修復供體載體,我們通過移除多角體蛋白啟動子并將其用含有vp80啟動子區(qū)和vp80 ORF的片段代替,對質粒pFB-egfp(上面提到的)進行修飾。首先,使用引物pvp80-StuI-F和vp80-XbaI-R (表1),從桿狀病毒質粒bM0N14272模板擴增了含有vp80啟動子和ORF序列兩者的2300-bp片段,并克隆到載體pjetl. 2/Blunt (Fermentas)中以形成pjetl. 2-pvp80-vp80o在DNA序列驗證后,通過Stul/Xbal雙消化將vp80盒從pjetl. 2-pvp80-vp80上切下,然后亞克隆到Bstll07I/XbaI消化并凝膠純化的pFB-egfp 中,以產(chǎn)生供體質粒pFB-egfp-pvp80-vp80。平行地,構建其中vp80 ORF由極晚期多角體蛋白啟動子(polh)驅動的供體質粒pFB-egfp-polh-vp80。為此目的,使用弓I物vp80-SacI_F和vp80-XbaI-R (表I)擴增帶有vp80 ORF的2105-bp片段,并將其克隆到pjetl. 2/Blunt中以產(chǎn)生pjetl. 2-vp80。在最后步驟中,將vp80 ORF從pjetl. 2_vp80上切下(Sacl/Xbal),并亞克隆到Sacl/Xbal消化的pFB-egfp中以產(chǎn)生pFB-egfp-polH_vp80。為了克服與不能獲得抗VP80抗體相關的問題,執(zhí)行了 VP80的FLAG標簽裝飾(N-和C-端融合)以便于免疫檢測。N-端融合的FLAG-vp80序列通過雙步驟PCR策略、即所謂的融合PCR來產(chǎn)生。首先,使用弓I物pvp80-StuI-F和vp80_FLAG-Rl,從bM0N14272桿狀病毒質粒模板通過PCR擴增含有vp80啟動子和FLAG標簽的259_bp片段。在凝膠純化和DNA定量后,將259-bp片段在使用反向引物vp80-XbaI-R在bM0N14272桿狀病毒質粒模板上進行的第二步PCR擴增中用作正向引物。將最終的PCR產(chǎn)物(2324bp)克隆到載體pjetl. 2/Blunt(Fermentas)中以形成 pjetl. 2-pvp80-FLAG_vp80。DNA 序列驗證后,通過 Stul/Xbal雙消化將FLAG-vp80盒從pjetl. 2-pvp80-FLAG-vp80上切下,然后亞克隆到Bstll07I/XbaI消化并凝膠純化的pFB-egfp中,以產(chǎn)生供體質粒pFB-egfp-pvp80-FLAG_vp80。使用pvp80-StuI-F和vp80-FLAG-R從bM0N14272桿狀病毒質粒模板擴增C-端融合的vp80_FLAG盒。將2324-bp片段克隆到pjetl. 2/Blunt中,然后以與前述構建物類似的方式轉移到pFB-egfp 中 ο按照Bac-to-Bac方案(Invitrogen)將所有開發(fā)的供體質粒的插入片段轉座到vp80-null桿狀病毒質粒中。polh基因座中轉座陽性構建物的篩選通過基于三重PCR的測定法來進行,在所述測定法中使用了 M13正向和反向引物以及慶大霉素抗性基因特異性引物 GenR (表 I)。轉染-感染測定法按照Bac-to-Bac手冊■(Invitrogen),從攜帶具有插入的異源基因的桿狀病毒質粒的2到3個獨立菌落的I. 5-ml過夜細菌培養(yǎng)物來制備桿狀病毒質粒DNA,并平行地進行分析。為了進行轉染,通過按照Bac-to-Bac (Invitrogen)手冊■中所描述的基于Cellfectin 的轉染方案,在6孔板中使用Iyg姆種桿狀病毒質粒DNA制備物轉染IX IO6個Sf9細胞。在轉染后(p. t. )72h至120h,通過熒光顯微術檢查病毒繁殖。在p. t. 120h吋,將細胞培養(yǎng)基以2000 Xg離心5分鐘以除去細胞碎片,并將該澄清的上清液用于在6孔板中感染I. 5X IO6個Sf9細胞。在p. i.72h時,再次通過熒光顯微術監(jiān)測病毒感染的傳播。在所有實驗中,使用帶有在PlO啟動子控制之下的egfp報告基因的野生型bMON14272桿狀病毒質粒作為陽性對照。也帶有在plO啟動子控制之下的egfp報告基因的bM0N14272-gp64nulI桿狀病毒質粒用作陰性對照,因為它已失去使感染在細胞間移動的能力(Lung 等,2002)。細胞培養(yǎng)物中病毒繁殖的時間過程表征執(zhí)行了時間過程分析以比較AcMNPV_vp80null病毒和各種修復構建物與野生型AcMNPV桿狀病毒質粒(Ac-wt)相比的芽生型病毒生產(chǎn),它們都含有egfp。簡單來說,在28°C下,將Sf9細胞接種在6孔組織培養(yǎng)板(I X IO6個細胞/孔)中的Iml無血清Sf900_II培養(yǎng)基中。2小時后,除去培養(yǎng)基,并在Bac-to-Bac手冊'(Inv itrogen)中推薦的標準條件下,將細胞用5 μ g桿狀病毒質粒DNA進行轉染。在p. t. 24、48、72、96和120h時收獲細胞培養(yǎng)上清液,并通過終點稀釋測定法分析感染性芽生型病毒的生產(chǎn),以確定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tlX感染通過監(jiān)測egfp表達(來自于P 10啟動子)來確定。計算從三次獨立轉染得到的感染滴度的平均值并作圖。透射電子顯微術將昆蟲Sf9細胞接種在25T三角瓶中(3. 5X106個細胞/瓶),并用20 μ gAc-Δ νρ80、拯救Ac-Δ νρ80_νρ80或Ac-wt桿狀病毒質粒構建物轉染。p. t. 48h后收獲細胞,并按照以前的描述進行制備,用于透射電子顯微術(van Lent等,1990)。使用PhilipsCMl2電子顯微鏡檢查樣品并照相。芽生型病毒生產(chǎn)測定法將昆蟲Sf9細胞接種到兩個25T三角瓶中(3. 5X106個細胞/瓶),并用
      20μ g Ac- Δ vp80> Ac- Δ νρ80_νρ80、Ac- Δ νρ80_ρΗ_νρ80、Ac- Δ vp80-FLAG_vp80、Ac-Avp80-Vp80-FLAG或Ac-wt桿狀病毒質粒構建物轉染。p.t.5日,收獲富含BV的細胞培養(yǎng)上清液,并超速離心通過ー層10%蔗糖溶液(25,OOOrpm,I. 5小時,Beckman SW32)。將沉淀的芽生型毒粒重懸浮在無菌去礦質水中并制備,用于負染電子顯微術、SDS-聚丙烯酰胺電泳或基于PCR的檢測(如上所述)。從被感染細胞純化ODV和桿狀結構通過電子顯微術(EM)分析被感染/轉染的昆蟲細胞中ODV和桿狀結構的存在。為此,在p. i. 48h收獲昆蟲細胞,將其裂解,并將細胞裂解液超速離心通過40%蔗糖的TE(lmMTris-HCl pH 7. 4,0. ImMEDTA)緩沖液層(45,OOOrpm,I 小時,Beckman SW55)。將沉淀物重懸浮在無菌去礦質水中,并按照以前的描述通過負染色EM進行分析(van Lent等,1990)。
      BV和ODV毒粒的純化和分級為了生產(chǎn) BV,將 3. O X IO7 個 Sf9 細胞用 Ac- Δ vp80_Flag · vp80 或對照 Ac_wt 病毒以MOI=I進行感染。p. i. 6天,收集72ml富含BV的培養(yǎng)基并以1,500Xg離心10分鐘。然后將上清液在4°C下以80,OOOXg超速離心(Beckman SW28轉頭)60分鐘。將BV沉淀物重懸浮在350μ1 0. I X TE緩沖液中,并上樣在線性蔗糖梯度(25至56% (w/v))上,并在4°C下以80,000 Xg超速離心(Beckman SW55轉頭)90分鐘。收集形成的BV帶,并在12ml0. IXTE中稀釋。將BV制備物在4°C下以80,OOOXg離心60分鐘。將最終的病毒沉淀物重懸浮在150μ I 0. IXTE中。為了生產(chǎn) 0DV,將 6. OXlO7 個 Sf9 細胞用 Ac-Λ Vp80_Flag · vp80 (M0I=25)和AcMNPV (M0I=5)病毒(毒株 E2,Smith & Summers,1979)共同感染。p. i. 5 天,收獲感染的細胞,并按照以前的描述從病毒包涵體純化ODV (Braunagel等,1994)。將最終的ODV沉淀物重懸浮在 0.5ml O. IXTE (IOmM Tris, ImM EDTA,ρΗ=7· 5)中。按照以前的描述將純化的BV和ODV毒粒分級成包膜和核衣殼級分(Braunagel等,1994)。對最后的級分進行處理,用于SDS-PAGE和針對小鼠單克隆抗Flag抗體(Stratagene )、兔多克隆抗VP39抗血清(由美國堪薩斯州立大學(Kansas StateUniversity)的Lorena Passarelli善意提供)、兔多克隆抗GP64抗血清(由中國武漢病毒研究所的HualinWang和Feifei Yin善意提供(Yin等,2008))或針對經(jīng)ロ傳染性因子I(PIF-I)的兔多克隆抗血清(由荷蘭Wageningen大學的Ke Peng善意提供(Peng等,2010))的免疫印跡。Sf9衍生的表達vp80的轉基因細胞系的開發(fā)為了開發(fā)生產(chǎn)VP80蛋白的細胞系,使用引物vp80-SacI_F和Vp80_XbaI-R(表I)擴增帶有vp80 ORF的2105-bp片段,并將其克隆到pjetl. 2/Blunt中以產(chǎn)生pjetl. 2_vp80。在下一步中,將vp80 ORF從pjetl. 2_vp80上切下(Sacl/Xbal)并亞克隆到Sacl/Xbal消化的pIZ (Invitrogen)中,以產(chǎn)生pIZ_vp80。將得到的質粒載體pIZ_vp80用Eco57I線性化并進行凝膠純化。將Sf9細胞接種在6孔板中(I X IO6個細胞/孔),并用10 μ g線性化載體轉染。轉染后24小時后,通過含有Zeocin (300 μ g/ml)的細胞培養(yǎng)基對細胞進行2至3周的篩選,直到在同樣條件下沒有對照Sf9細胞存活。然后將細胞作為未克隆的細胞系進行繁殖。使用vp80null病毒進行重組蛋白表達為了測量使用Ac_AVp80 (反式互補的)毒種表達重組蛋白的能力,將3. OX IO7個未轉化的Sf9細胞用Ac-wt、Ac-Δ vp80-Flag · vp80 (都在未轉化的細胞系中產(chǎn)生)或Ac-ΔνρδΟ病毒(在Sf9-vp80細胞系中產(chǎn)生)以MOI=IO進行感染(獨立的三次重復測定)。所有這些毒種從桿狀病毒極晚期PlO啟動子表達作為模型異源基因的egfp。在p. i.48h和72h吋,收獲細胞和培養(yǎng)基,并用于Western印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或BV滴定(參見上文)。對于Western印跡來說,使用與上述相同的抗體來檢測Flag標簽、EGFP和GP64,以及單克隆小鼠抗肌動蛋白抗體(ImmunO)。為了進行相對定量,將Maxisorp 96孔板(Nunc)用IOOng兔多克隆抗GFP抗體(Molecular Probes)以姆孔ΙΟΟμΙ的體積在4°C包被過夜,隨后如以前所述按照標準ELISA程序進行(Fric等,2008)。按照下述公式計算EGFP生產(chǎn)的百分數(shù)(獨立的三次重復測定):EGFP表達的%=(測試吸光度背景吸光度)/ (Ac-wt EGFP72h-背景吸光度)X 100%,其中nh表示感染后的時間點。在對照Ac-wt與實驗Ac-Δ vp80_Flag · vp80和Ac-Δ vp80基因型之間觀察到的差異的統(tǒng)計顯著性,使用Student' s t-檢驗來分析。結果AcMNPV vp80基因對于病毒復制是必需的按照圖2中的詳情構建了 AcMNPV缺失病毒。修復構建物被設計成使野生型vp80ORF或在N-和C-端帶有FLAG-標簽的vp80基因連同其天然或多角體蛋白啟動子區(qū),與處于PlO啟動子下的egfp基因一起被插入到多角體蛋白基因座中(圖3A)。為了研究vp80基因的功能,將Sf9細胞用敲除或修復桿狀病毒質粒構建物轉染,并通過熒光顯微術監(jiān)測EGFP表達。當將Ac-vp80null導入到Sf9細胞中時,在p. t. 72h至120h時沒有在細胞培養(yǎng)物中觀察到病毒繁殖。我們只能觀察到與Ac-gp64null桿狀病毒質粒的表型類似的“單細胞感染”表型(圖3B)。結果表明,Ac-vp80null能夠達到感染的極晚期,正如通過plO啟動子驅動的EGFP表達所證實的。從p. t. 72h至120小時,可以在用三種修復(從其天然啟動子驅動的vp80,從多角體蛋白啟動子驅動的vp80和從其天然啟動子驅動的N-端帶有FLAG標簽的vp80)構建物轉染的昆蟲細胞單層中看到廣泛分布的EGFP表達,其表明這些桿狀病毒質粒能夠產(chǎn)生充分的感染性芽生型毒粒水平,以與野生型桿狀病毒質粒類似的水平啟動二次感染(圖3B)。相反,在用C-端帶有FLAG標簽的vp80修復構建物轉染的昆蟲細胞中,到p. t. 72h時為止,只在最初感染的分離細胞中觀察到EGFP表達,表明這種桿狀病毒質粒構建物在病毒復制方面有缺陷(圖3B)。然而,到p. t. 96h時觀察到極小噬斑的形成,并且到p.t. 120h時,發(fā)展出非常少的正常大小的噬斑。結果顯示C-端帶有flag標簽的突變體在芽生型病毒生產(chǎn)中受到強烈延遲,并顯示未修飾的C-端對于VP80的功能非常重要。在P. t. 5天時,去除細胞培養(yǎng)上清液并將其添加到新鮮鋪板的Sf9細胞中,然后溫育3天,以檢測從用這些桿狀病毒質粒轉染的細胞產(chǎn)生的病毒引起的感染。正如預期的,與來自使用修復構建物轉染的上清液一起溫育的Sf9細胞,顯示出大量EGFP表達細胞(圖3C)。然而,與來自C-端帶有FLAG標簽的構建物的上清液一起溫育的細胞,在EGFP陽性細胞的數(shù)量上顯 示出顯著降低。另ー方面,在與來自于使用vp80敲除型轉染的上清液一起溫育的昆蟲細胞中,直到72h時,在所分析的任何時間點沒有檢測到EGFP表達(圖3C)。此外,為了表征vp80基因的缺失對AcMNPV感染的準確效果,在kciUAc- Δ vp80> Ac- Δ vp80-vp80Rep> Ac- Δ vp80-polh-vp80Rep> Ac- Δ vp80-FLAG-vp80Rep 和Ac-Δ vp80-vp80-FLAGRep之間比較了病毒在轉染的Sf9細胞中的繁殖。在指明的時間點,分析所有上述桿狀病毒質粒構建物的細胞培養(yǎng)上清液的BV生產(chǎn)(圖4)。正如預期的,修復的 Ac- Δvp80-vp80Rep 、Ac-Δvp80-polh_vp80Rep 、Ac-Δvp80-FLAG_vp80Rep 病毒顯示出與野生型病毒(Ac-wt)的繁殖一致的病毒復制動力學。與Ac-wt病毒或其他修復的病毒相比,由C-端帶有flag標簽的Ac-AVp80-vp80-FLAGR印病毒產(chǎn)生的芽生型毒粒減少到約O. 06%ο這些結果表明,vp80基因對于感染性BV的產(chǎn)生是必需的。已經(jīng)清楚地證明,vp80ORF的整個序列可以從桿狀病毒質粒骨架上完全缺失,并通過將vp80 ORF導入到基因組的異源位點(多角體蛋白基因座)中充分地拯救。我們還顯示,vp80基因表達可以由異源多角體蛋白啟動子序列來驅動,并對病毒在細胞培養(yǎng)物中的復制沒有負面影響。此外,我們觀察到與VP80的C-端相反,N-端允許進行基因修飾(表位標簽標記)。我們注意到當與所有其他拯救或野生型病毒相比吋,C-端帶有FLAG標簽的VP80病毒的動力學被顯著延遲,表明了 VP80C-端的功能重要性。VP80是BV和ODV兩者的產(chǎn)生所需要的上面描述的結果表明,Ac-vp80null突變體在感染性芽生型病毒的生產(chǎn)上徹底缺陷。然而,還存在著突變體仍能產(chǎn)生非感染性芽生型粒子的可能性。為了調查這種能力,將Sf9細胞用敲除、修復或野生型桿狀病毒質粒構建物進行轉染,并在p. t. 7天對細胞培養(yǎng)基進行超速離心以沉淀芽生型病毒。將形成的沉淀物通過負染色電子顯微術或通過基于Western印跡或PCR的檢測進行分析,以證實芽生型病毒的存在。在來自用Ac-vp80null突變體轉染的細胞的沉淀物中,沒有揭示出完整的芽生型病毒、病毒樣粒子或其結構(例如主要衣殼蛋白VP39和病毒基因組序列)(圖5A和5B)。另一方面,與源自于野生型病毒的芽生型病毒相比,所有被分析的修復構建物產(chǎn)生正常外觀的芽生型病毒(圖5A)。然而,在源自于C-端帶有FLAG標簽的vp80基因修復構建物轉染的細胞的沉淀物中,發(fā)現(xiàn)代表性芽生型毒粒非常困難。為了進一步表征vp80基因的缺失對桿狀病毒生命周期的影響,使用從桿狀病毒質粒轉染的細胞產(chǎn)生的超薄切片執(zhí)行了電子顯微術。Ac-Vp80null轉染的細胞典型地發(fā)展出桿狀病毒感染的細胞的表型,其具有膨大的核、片段化的宿主染色質、電子致密的病毒發(fā)生基質等(圖6A)。不存在VP80沒有阻止病毒發(fā)生基質內正常外觀的核衣殼的形成(圖6C)。所形成的核衣殼在表型上與由Ac-Vp80null修復或Ac_wt桿狀病毒質粒所產(chǎn)生的核衣殼沒有區(qū)別。然而,與用Ac-Vp80null修復或Ac_wt桿狀病毒質粒轉染的細胞相比,裝配的核衣殼的豐度相當?shù)?圖6E和6G)。此外,在Ac-vp80null桿狀病毒質粒轉染的細胞的核質的基質周區(qū)室(所謂的環(huán)區(qū))中,在包膜之前既不能觀察到包埋型毒粒也不能觀察到核衣殼束(圖6B和6D)。在核衣殼的成熟和/或它們從病毒發(fā)生基質的釋放/運輸期間,VP80 似乎發(fā)揮作用。最后,VP80對高效核衣殼裝配可能多少有些貢獻,這可以用Ac-vp80null轉染的細胞的病毒發(fā)生基質中存在少量核衣殼來解釋。當vp80基因被重新導回到桿狀病毒質粒突變體中時,可以在被轉染細胞的環(huán)區(qū)中看到大量核衣殼和包埋型毒粒(圖6F)。在Ac-Λ vp80-vp80修復桿狀病毒質粒轉染的細胞中產(chǎn)生的包埋型毒粒的豐度和形態(tài),與由野生型桿狀病毒質粒產(chǎn)生的相似(圖6F和6H)。VP80與BV和ODV兩者的核衣殼結合為了調查VP80與BV制備物的結合,在p. i. 48h收集BV,并將核衣殼和包膜級分分離。在被感染的Sf9細胞中觀察到,F(xiàn)lag · VP80蛋白只在核衣殼級分中作為分子質量在80-kDa與95-kDa之間的雙條帶被檢測到(圖14A,上圖)。使用針對VP39 (只針對核衣殼)和GP64 (只針對包膜)的抗體證實了核衣殼和包膜的正確分離(圖14A,下圖)。為了檢查VP80是否也與ODV結合,將Sf9細胞用Ac- Δ vp80_Flag · vp80和產(chǎn)包涵體(OB)的wt AcMNPV病毒共同感染,以提供POLH蛋白。Western印跡分析顯示VP80與ODV的核衣殼級分結合,并且在這種情況下作為 SOkDa的單一條帶遷移,其對應于在感染的極晚期中產(chǎn)生的80-kDa形式(圖14B,上圖)。使用針對一種ODV包膜蛋白PIF-I的抗血清來控制核衣殼和包膜級分的正確分級(圖14B,下圖)。VP80的功能可以通過遺傳反式互補來拯救為了驗證病毒基因組中的vp80缺失是否能夠被在組成性啟動子控制之下以反式方式提供的vp80 ORF互補,構建了表達帶有Flag標簽的vp80的轉基因細胞系。在這些細胞中,VP80主要作為約95-kDa的蛋白產(chǎn)生,正如通過使用抗Flag抗體進行的Western印跡分析所顯示的(圖15A)。還觀察到了兩條次要條帶,一條為 80-kDa,第二條為 65-kDa。在反式互補測定中,將Sf9_vp80細胞用Ac_AVp80桿狀病毒質粒轉染,并在p. t.96h和120h時通過EGFP特異性熒光監(jiān)測病毒感染的擴散(圖15Ba_c)。在轉染的Sf9-vp80細胞中觀察到病毒噬斑,證實了病毒在細胞之間傳播。然而,我們注意到發(fā)展出的噬斑的數(shù)量和大小明顯低于在Ac-wt桿狀病毒質粒轉染的Sf9細胞中觀察到的(圖15d)。作為對照,未轉基因的Sf9細胞當用Ac- Δ vp80桿狀病毒質粒轉染時,僅顯示單細胞感染(圖15Bc)。當使用Ac- Δ νρ80轉染的Sf9_vp80細胞的培養(yǎng)基來感染新鮮接種的未轉基因Sf9細胞時,觀察到“單細胞感染”表型(圖15Bb,右圖)。因此,從反式互補產(chǎn)生的BV粒子能夠進入細胞,但是不能產(chǎn)生新的BV。這也顯示出在Sf9-vp80細胞中,Ac- Δ vp80不能通過從宿主細胞獲取轉基因回復成Ac-wt。正如預計的,在接受來自Ac-Λ VP80轉染的未轉基因Sf9細胞的上清液的Sf9細胞中,沒有檢測到EGFP信號(圖15Bc,右圖)。在p. i. 6天,將從用Ac-Λ VP80桿狀病毒質粒轉染的Sf9-vp80細胞釋放的感染性BV的數(shù)量,與用Ac_wt轉 染的Sf9細胞中產(chǎn)生的數(shù)量進行了比較。該實驗顯示,目前的反式互補系統(tǒng)與經(jīng)典的基于Sf9的生產(chǎn)系統(tǒng)相比,產(chǎn)生BV的效率低約25倍(圖15C)。反式互補并且復制缺陷的Ac_vp80null病毒能夠表達高水平重組蛋白為了評估vp80基因缺失對重組蛋白表達水平的影響,執(zhí)行了實驗室規(guī)模的比較性生產(chǎn)測定。在這里,將Sf9細胞用三種類型的桿狀病毒毒種以MOI=IO平行感染,即(i)Ac-wt> (ii ) Ac- Δ vp80-Flag · vp80 (者都在 Sf9 細胞中產(chǎn)生)和(iii ) Ac-Δ vp80 (在Sf9-vp80細胞中產(chǎn)生),它們都編碼EGFP。Western印跡圖譜顯示,對于所有三種測試的桿狀病毒基因型來說,EGFP蛋白都以相同水平表達,在此用作對照目的的GP64糖蛋白也是如此(圖16A,上圖)。在p. i. 48和72h時,通過ELISA對被感染細胞裂解物中的EGFP相對量進行定量(圖16B),并且在三種測試的桿狀病毒基因型之間,EGFP水平?jīng)]有顯示出任何統(tǒng)計顯著的差異。因此,結果證實了反式互補的Ac-Λ VP80毒種,盡管在病毒復制方面有缺陷,但與常規(guī)的桿狀病毒表達載體一樣能夠生產(chǎn)重組蛋白,只要初始感染復數(shù)高得足以感染所有細胞即可。此外,在生產(chǎn)培養(yǎng)期間,沒有檢測到帶有vp80基因的回復突變病毒基因型,因為在免疫印跡中沒有檢測到重新表達的Flag ·νΡ80蛋白(圖16Α)。理論上說,與反式互補的毒種結合的一定量Flag · VP80蛋白進入昆蟲細胞,但這在感染后的極晚期時間不再檢測到,并可能通過溶酶體或蛋白酶體介導的活性被降解。在同一個實驗中,在源自于用Ac- Δ vp80毒種接種的Sf9細胞的細胞培養(yǎng)上清液中沒有記錄到BV釋放(圖16C),證實了既沒有發(fā)生回復突變病毒的產(chǎn)生,也沒有發(fā)生野生型病毒的污染??偨Y在本研究中,我們致力于常規(guī)的基于桿狀病毒的表達工具的改進,其目的在于從制造的重組蛋白中消除污染性桿狀病毒后代。這種努力由制藥前景強烈驅動,因為重組桿狀病毒表達的治療藥正越來越多地用于人類醫(yī)學和獸醫(yī)學。因此,我們的目的是鑒定桿狀病毒基因,對其的靶向引起桿狀病毒毒粒生產(chǎn)的缺陷,但是不影響或僅僅輕微影響極晚期基因的表達。通過這種方式,將為異源基因的高水平表達提供安全保護。圖17中顯示了以vp80基因為實例的新技術的概覽。利用基于桿狀病毒質粒的工程化,本發(fā)明人構建了缺少vp80基因的AcMNPV基因組(圖17B)。功能基因組學和電子顯微術分析揭示出vp80缺陷阻止了 BV和ODV兩者的產(chǎn)生。并行地,對Sf9細胞進行工程化來生產(chǎn)VP80,以反式互補Ac-AvpSO敲除的桿狀病毒質粒(圖17A,C)。最后,我們證明了反式互補并且復制缺陷的桿狀病毒毒種能夠產(chǎn)生與常規(guī)桿狀病毒載體所產(chǎn)生的相似量的重組蛋白(圖14D)。表I. PCR引物依文本中出現(xiàn)次序的列表。CN 102686732 A 0. S 301/42 矧 S I.C
      ID# Ss ly4lj__、JZ
      2vp39-F 5rgcttctaatacgacteactatagggtcgtatccgctaagcgttct_3_ ICa'
      3VP39IR 5*-gcttctpatacgactcactatagggacgcaacgcguatacacag 丨 3* JKl1
      私 4-5510 5rgcttaaaiacgacicactatagggacagcgtgtacgagtgcat'3 ΙΕ-Κ0
      I--IS32I__I----
      54-6235 5-丨gcttotaatacgactcactatagggatotegagegtgtagctggr3”531
      690292 y-gcttctaptacgactepctatagggtpocgocgapeattacacc 丨 3- ICI 790OCOC9 5rgcuctaatacgactcactatagggtctattggcacgtugct 丨 3* .R1
      8ec-27*F 5rgcttciaaisgaotcactatagggaaagcpgasooggeagar3_ IEIh
      9e 07內 5.-gcttotaataegaotcactatagggtigagtggcticaacctcag—3- iKSs
      CO
      OO
      權利要求
      1.用于生產(chǎn)生物藥品的方法,所述方法包含 (a)用至少ー種桿狀病毒感染生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞,所述至少一種桿狀病毒包含編碼所述生物藥品的基因組;以及 (b)將生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞維持在使生物藥品得以生產(chǎn)的條件下, 其中所述至少一種桿狀病毒的基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷,或其中所述生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞包含使桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因失活的表達控制系統(tǒng)。
      2.權利要求I的方法,其中通過核苷酸取代、插入或缺失,使所述基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因有缺陷。
      3.權利要求I的方法,其中生產(chǎn)生物藥品的昆蟲細胞是重組昆蟲細胞,所述重組昆蟲細胞包含表達對桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因有特異性的dsRNA的構建物,所述dsRNA任選在誘導型啟動子下表達。
      4.權利要求I至3任ー項的方法,其中所述至少一種桿狀病毒在步驟(a)之前,在表達桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因的互補拷貝的桿狀病毒生產(chǎn)細胞中產(chǎn)生。
      5.權利要求I至4任ー項的方法,其中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因選自 vp80、vp39、vpl054 和 ρ6· 9。
      6.權利要求I至5任ー項的方法,其中與來自野生型桿狀病毒的極晚期表達相比,桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因的缺陷或失活不影響來自所述桿狀病毒的極晚期表達。
      7.權利要求I至6任ー項的方法,其中所述至少一種桿狀病毒源自于AcMNPV或BmNPV。
      8.權利要求I至7任ー項的方法,其中生物藥品是重組蛋白、重組病毒或病毒樣粒子。
      9.權利要求8的方法,其中生物藥品是重組AAV。
      10.權利要求I至9任ー項的方法,其中生物藥品由導入到重組桿狀病毒基因組中在多角體蛋白或Pio啟動子控制下的至少ー個基因編碼。
      11.桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)在生物藥品生產(chǎn)中的應用,其中所述桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)包含用至少ー種重組桿狀病毒感染的生產(chǎn)桿狀病毒的昆蟲細胞,其中 -所述或每種重組桿狀病毒包含編碼生物藥品或生物藥品的至少ー個組分的桿狀病毒基因組,并且 -所述或每種重組桿狀病毒基因組中所述桿狀病毒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷,或者生產(chǎn)桿狀病毒的昆蟲細胞包含使桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因失活的表達控制系統(tǒng)。
      12.包含桿狀病毒基因組的桿狀病毒質粒,其中所述基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因有缺陷,優(yōu)選其中所述桿狀病毒基因組的vp80、vp39、vp 1054或p6. 9有缺陷。
      13.重組桿狀病毒載體,優(yōu)選為AcMNPV桿狀病毒載體,其中所述桿狀病毒的基因組中桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因有缺陷,優(yōu)選其中所述桿狀病毒基因組的vp80、vp39、vpl054或ρ6· 9有缺陷。
      14.昆蟲細胞,其用權利要求13的桿狀病毒載體感染。
      15.昆蟲細胞,其包含表達對桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因有特異性、優(yōu)選針對vp80、vp39、vpl054或ρ6· 9的dsRNA的構建物,所述構建物優(yōu)選整合在昆蟲細胞的基因組中。
      16.昆蟲細胞,其包含編碼桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的表達盒。
      17.權利要求16的昆蟲細胞,其中所述基因是vp80、vp39、vpl054和/或ρ6·9。
      18.用于生產(chǎn)桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷的桿狀病毒的方法,所述方法包含用權利要求12的桿狀病毒質粒轉染權利要求16或17的昆蟲細胞的步驟,其中所述桿狀病毒質粒有缺陷的桿狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因,是由包含在所述昆蟲細胞中的表達盒所編碼的基因。
      19.用于篩選桿狀病毒基因的方法,所述桿狀病毒基因的失活可用于在昆蟲細胞-桿狀病毒系統(tǒng)中生產(chǎn)不帶有污染性桿狀病毒毒粒的生物藥品,所述方法包含 a)提供含有桿狀病毒基因組的細胞的細胞培養(yǎng)物; b)將所述細胞培養(yǎng)物與用于失活所述桿狀病毒基因組的至少ー個被測桿狀病毒基因的手段、例如與RNA干擾相接觸;以及 c)測試來自所述細胞培養(yǎng)物的毒粒形成,與未接觸所述手段的細胞培養(yǎng)物的毒粒形成進行比較; 其中如果被測基因的失活引起桿狀病毒毒粒形成的減少,則所述被測基因被選為可用于生產(chǎn)生物藥品。
      20.權利要求19的方法,其還包含步驟d),所述步驟d)測試與所述手段相接觸的細胞培養(yǎng)物的極晚期基因表達,與未接觸所述手段的細胞培養(yǎng)物的極晚期基因表達進行比較; 其中如果被測基因的失活引起桿狀病毒毒粒形成的減少并且如果被測基因不影響所述桿狀病毒基因組的極晩期基因表達,則所述被測基因被選為可用于生產(chǎn)生物藥品。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及利用基于桿狀病毒的系統(tǒng)來生產(chǎn)生物藥品的方法。這些方法有利地允許生產(chǎn)污染性桿狀病毒毒粒的數(shù)量減少或沒有的生物藥品。
      文檔編號C12N15/866GK102686732SQ201080045629
      公開日2012年9月19日 申請日期2010年8月5日 優(yōu)先權日2009年8月17日
      發(fā)明者奧托-維海姆·莫騰, 莫尼克·凡奧爾斯, 馬丁·馬爾科 申請人:吉尼松公司
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