專利名稱：協(xié)同產(chǎn)生異丙醇與伯醇，二元醇和酸的微生物和方法
協(xié)同產(chǎn)生異丙醇與伯醇，二元醇和酸的微生物和方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明一般涉及生物合成的方法，更具體地涉及具有正丙醇和異丙醇，1，4- 丁二醇和異丙醇，1，3- 丁二醇和異丙醇，或者甲基丙烯酸和異丙醇生物合成能力的生物。異丙醇(IPA)是一種無色的易燃液體，與大多數(shù)溶劑混合完全，包括水。IPA的最大用途是作為溶劑，包括眾所周知的但用量很小的“外用酒精”，這是一種IPA和水的混合物。作為溶劑，IPA見于許多日常產(chǎn)品中，例如涂料，油漆，稀釋劑，油墨，粘合劑，通用清潔齊U，消毒劑，化妝品，盥洗用品，除冰劑和藥品。低級IPA也用于發(fā)動機油中。第二個最大作用是作為異丙胺，異丙醚和異丙酯生產(chǎn)的化工中間體。異丙醇可被脫水形成丙烯，丙烯是一種具有超過200萬噸的年度市場的聚合物前體。
目前異丙醇(IPA)的全球產(chǎn)生能力大約60億磅/年，大約74%的全球IPA產(chǎn)量集中在美國，歐洲和日本。異丙醇由兩種石化路線生產(chǎn)。主要過程需要在有或沒有硫酸催化下使丙烯水合。其次，IPA由丙酮氫化生產(chǎn)，這是在苯酚和環(huán)氧丙烷生產(chǎn)中形成的副產(chǎn)品。高價的丙烯目前在整個化學(xué)產(chǎn)業(yè)中正推動成本上升和利潤下降，因而正需要擴(kuò)大低成本原料的范圍。正丙醇可能用作汽油代用品。目前在制藥工業(yè)中用作多能溶劑，用于表面涂層和墨水配方中。它用作樹脂和酯，丙胺和鹵丙烷的結(jié)構(gòu)單元。它也用于包裝和接觸食物的用途。2005年正丙醇的全球產(chǎn)量超過140,000噸。正丙醇由丙醛的催化氫化生產(chǎn)。丙醛本身通過氧化法生產(chǎn)，通過在催化劑例如八羰基鈷或者銠配合物存在下用一氧化碳和氫使乙烯醛化。在很多發(fā)酵過程中它以少量自然形成。例如，產(chǎn)生非常小量的正丙醇的微生物已經(jīng)從通過蘇氨酸分解代謝的梭菌屬(Clostridium)的某些種和啤酒發(fā)酵中的酵母中檢測到。還不存在已經(jīng)報道的大量由糖產(chǎn)生I-丙醇的微生物。I, 4- 丁二醇(I, 4-BD0)是一種聚合物中間體和工業(yè)溶劑，具有大約30億磅/年的全球市場。BDO目前由石化前體(主要是乙炔，蘋果酸酐和環(huán)氧丙烷)生產(chǎn)。例如，在Iteppe合成反應(yīng)中乙塊與 2 分子甲醒反應(yīng)(Kroschwitz and Grant, Encyclopedia of Chem. Tech.,John Wiley and Sons, Inc. , New York(1999)),隨后經(jīng)催化氫化形成 1，4_ 丁二醇。在下游，1，4-BD0可以被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化；例如，通過氧化形成Y-丁內(nèi)酯，其可更進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為吡咯烷酮和N-甲基吡咯烷酮或者氫解成四氫呋喃。這些化合物具有各種用途，作為聚合物中間體，溶劑和添加劑，并且具有近20億磅/年總的市場。1，3- 丁二醇(1，3-BD0)是一個四碳二元醇，通常用作食品調(diào)味劑的有機溶劑。也用作聚氨酯和聚酯樹脂的共聚單體，并且廣泛用作降血糖藥。光學(xué)活性1，3-BD0是合成生物活性化合物和液晶的一種有用的起始原料。1，3- 丁二醇的大量商業(yè)用途是隨后脫水提供1，3- 丁二烯(Ichikawa, J. Mol.Catalysis. 256:106-112 (2006) ),250億磅/年石油化工業(yè)用來生產(chǎn)合成橡膠(例如，輪胎)，膠乳和樹脂。1，3-BD0傳統(tǒng)上由乙炔通過其水合生產(chǎn)。得到的乙醛然后轉(zhuǎn)化成3-羥基丁醛，其隨后被還原形成1，3-BD0。特別近幾年，作為乙醛的來源乙炔已經(jīng)被乙烯代替。
甲基丙烯酸(MAA)是甲基丙烯甲酯(MMA)的一個關(guān)鍵前體，甲基丙烯甲酯是一種全球需求超過每年45億磅的化工中間體，其大部分轉(zhuǎn)化為聚丙烯酸酯。合成甲基丙烯甲酯(即，丙酮氰醇路線)的慣用方法包括將丙酮和氰化氫(HCN)轉(zhuǎn)化成丙酮氰醇，其然后經(jīng)酸催化水解和用甲醇酯化產(chǎn)生MAA。可能致命的HCN運輸困難與副產(chǎn)品處置的高昂費用(每噸MAA形成2噸硫酸氫銨)一起已經(jīng)引起了大量針對更清潔和更經(jīng)濟(jì)的方法的研究。作為一種起始原料，MAA可容易通過甲醇酯化轉(zhuǎn)化為MAA。還沒有報道由糖大量生產(chǎn)MAA的微生物。本發(fā)明描述了有效地協(xié)同產(chǎn)生商業(yè)量的正丙醇和異丙醇，I, 4-BD0和異丙醇，1，3-BD0和異丙醇 或者M(jìn)AA和異丙醇的微生物有機體和方法，并且其包括相關(guān)的優(yōu)勢。發(fā)明概述本發(fā)明提供具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體。一方面，本發(fā)明公開的實施方式涉及一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇和異丙醇途徑的微生物有機體，其中正丙醇途徑包括至少一種編碼一種正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，并且其中異丙醇途徑包括至少一種編碼一種異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的外源性核酸。一方面，該正丙醇途徑包括丙醛脫氫酶，丙醇脫氫酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基轉(zhuǎn)移酶，丙酰-CoA水解酶，丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸還原酶或者丙酰磷酸還原酶，和該異丙醇途徑包括乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶或者異丙醇脫氫酶。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，包括具有正丙醇和異丙醇途徑的微生物有機體，其中該正丙醇途徑包括編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸。一方面，該第一組編碼正丙醇途徑酶包括丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶。另一方面，第二組編碼異丙醇途徑酶包括乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-Cok合成酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。另一方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其具有編碼正丙醇途徑酶的第一組外源性核酸和編碼異丙醇途徑酶的第二組外源性核酸，其中第一組編碼PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA脫羧酶，以及丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶和丙酰磷酸還原酶；或者丙酰-Cok水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶；和第二組編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。
另一方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其具有編碼正丙醇途徑酶的第一組外源性核酸和編碼異丙醇途徑酶的第二組外源性核酸，其中第一組編碼PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘇氨酸脫氨酶，以及2-氧代丁酸脫羧酶和丙醇脫氫酶；或者2-氧代丁酸脫氫酶，丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者2-氧代丁酸脫氫酶，丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者2-氧代丁酸脫氫酶，丙酰-Cok水解酶或者丙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-Cok合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者2-氧代丁酸脫氫酶，丙酰-Cok水解酶或者丙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-Cok合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶；和第二組編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。另一方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其具有編碼正丙醇途徑酶的第一組外源性核酸和編碼異丙醇途徑酶的第二組外源性核酸，該第一組編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸 裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-Cok羧化酶，丙二酰-Cok還原酶，丙二酸半醛還原酶，丙酰-CoA合成酶，以及丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基轉(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-Cok合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶；和第二組編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。另一方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其具有編碼正丙醇途徑酶的第一組外源性核酸和編碼異丙醇途徑酶的第二組外源性核酸，其中第一組編碼乳酸脫氫酶，乳酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，乳酰-CoA脫水酶，丙烯酰-CoA還原酶，以及丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基轉(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-Cok水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶；和第二組編碼丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供一種具有正丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體，該正丙醇途徑包括至少一種編碼一種正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的外源性核酸。一方面該正丙醇途徑包括丙醛脫氫酶，丙醇脫氫酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基轉(zhuǎn)移酶，丙酰-CoA水解酶，丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸還原酶或者丙酰磷酸還原酶。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供一種具有正丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體，該正丙醇途徑包括編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的一組外源性核酸，該組外源性核酸編碼丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基轉(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶。在其它方面，本發(fā)明公開的實施方式涉及一種生產(chǎn)正丙醇和異丙醇的方法，其包括培養(yǎng)前述的非天然存在的微生物有機體。在其它方面，本發(fā)明公開的實施方式涉及一種生產(chǎn)正丙醇的方法，其包括培養(yǎng)前述的非天然存在的微生物有機體。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供具有異丙醇途徑和1，4- 丁二醇(1，4-BD0)途徑，1，3-丁二醇(1，3-BD0)途徑或者甲基丙烯酸(MAA)途徑的非天然存在的微生物有機體。一方面，本發(fā)明公開的實施方式涉及一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4_ 丁二醇和異丙醇途徑的微生物有機體，其中該1，4- 丁二醇途徑包括至少一種編碼一種1，4- 丁二醇途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-丁二醇的量表達(dá)的外源性核酸，并且，其中該異丙醇途徑包括至少一種編碼一種異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的外源性核酸。一方面，本發(fā)明公開的實施方式涉及一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-丁二醇和異丙醇途徑的微生物有機體，其中該1，3- 丁二醇途徑包括至少一種編碼一種1，3- 丁二醇途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-丁二醇的量表達(dá)的外源性核酸，并且，其中該異丙醇途徑包括至少一種編碼一種異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的外源性核酸。一方面，本發(fā)明公開的實施方式涉及一種非天然存在的微生物有機體，包括具有甲基丙烯酸和異丙醇途徑的微生物有機體，其中該甲基丙烯酸途徑包括至少一種編碼一種甲基丙烯酸途徑酶并以足以產(chǎn)生甲基丙烯酸的量表達(dá)的外源性核酸，并且，其中該異丙醇途徑包括至少一種編碼一種異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的外源性核酸。在一個實施方式中，該異丙醇途徑包括乙酰-Cok乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶或者異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，I, 4-BD0途徑包括琥拍酰-CoA還原酶,琥拍酸還原酶,4-輕基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，4-羥基丁醛還原酶，4-羥基丁酸還原酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁?；?磷酸還原酶，或者4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)。在一個實施方式中，該1，3-BD0途徑包括琥珀酰-CoA還原酶，琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，3-羥基丁醛還原酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基丁酰-CoA合成酶，3-羥基丁酰-CoA水解酶或者3-羥基丁酸還原酶。在一個實施方式中，MAA途徑包括琥珀酰-CoA還原酶，琥珀酸還原酶，4_羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)_4_羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA變位酶，3-羥基異丁酰-CoA脫水酶，甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶，3-羥基異丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-CoA合成酶，3-羥基異丁酰-CoA水解酶，3-羥基異丁酸脫水酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸還原酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醛)，3-羥基異丁酸脫氫酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醇)或者3-羥基異丁酸脫水酶。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，并且其中所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括含有1，3-BD0和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第 一組外源性核酸，并且，其中所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有甲基丙烯酸和異丙醇途徑的微生物有機體，該甲基丙烯酸途徑包括編碼甲基丙烯酸途徑酶并以足以產(chǎn)生甲基丙烯酸的量表達(dá)的第一組外源性核酸，并且，其中所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸?？梢岳斫?，如果下游酶即脫水酶缺失，通過3-羥基異丁酸中間體的甲基丙烯酸途徑可以應(yīng)用于3-羥基異丁酸生產(chǎn)而不是甲基丙烯酸(參見附圖7和8)。在這種情況下，非天然存在的有機體可產(chǎn)生3-羥基異丁酸而不是甲基丙烯酸。非天然存在的有機體或者可生產(chǎn)3-羥基異丁酸和甲基丙烯酸的混合物。不管是產(chǎn)生甲基丙烯酸還是3-羥基異丁酸，ATP和產(chǎn)品的最大摩爾收率是不變的。還可以理解，如果需要，通過本發(fā)明的微生物有機體表達(dá)的3-羥基異丁酸可以化學(xué)轉(zhuǎn)化成甲基丙烯酸。例如，3-羥基異丁酸或者β-羥基異丁酸可以脫水形成甲基丙烯酸，如例如美國專利No. 7，186，856所述。在其它方面，本發(fā)明公開的實施方式涉及生產(chǎn)1，4-BD0和異丙醇，1，3-BD0和異丙醇，或者M(jìn)AA和異丙醇的方法，其包括培養(yǎng)前述的非天然存在的微生物有機體。附圖的簡要說明圖I顯示由葡萄糖協(xié)同產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的一種示例性途徑。縮寫Glc-葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，F(xiàn)OR-甲酸，ACCOA-乙酰-Coh, AACOA-乙酰乙酰-Coh, ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PP0H-2-異丙醇，OAA-草酰乙酸，MAL-蘋果酸，F(xiàn)UM-延胡索酸，SUCC-琥珀酸，SUCCOA-琥珀酰-CoA，MMCOA-甲基丙二酰-CoA，PPCOA-丙酰-CoA，PPA-丙酸，PPAL-丙醛，PPPi-丙酰磷酸，PP0H-1-正丙醇。圖2顯示由葡萄糖協(xié)同產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的一種示例性途徑?？s寫Glc_葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，F(xiàn)OR-甲酸，ACCOA-乙酰-Coh, AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PP0H-2-異丙醇，OAA-草酰乙酸，THR-蘇氨酸，
2-0BUT-2-氧代丁酸，PPCOA-丙酰-Coh，PPA-丙酸，PPAL-丙醛，PPPi-丙酰磷酸，PP0H-1-正丙醇。圖3顯示由葡萄糖協(xié)同產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的一種示例性途徑。縮寫Glc-葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，F(xiàn)OR-甲酸，ACCOA-乙酰-Coh, AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PP0H-2-異丙醇，MALCOA-丙二酰-CoA,MALAL-丙二酸半醛，3HP-3-羥基丙酸，PPCOA-丙酰-CoA，PPA-丙酸，PPAL-丙醛，PPPi-丙酰磷酸，PP0H-1-正丙醇。圖4顯示由葡萄糖協(xié)同產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的一種示例性途徑?？s寫Glc_葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，F(xiàn)OR-甲酸，ACCOA-乙酰-CoA，AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PP0H-2-異丙醇，LAC-D-乳酸，LACCOA-乳酰-CoA，ACRYLC0A-丙烯酰-CoA，PPCOA-丙酰-CoA，PPA-丙酸，PPAL-丙醛，PPPi-丙酰磷酸，PP0H-1-正丙醇。圖5顯示由葡萄糖協(xié)同產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的一種示例性途徑?？s寫Glc_葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，F(xiàn)OR-甲酸，ACCOA-乙酰-Coh, AACOA-乙酰乙酰-Coh, ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PP0H-2-異丙醇，OAA-草酰乙酸，MAL-蘋果酸，F(xiàn)UM-延胡索酸，SUCC-琥珀酸，SUCCOA-琥珀酰-CoA，SUCSAL-琥珀酸半醛，4-HB-4-羥基丁酸，4-HBC0A-4-羥基丁酰-CoA，4-HBALD-4-羥基丁醛，I, 4-BD0-1, 4- 丁二醇，4-HBP-4-羥基丁酰磷酸。圖6顯示由葡萄糖協(xié)同產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的一種示例性途徑?？s寫Glc_葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，F(xiàn)OR-甲酸，ACCOA-乙酰-Coh, AACOA-乙酰乙酰-Coh, ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PP0H-2-異丙醇，OAA-草酰乙酸，MAL-蘋果酸，F(xiàn)UM-延胡索酸，SUCC-琥珀酸，SUCCOA-琥珀酰-CoA，SUCSAL-琥珀的半醛，3-HB-3-羥基丁酸， 4-HB-4-羥基丁酸，4-HBC0A-4-羥基丁酰-CoA，CRTCOA-巴豆酰-CoA，3-HBC0A-3-羥基丁酸-CoA, 3-HBALD-3-輕基丁醒，I, 3-BDO-1, 3- 丁二醇。圖7顯示由葡萄糖協(xié)同產(chǎn)生甲基丙烯酸和異丙醇的一種示例性途徑。縮寫Glc-葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，F(xiàn)OR-甲酸，ACCOA-乙酰-CoA，AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PP0H-2-異丙醇，OAA-草酰乙酸，MACOA-甲基丙烯酰-Coh, MAL-蘋果酸，F(xiàn)UM-延胡索酸，SUCC-琥珀酸，SUCCOA-琥珀酰-Coh,SUCSAL-琥珀酸半醛，4-HB-4-羥基丁酸，4-HBC0A-4-羥基丁酰-CoA，3-HIBC0A-3-羥基異丁酰-Coh, 3-HIB-3-羥基異丁酸，MAA-甲基丙烯酸。圖8顯示由葡萄糖協(xié)同產(chǎn)生甲基丙烯酸和異丙醇的一種示例性途徑。縮寫Glc-葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，F(xiàn)OR-甲酸，ACCOA-乙酰-CoA，AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PP0H-2-異丙醇，OAA-草酰乙酸，MAL-蘋果酸，F(xiàn)UM-延胡索酸，SUCC-琥珀酸，SUCCOA-琥珀酰-Coh, MM-甲基丙二酸酯，MMCOA-甲基丙二酰-Coh,麗SA-甲基丙二酸半醛，3-HIB-3-羥基異丁酸，MAA-甲基丙二酸。本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式提供具有氧化還原平衡的厭氧途徑的非天然存在的微生物有機體，如附圖I - 4所示，用于從3分子磷酸烯醇式丙酮酸(P E P )協(xié)同產(chǎn)生正丙醇和異丙醇。此協(xié)同產(chǎn)生策略的一些優(yōu)點包括(1)該協(xié)同產(chǎn)生能提供正丙醇和異丙醇的最高理論產(chǎn)量為總共I. 33摩爾/摩爾葡萄糖；和(2)該協(xié)同產(chǎn)生途徑完全氧化還原平衡，并且具有凈的ATP正產(chǎn)量。這有利于完全厭氧生產(chǎn)C3醇，而不需要單獨培養(yǎng)具有異丙醇途徑的微生物有機體，其需要通氣來進(jìn)行NAD再生。本發(fā)明的實施方式還提供能從可再生資源協(xié)同產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的非天然存在的微生物有機體，如附

圖1-4中所示。具體地，該有機體包括在由乙酰-CoA和丙酰-CoA協(xié)同產(chǎn)生正丙醇和異丙醇中利用的所有酶。甲酸可以被甲酸脫氫酶轉(zhuǎn)化成二氧化碳，其提供一個附加的可以用于正丙醇和異丙醇合成的還原當(dāng)量。另外，還原當(dāng)量可以從該途徑中的其它步驟獲得，例如，在葡萄糖轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸期間的糖酵解途徑，丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA期間的丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，或者2-氧代丁酸轉(zhuǎn)化為丙酰-CoA期間的2-氧代丁酸脫氫酶。本發(fā)明的實施方式還提供能通過丙酰-CoA生產(chǎn)正丙醇的非天然存在的微生物有機體。這種轉(zhuǎn)化通過兩種不同的酶進(jìn)行醛和醇脫氫酶，或者通過雙官能醛/醇脫氫酶在一個步驟中進(jìn)行?；蛘?，丙酰-CoA可以轉(zhuǎn)化為丙酰磷酸，然后通過酰磷酸還原酶轉(zhuǎn)化為丙醛?；蛘撸?CoA可以分別通過丙酰-CoA水解酶，轉(zhuǎn)移酶或者合成酶和丙酸激酶(propionate dinase)轉(zhuǎn)化成丙酸然后轉(zhuǎn)化成丙酸磷酸。或者,丙酸可以通過丙酸還原酶轉(zhuǎn)化成丙醛。生產(chǎn)丙酰-CoA的途徑例舉在附圖1-4中。在一個實施方式中，生產(chǎn)丙酰-CoA的這種途徑通過草酰乙酸進(jìn)行，如附圖I所述。草酰乙酸通過還原性TCA循環(huán)的方式，甲基變位酶，脫羧酶和脫羧酶轉(zhuǎn)化為丙酰-CoA?？赡苄枰钕虍悩?gòu)酶將甲基丙二酰-CoA的(R)立體異構(gòu)體轉(zhuǎn)變?yōu)?S)構(gòu)型。在另一個實施方式中，這種生產(chǎn)丙酰-CoA的途徑通過蘇氨酸進(jìn)行，如附圖2所述。草酰乙酸通過設(shè)計成高收率的天然蘇氨酸途徑轉(zhuǎn)化為蘇氨酸，其然后脫氨基形成2-氧代丁酸，接著轉(zhuǎn)化為丙酰-CoA。在一種替代方式中，2-氧代丁酸被脫羧酶轉(zhuǎn)化成丙醛，其然后被丙醇脫氫酶還原為正丙醇。在又一實施方式中，生產(chǎn)丙酰-CoA的途徑通過丙二酰-CoA進(jìn)行，如附圖3所述。乙酰-CoA羧化形成丙二酰-CoA。其然后被還原為丙二酸半醛，并且隨后轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸(3HP)。3HP通過丙酰-CoA合成酶轉(zhuǎn)化為丙酰-CoA。在又一實施方式中，生產(chǎn)丙酰-CoA的途徑通過乳酸進(jìn)行，如附圖4所述。丙酮酸被還原形成乳酸然后被活化形成乳酰-CoA。乳酰-CoA脫水形成丙烯酰-CoA，并且然后還原產(chǎn)生丙酰-CoA。本發(fā)明的實施方式還提供非天然存在的微生物有機體，其能通過乙酰-Cok生產(chǎn)異丙醇。異丙醇的生產(chǎn)通過乙酰乙酰-Cok硫解酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶(一種乙酰乙酸脫羧酶)，和異丙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化乙酰-CoA獲得，如附圖1-4所述。在一個實施方式中，由葡萄糖生產(chǎn)乙酰-CoA的途徑通過磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)進(jìn)行。葡萄糖通過微生物有機體的天然糖酵途徑被轉(zhuǎn)化為PEP。PEP通過丙酮酸激酶轉(zhuǎn)化成丙酮酸，然后通過丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA?；蛘?，丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA和甲酸。甲酸然后被甲酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為二氧化碳和氫。本發(fā)明的實施方式提供異丙醇與化合物1，4-BD0,1, 3-BD0和MAA協(xié)同產(chǎn)生的替代方法。異丙醇的生產(chǎn)通過如上所述的乙酰-CoA進(jìn)行。該路線單獨不是氧化還原平衡的，因此需要通氣來獲得高的異丙醇收率。本發(fā)明所述的實施方式采用這條路線并且將其與合成協(xié)同產(chǎn)物1，4- 丁二醇(1，4-BD0), 1，3- 丁二醇(I, 3-BD0)和甲基丙烯酸(MAA)的途徑結(jié)合起來。協(xié)同產(chǎn)生路線在厭氧條件下是氧化還原平衡的，與之相反，如果異丙醇單獨通過丙酮生產(chǎn)需要氧氣。協(xié)同產(chǎn)生也提供有關(guān)的優(yōu)點，例如，由于其相對于1，4-BD0(230°C)，1，3-BD0(203°C )和MAA ( 1630C )較低的沸點(82°C )，異丙醇易于從其它發(fā)酵產(chǎn)品分離，并且使用本發(fā)明所述的任何微生物有機體，協(xié)同產(chǎn)生提供從所加載的葡萄糖的最高理論碳收率。本發(fā)明的實施方式提供能通過琥珀酰-CoA或者某在些方面通過琥珀酸生產(chǎn)1，4-BD0的非天然存在的微生物有機體。為了生產(chǎn)1，4-BD0,琥珀酰-CoA被琥珀酰-CoA還原酶轉(zhuǎn)化成琥珀酸半醛?；蛘撸晁峥杀荤晁徇€原酶轉(zhuǎn)化成琥珀酸半醛。下一步，琥珀酸半醛被4-羥基丁酸脫氫酶還原為4-羥基丁酸。將4-HB活化為它的?；?CoA由CoA轉(zhuǎn)移酶或者合成酶催化?；蛘?，通過磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶4-HB可以轉(zhuǎn)化為4-羥基丁酰磷酸并且隨后轉(zhuǎn)化成4-HB-CoA。4-HB-CoA然后通過雙功能CoA-依賴的醛/醇脫氫酶，或者通過具有醛和醇脫氫酶活性的兩種獨立酶轉(zhuǎn)化成1，4-BD0。4-HBCoA中間體旁路的另一種替代路線是通過羧酸還原酶將4-HB直接還原為4-羥基丁醛。4-羥基丁醛隨后被醇脫氫酶還原為1，4-BD0。4-HB-CoA旁路的又一路線包括通過磷酸還原酶將4-羥基丁酰磷酸還原為4-羥基丁醛。
本發(fā)明的實施方式提供能通過琥珀酰-CoA或者在某些方面通過琥珀酸生產(chǎn)1，3-BD0的非天然存在的微生物有機體。1，3-BD0的生產(chǎn)也通過4-羥基丁酰-CoA進(jìn)行，按如上所述的路線形成。在此路線中，4-羥基丁酰-CoA經(jīng)脫水和異構(gòu)化形成巴豆酰-CoA。脫水和乙烯基異構(gòu)化反應(yīng)由雙功能酶4-羥基丁酰基-CoA脫水酶催化。然后巴豆酰-CoA水合成3-羥基丁酰-CoA。去除CoA部分和同時還原得到3-羥基丁醛?；蛘?，3-羥基丁酰-CoA被3-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，水解酶或合成酶轉(zhuǎn)化成3-羥基丁酸，然后被3-羥基丁酸還原酶還原得到3-羥基丁醛。最后通過3-羥基丁醛還原酶還原該醛得到1，3-BD0。本發(fā)明的實施方式提供能通過兩條可替代途徑生產(chǎn)MAA的非天然存在的微生物有機體。第一條路線通過4-羥基丁酰-CoA進(jìn)行，按如上所述的路線形成。4-羥基丁酰-CoA通過甲基變位酶轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁?；?CoA。然后3-羥基異丁酰-CoA通過CoA轉(zhuǎn)移酶，水解酶或者合成酶去除CoA部分。最后，3-羥基基團(tuán)經(jīng)脫水獲得MAA?；蛘?，3-羥基異丁酰-CoA通過3-羥基異丁酰-CoA脫水酶轉(zhuǎn)化為甲基丙烯酰-CoA，然后CoA部分通過CoA轉(zhuǎn)移酶，水解酶或者合成酶去除獲得MAA。在可替代的MAA生產(chǎn)路線中，琥珀酰-CoA通過甲基丙二酰-CoA變位酶轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰-CoA。將甲基丙二酰-CoA的(R)立體異構(gòu)體轉(zhuǎn)化為
(S)構(gòu)型可能需要差向異構(gòu)酶。CoA-依賴的醛脫氫酶然后將甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛?；蛘撸?R)-甲基丙二酰的CoA或(S)-甲基丙二酰-CoA的CoA部分被CoA轉(zhuǎn)移酶，水解酶或者合成酶去除以形成甲基丙二酸，然后其被還原酶轉(zhuǎn)化成半醛。將醛還原成
3-羥基異丁酸，隨后脫水，得到MAA。可替換地，甲基丙二酰-CoA被形成醇的CoA還原酶轉(zhuǎn)化成3-羥基異丁酸。本發(fā)明的實施方式提供具有生產(chǎn)琥珀酰CoA途徑的非天然存在的微生物有機體，如附圖5-8所述。在一個實施方式中，生產(chǎn)琥珀酰CoA的途徑通過草酰乙酸進(jìn)行。草酰乙酸通過還原性TCA循環(huán)轉(zhuǎn)化為琥珀酰-CoA，包括蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶(fumerase)，延胡索酸還原酶(reducatase)和琥拍酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者琥拍酰-CoA合成酶。將這些途徑改造進(jìn)微生物包括克隆適當(dāng)?shù)木幋a一組酶的一組基因進(jìn)入本發(fā)明所述的生產(chǎn)宿主，優(yōu)化發(fā)酵條件，以及發(fā)酵之后分析產(chǎn)品的形成。為了改造適合生產(chǎn)正丙醇和異丙醇，I, 4-BD0和異丙醇，I, 3-BD0和異丙醇或者M(jìn)AA和異丙醇的生廣宿主,可在微生物中表達(dá)一種或多種外源性DNA序列。另外，該微生物可能具有功能破壞，缺失，或者過表達(dá)的內(nèi)源性基因。本發(fā)明公開的代謝修飾使得采用可再生原料生產(chǎn)正丙醇和異丙醇，1，4-BD0和異丙醇，I, 3-BD0和異丙醇或者M(jìn)AA和異丙醇成為可能。在某些實施方式中，本發(fā)明提供包括至少一種外源性核酸的非天然存在的微生物有機體，該外源性核酸編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供包括至少一種外源性核酸的非天然存在的微生物有機體，該外源性核酸編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)。在其它實施方式中，本發(fā)明提供協(xié)同產(chǎn)生正丙醇和異丙醇，I, 4-BD0和異丙醇，I, 3-BD0和異丙醇或者M(jìn)AA和異丙醇的方法。該方法包括培養(yǎng)本發(fā)明所述的微生物有機體。如本發(fā)明中所使用的，術(shù)語“非天然存在的”當(dāng)用于提及本發(fā)明的微生物有機體或者微生物時意指該微生物有機體具有在天然存在的所提及物種(包括所提及物種的野生型菌株)中通常未發(fā)現(xiàn)的至少一種基因變異?；蜃儺惏?，例如引入可表達(dá)的編碼代謝多肽的核酸的修飾，其它核酸添加，核酸缺失和/或 微生物遺傳物質(zhì)的其它功能性破壞。所述修飾包括，例如所提及物種的異源，同源或異源與同源多肽的編碼區(qū)和其功能片段。其它修飾包括例如非編碼調(diào)控區(qū)，其中修飾會改變基因或操縱子的表達(dá)。示例性代謝多肽包括正丙醇，異丙醇，1，4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA生物合成途徑內(nèi)的酶或者蛋白質(zhì)。代謝修飾是指從天然存在的狀態(tài)發(fā)生改變的生化反應(yīng)。因此，非天然存在的微生物可具有對編碼代謝多肽的核酸或其功能片段的基因修飾。本發(fā)明公開了示例性代謝修飾。當(dāng)用于提及微生物有機體時，如本發(fā)明所用的術(shù)語“經(jīng)分離的”意指有機體基本上不含在自然界中發(fā)現(xiàn)所提及的微生物有機體時所伴隨的至少一種組分。該術(shù)語包括移除自然環(huán)境中所伴隨的部分或所有組分的微生物有機體。該術(shù)語還包括移除非天然存在的環(huán)境中伴隨微生物有機體的部分或所有組分的微生物有機體。因此，經(jīng)分離的微生物有機體與在自然界中發(fā)現(xiàn)時或在非天然存在的環(huán)境中生長，儲存或生存時與其它物質(zhì)部分或完全分離。經(jīng)分離的微生物有機體的具體例子包括部分純的微生物，基本上純的微生物和在非天然存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物。如本發(fā)明所用的術(shù)語“微生物的”，“微生物有機體”或“微生物”意指以古菌領(lǐng)域，細(xì)菌領(lǐng)域或真核領(lǐng)域內(nèi)所包括的顯微細(xì)胞形式存在的任何有機體。因此，該術(shù)語意圖涵蓋具有顯微尺寸的原核或真核細(xì)胞或有機體，且包括所有種類的細(xì)菌，古細(xì)菌和真細(xì)菌，以及真核微生物，例如酵母和真菌。該術(shù)語還包括可經(jīng)培養(yǎng)以用于產(chǎn)生生化物質(zhì)的任何種類的細(xì)胞培養(yǎng)物。如本發(fā)明所用的，“正丙醇”意指具有分子式C3H8O和分子量60. lg/mol的伯醇。正丙醇在本領(lǐng)域也稱為I-丙醇，I-丙基醇，正丙醇，丙-I-醇或者簡單稱為丙醇。正丙醇是異丙醇的一種異構(gòu)體。如本發(fā)明所用的，“異丙醇”意指具有分子式C3H8O和分子量60. lg/mol的仲醇，其中醇碳原子與其它兩個碳原子相連。這種連接有時可表示為(CH3)2CHOH所示。異丙醇在本領(lǐng)域也稱為丙-2-醇，2-丙醇或者縮寫為IPA。異丙醇是正丙醇的一種異構(gòu)體。如本發(fā)明所使用的術(shù)語“ 1，4- 丁二醇”意指丁烷的醇衍生物，帶有兩個羥基，其具有化學(xué)式C4HltlO2和分子量90. 12g/mol?；衔?，4- 丁二醇在本領(lǐng)域也稱為1，4-BD0,并且是通常稱為BDO化合物族的化合物族的化學(xué)中間體或前體。如本發(fā)明所使用的術(shù)語“1，3- 丁二醇”意指具有化學(xué)式C4HltlO2和分子量90. 12g/mo I的丁二醇的四種穩(wěn)定異構(gòu)體之一?；衔?，3- 丁二醇在本領(lǐng)域也稱為1，3-BD0或者β - 丁二醇，并且也是通常稱為BDO化合物族的化合物族的化學(xué)中間體或前體。如本發(fā)明所使用的“甲基丙烯酸”具有化學(xué)式CH2=C(CH3)CO2 (也稱為甲基丙烯酸和IUPAC名為2-甲基-2-丙酸)，是甲基丙烯酸的酸形式，并且可以理解甲基丙烯酸(methylacrylic acid)和甲基丙烯酸(methylacrylate)可以完全互換使用來指代該化合物的任何中性或者離子形式，包括其任何鹽形式。熟練技術(shù)人員可以理解，具體形式取決于pH值。與此類似,3-輕基異丁酸(3-hydroxyisobutyrate)和3_輕基異丁酸(3-hydroxyisobutyric acid)可以完全互換使用來指代該化合物的任何中性或者離子形式，包括其任何鹽形式。如本發(fā)明所用的術(shù)語“CoA”或“輔酶A”意指有機輔因子或輔基(酶的非蛋白部分)，它的存在對于許多酶(脫輔酶)形成活性酶系統(tǒng)的活性是必需的。輔酶A在某些縮合酶中發(fā)揮功能，在乙酰基或其它?；D(zhuǎn)移中，以及在脂肪酸合成和氧化，丙酮酸酯氧化和其它乙?；邪l(fā)揮作用。當(dāng)用于提及培養(yǎng)或生長條件時，如本發(fā)明所用的術(shù)語“基本上厭氧的”意指液體培養(yǎng)基中的含氧量小于溶解氧飽和含量的約10%。該術(shù)語還意圖包括維持在小于約1%氧氣的氣氛下的液體或固體培養(yǎng)基的密封室。如本發(fā)明所用的“外源性”意指所提及的分子或所提及的活性被引入到宿主微生 物有機體中。分子可例如通過將編碼核酸引入到宿主遺傳物質(zhì)中而引入，例如通過整合到宿主染色體中，或者作為非染色體遺傳物質(zhì)(例如質(zhì)粒)。因此，在用于提及編碼核酸的表達(dá)時，該術(shù)語是指將編碼核酸以可表達(dá)形式引入到微生物有機體中。當(dāng)用于提及生物合成活性時，該術(shù)語是指被引入到宿主參考有機體中的活性。來源可為例如同源或異源編碼核酸，其在引入到宿主微生物有機體中之后表達(dá)所提及的活性。因此，術(shù)語“內(nèi)源性”是指存在于宿主中的所提及的分子或活性。類似地，當(dāng)用于提及編碼核酸的表達(dá)時該術(shù)語是指表達(dá)包含在微生物有機體內(nèi)的編碼核酸。術(shù)語“異源”是指分子或活性來源于除所提及的物種以外的原料，而“同源”是指分子或活性來源于所述宿主微生物有機體。因此，本發(fā)明的編碼核酸的外源性表達(dá)可利用異源或者同源編碼核酸，或者這兩者。本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體可包含穩(wěn)定的基因變異，這是指微生物在培養(yǎng)超過5代后仍不會損失所述變異。一般來說，穩(wěn)定的基因變異包括持續(xù)超過10代的修飾，具體地，穩(wěn)定的修飾將持續(xù)超過約25代，更具體地，穩(wěn)定的基因修飾將持續(xù)超過50代，包括無限持續(xù)下去。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，基因變異(包括本發(fā)明示例的代謝修飾)描述成關(guān)于合適的宿主有機體(例如E. coli)和其對應(yīng)的代謝反應(yīng)，或者產(chǎn)生期望的遺傳物質(zhì)(例如針對期望代謝途徑的基因)的合適來源有機體。然而，鑒于多種有機體的完整基因組測序和基因組學(xué)領(lǐng)域中的高度技術(shù)水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地將本發(fā)明提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)應(yīng)用于基本上所有其它有機體。例如，通過并入來自除所提及物種以外的物種的相同或類似的編碼核酸，本發(fā)明示例的大腸桿菌代謝變異可容易地應(yīng)用于其它物種。所述基因變異一般包括例如種間同源物的基因變異，特別是直系同源物，旁系同源物或非直系同源基因置換。直系同源物是通過垂直家系產(chǎn)生關(guān)聯(lián)且在不同有機體中負(fù)責(zé)基本上相同或一致的功能的基因。例如，小鼠環(huán)氧化物水解酶和人類環(huán)氧化物水解酶可被視為環(huán)氧化物水解的生物功能的直系同源物。例如，當(dāng)基因共有足量的序列相似性以指示其是同源的時，所述基因通過垂直家系產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，或通過從共同祖先進(jìn)化而產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。如果基因具有足量的三維結(jié)構(gòu)相似性但未必具有足量的序列相似性，從而在無法鑒別到一級序列相似性的范圍內(nèi)表明其是進(jìn)化自共同祖先，那么所述基因也可被視為直系同源物。直系同源的基因可編碼序列相似性為氨基酸序列同一性的約25%到100%的蛋白。如果編碼共有氨基酸相似性小于25%的蛋白的基因的三維結(jié)構(gòu)也顯示相似性，那么其也被視為是由垂直家系產(chǎn)生的。絲氨酸蛋白酶家族的成員(包括組織纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶)被視為是通過垂直家系從共同祖先產(chǎn)生的。直系同源物包括通過例如進(jìn)化而在結(jié)構(gòu)或總體活性上趨異的基因或其編碼的基因產(chǎn)物。例如，在一種物種編碼展現(xiàn)兩種功能的基因產(chǎn)物的情況下，以及在所述功能分離成第二物種中的不同基因的情況下，這三種基因和其對應(yīng)產(chǎn)物被視為直系同源物。為了產(chǎn)生生物化學(xué)產(chǎn)物，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可對具有欲引入或破壞的代謝活性的直系同源基因進(jìn)行選擇，以便構(gòu)建非天然存在的微生物。展現(xiàn)可分離活性的直系同源物的例子是不同活性已在兩種或兩種以上物種之間或在單一物種內(nèi)被分離成不同基因產(chǎn)物。具體例子是彈性蛋白酶蛋白水解和纖溶酶原蛋白水解(兩種類型的絲氨酸蛋白酶活性)被分離成作為纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶的不同分子。另一例子是支原體5' -3'外切核酸酶和果蠅dna聚合酶III活性的分離。第一物種的dna聚合酶可被視為第二物種的外切核酸酶或聚合酶中一者或兩者的直系同源物，且反之亦然。
相反，旁系同源物是通過例如復(fù)制和隨后的進(jìn)化趨異而產(chǎn)生關(guān)聯(lián)且具有相似或共同，但不完全相同的功能的同源物。旁系同源物可來源于或衍生于例如相同物種或不同物種。例如，微粒體環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶I)和可溶性環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶II)可被視為旁系同源物，因為其代表兩種共同進(jìn)化自共同祖先的不同酶，催化不同反應(yīng)且在相同物種中具有不同功能。旁系同源物是來自相同物種的彼此具有顯著序列相似性的蛋白，表明其是同源的或通過共同進(jìn)化自共同祖先而產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。旁系同源蛋白家族的分組包括HipA同源物，熒光素酶基因，肽酶等。非直系同源基因置換是來自一個物種的非直系同源基因，可取代不同物種中的參考基因功能。取代包括例如能夠在起源物種中進(jìn)行與不同物種中的參考功能相比基本上相同或類似的功能。雖然一般來說，非直系同源基因置換可被鑒別為在結(jié)構(gòu)上與編碼參考功能的已知基因相關(guān)，但是結(jié)構(gòu)相關(guān)性較小但功能類似的基因和其對應(yīng)的基因產(chǎn)物在本發(fā)明中使用時仍然處于該術(shù)語的含義內(nèi)。功能相似性需要例如非直系同源基因產(chǎn)物的活性位點或結(jié)合區(qū)域與編碼設(shè)法取代的功能的基因相比具有至少一些結(jié)構(gòu)相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物或無關(guān)基因。因此，在鑒別和構(gòu)建具有正丙醇和異丙醇，I, 4-BD0和異丙醇，I, 3-BD0和異丙醇或者M(jìn)AA和異丙醇生物合成能力的本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體的過程中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，通過對特定物種應(yīng)用本發(fā)明提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，代謝修飾的鑒別可包括直系同源物的鑒別和納入或失活。只要參考微生物中存在旁系同源物和/或非直系同源基因置換以用于編碼催化類似或基本上類似的代謝反應(yīng)的酶，那么本領(lǐng)域技術(shù)人員也可利用這些進(jìn)化上相關(guān)的基因。直系同源物，旁系同源物和非直系同源基因置換可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來確定。例如，檢查兩種多肽的核酸或氨基酸序列將會揭示所比較序列之間的序列同一性和相似性?；谒鱿嗨菩裕绻嗨菩宰銐蚋?，那么本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定蛋白是通過進(jìn)化自共同祖先而產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的算法，例如ALign，BLAST, ClustalW和其它算法，比較和確定粗略序列相似性或同一性，并且確定序列中可被指派權(quán)重或分?jǐn)?shù)的空位的存在或顯著性。所述算法在本領(lǐng)域中也是已知的，且類似地可用于確定核苷酸序列相似性或同一性。足以確定關(guān)聯(lián)性的相似性的參數(shù)是基于用于計算統(tǒng)計相似性的熟知方法，或在隨機多肽中發(fā)現(xiàn)類似匹配的概率和所確定匹配的顯著性來計算得出。兩種或兩種以上序列的計算機比較在必要時也可由本領(lǐng)域技術(shù)人員目測優(yōu)化。預(yù)期相關(guān)的基因產(chǎn)物或蛋白可具有高相似性，例如25%到100%序列同一性。如果掃描足夠大小的數(shù)據(jù)庫，那么無關(guān)的蛋白可具有與預(yù)期偶然發(fā)生的概率基本上相同的同一性(約5%)。5%-24%之間的序列可能代表或可能不代表足以推斷所比較序列是相關(guān)序列的同源性?？蛇M(jìn)行鑒于數(shù)據(jù)集的大小確定所述匹配的顯著性的其它統(tǒng)計分析，以便確定這些序列的相關(guān)性。使用BLAST算法確定兩種或兩種以上序列的關(guān)聯(lián)性的示例性參數(shù)例如可說明如下。簡言之，氨基酸序列比對可使用2. O. 8版(1999年I月5日)BLASTP和以下參數(shù)來進(jìn)行矩陣0BL0SUM62 ;空位開放11 ;空位延伸1 ;x_扣分50 ;期望值10. O ;字長3 ;過濾器開。核酸序列比對可使用2. O. 6版(1998年9月16日)BLASTN和以下參數(shù)來進(jìn)行匹配1 ;錯配-2 ;空位開放5 ;空位延伸2 ;x_扣分50 ;期望值:10. O ;字長11 ;過濾器關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，例如，為了增加或降低比較的嚴(yán)格度并確定兩種或兩種以上序列的關(guān)聯(lián)性，可對上述參數(shù)作哪些修改。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的微生物有機體，包括具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該正丙醇途徑具有至少一種編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該正丙醇途徑包括丙醛脫氫酶，丙醇脫氫酶，丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶，丙酰-CoA水解酶，丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸還原酶或丙酰磷酸還原酶，該異丙醇途徑包括至少一種編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該異丙醇途徑包括乙酰乙酰-CoA硫解酶，乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，乙酰-CoA水解酶，乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶或異丙醇脫氫酶。在上述實施方式中的另一方面,該微生物有機體具有至少一種編碼乙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生乙酰-CoA的量表達(dá)的外源性核酸，該乙酰-CoA途徑包括丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，或甲酸脫氫酶。在另一個實施方式中，該微生物有機體具有丙酰-CoA途徑，該途徑具有至少一種編碼丙酰-Cok途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-CoA的量表達(dá)的外源性核酸，該丙酰-CoA途徑包括PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA異構(gòu)酶或甲基丙二酰-CoA脫羧酶。在另一方面，該丙酰-CoA途徑包括丙酮酸羧化酶或丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶。在另一實施方式中，該微生物有機體具有丙酰-CoA途徑，該途徑具有至少一種編碼丙酰-Cok途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-Cok的量表達(dá)的外源性核酸，該丙酰-Cok途徑包括PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘇氨酸脫氨酶，或2-氧代丁酸脫氫酶。在另一方面，正丙醇途徑包括2-氧代丁酸脫羧酶。在另一實施方式中，該微生物有機體具有丙酰-CoA途徑，該途徑具有至少一種編碼丙酰-Cok途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-Cok的量表達(dá)的外源性核酸，該丙酰-Cok途徑包括乙酰-CoA羧化酶,丙二酰-CoA還原酶,丙二酸半醛還原酶或丙酰-CoA合成酶。在另一實施方式中，該微生物有機體具有丙酰-CoA途徑，該途徑具有至少一種編碼丙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-CoA的量表達(dá)的外源性核酸，該丙酰-CoA途徑包括乳酸脫氫酶，乳酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，乳酰-CoA脫水或丙烯酰-CoA還原酶。在又一實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，包括具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該正丙醇途徑具有編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-Cok水解酶或丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或丙酰-CoA合成酶；或者丙酸激酶,丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶 或丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶，并且該異丙醇途徑具有編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在上述實施方式的另一方面，該微生物有機體具有乙酰-CoA途徑，該途徑具有編碼乙酰-Cok途徑酶并以足以產(chǎn)生乙酰-Cok的量表達(dá)的第三組外源性核酸，該第三組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，以及丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶。在另一實施方式中，該微生物有機體具有丙酰-CoA途徑，該途徑具有編碼丙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-CoA的量表達(dá)的第三組外源性核酸，該第三組外源性核酸編碼PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，以及甲基丙二酰-CoA脫羧酶。在另一方面，該第三組外源性核酸還編碼甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶，丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶。在又一實施方式中，該微生物有機體具有丙酰-CoA途徑，該途徑具有編碼丙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-CoA的量表達(dá)的第三組外源性核酸，所述的第三組外源性核酸編碼PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘇氨酸脫氨酶，以及2-氧代丁酸脫氫酶。在另一方面，該第三組外源性核酸還編碼甲基丙二酰-CoA脫羧酶或者丙酮酸羧化酶。在又一方面，第二組外源性核酸還編碼2-氧代丁酸脫羧酶。在又一實施方式中，該微生物有機體具有丙酰-Cok途徑，該途徑具有編碼丙酰-Cok途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-Cok的量表達(dá)的第三組外源性核酸，該第三組外源性核酸編碼乙酰-CoA羧化酶,丙二酰-CoA還原酶,丙二酸半醛還原酶,和丙酰-CoA合成酶。在又一實施方式中，該微生物有機體具有丙酰-CoA途徑，該途徑具有編碼乳酸脫氫酶，乳酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，乳酰-CoA脫水酶，和丙烯酰-CoA還原酶的第三組外源性核酸。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該正丙醇途徑包括編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者琥珀酰-Cok合成酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA脫羧酶，以及丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶和丙酰磷酸還原酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶,并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該正丙醇途徑包括編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘇氨酸脫氨酶，以及2-氧代丁酸脫羧酶和丙醇脫氫酶；或者2-氧代丁酸脫氫酶，丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者2-氧代丁酸脫氫酶，丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；2_氧代丁酸脫氫酶，丙酰-Cok水解酶或者丙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-Cok合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者2-氧代丁酸脫氫酶，丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶,并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在另一方面，該第二組外源性核酸還編碼丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該正丙醇途徑包括編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA還原酶，丙二酸半醛還原酶，丙酰-CoA合成酶，以及丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該正丙醇途徑包括編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼乳酸脫氫酶，乳酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，乳酰-CoA脫水酶，丙烯酰-CoA還原酶，以及丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基轉(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-Cok水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶,并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑的微生物有機體，該正丙醇途徑包括至少一種編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該正丙醇途徑包括丙醛脫氫酶，丙醇脫氫酶，丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶，丙酰-CoA水解酶，丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸還原酶或者丙酰磷酸還原酶。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑的微生物有機體，該正丙醇途徑包括一組編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該組外源性核酸編碼丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-Cok水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙 酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶。在上述實施方式的另一方面，具有正丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體還具有丙酰-CoA途徑，該丙酰-CoA途徑包括編碼丙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-CoA的量表達(dá)的外源性核酸。例如，在某些方面，該外源性核酸編碼PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA變位酶或者甲基丙二酰-CoA脫羧酶。另一方面，該外源性核酸還編碼甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶。另外，在上述實施方式的又一方面，具有正丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體可具有編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，其中該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶，甲基丙二酰-CoA脫羧酶，丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑具有至少一種編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的外源性核酸，該1，4-BD0途徑包括琥珀酰-CoA還原酶，琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-Cok合成酶，4-羥基丁酰-Cok還原酶(形成醛)，4-羥基丁醛還原酶，4-羥基丁酸還原酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰磷酸還原酶或者4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，該異丙醇途徑包括至少一種編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該異丙醇途徑包括乙酰-Cok乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶或者異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3-BD0途徑具有至少一種編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的外源性核酸，該1，3-BD0途徑包括琥珀酰-CoA還原酶，琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-Cok合成酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，3-羥基丁醛還原酶，3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基丁酰-CoA合成酶，3-羥基丁酰-CoA水解酶或者3-羥基丁酸還原酶或者3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，該異丙醇途徑包括至少一種編碼一種異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該異丙醇途徑包括乙酰-Cok乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶或者異丙醇脫氫酶。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑具有至少一種編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的外源性核酸，該MAA途徑包括琥珀酰-CoA還原酶，琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-Cok合成酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-Cok變位酶，3-羥基異丁酰-Cok脫水酶，甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶，3-羥基異丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-CoA合成酶，3-羥基異丁酰-CoA水解酶，3-羥基異丁酸脫水酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶，甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸還原酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醛)，
3-羥基異丁酸脫氫酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醇)或者3-羥基異丁酸脫水酶，該異丙醇途徑包括至少一種編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該異丙醇途徑包括乙酰-Cok乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶或者異丙醇脫氫酶。在上述實施方式的另一方面，微生物有機體具有乙酰-CoA途徑，其具有至少一種編碼乙酰-Cok途徑酶并以足以產(chǎn)生乙酰-Cok的量表達(dá)的外源性核酸，該乙酰-Cok途徑包括丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶或者甲酸脫氫酶。在上述實施方式的另一方面，該微生物有機體具有琥珀酰-CoA有至少一種外源性核酸編碼的途徑琥珀酰-Cok表達(dá)足夠的量途徑酶生產(chǎn)琥珀酰-CoA，琥珀酰-Cok途徑包括PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者琥珀酰-CoA合成酶。在另一方面，琥珀酰-CoA途徑包括丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸還原酶，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還 原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，4-羥基丁酰磷酸還原酶，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，以及4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，以及4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑，包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸還原酶，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰 -Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，4-羥基丁酰磷酸還原酶，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，以及4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，以及4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁 酰-CoA還原酶(形成醛)，和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-Cok脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者3-羥基丁酰-Cok合成酶或者
3-羥基丁酰-CoA水解酶，3-羥基丁酸還原酶，和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者3-羥基丁酰-Cok合成酶或者3-羥基丁酰-CoA水解酶，3-羥基丁酸還原酶，和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，和3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還 原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，或4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，和3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，包括具有1，3- 丁二醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3- 丁二醇途徑包括編碼1，3- 丁二醇途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-丁二醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者3-羥基丁酰-CoA合成酶或者3-羥基丁酰-CoA水解酶，3-羥基丁酸還原酶，和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，包括具有1，3- 丁二醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3- 丁二醇途徑包括編碼1，3- 丁二醇途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-丁二醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，和3-羥基丁醛還原酶，所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，包括具有1，3- 丁二醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3- 丁二醇途徑包括編碼1，3- 丁二醇途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3- 丁二醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-Cok脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者3-羥基丁酰-Cok合成酶或者
3-羥基丁酰-CoA水解酶，3-羥基丁酸還原酶，和3-羥基丁醛還原酶，所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。64，在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，包括具有1，3- 丁二醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3- 丁二醇途徑包括編碼1，3- 丁二醇途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3- 丁二醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，巴豆酸酶，和3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，包括具有1，3- 丁二醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3- 丁二醇途徑包括編碼1，3- 丁二醇途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-丁二醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，和3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA變位酶，
3-羥基異丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-CoA合成酶或者3-羥基異丁酰-CoA水解酶，和
3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA變位酶，
3-羥基異丁酰-CoA脫水酶，以及甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA變位酶，3-羥基異丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-CoA合成酶或者3-羥基異丁酰-CoA水解酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-Cok變位酶，3-羥基異丁酰-CoA脫水酶，以及甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-Cok合成酶，4-羥基丁酰-Cok變位酶，3-羥基異丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-CoA合成酶或者3-羥基異丁酰-CoA水解酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-Cok合成酶，4-羥基丁酰-Cok變位酶，3-羥基異丁酰-CoA脫水酶，以及甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。
在一個 實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA變位酶，3-羥基異丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-CoA合成酶或者3-羥基異丁酰-CoA水解酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA變位酶，3-羥基異丁酰-CoA脫水酶，以及甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醛)；3_羥基異丁酸脫氫酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶，甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶或者甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸還原酶，3-羥基異丁酸脫氫酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶或者甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸還原酶，3-羥基異丁酸脫氫酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醇)，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在上述實施方式的另一方面，該微生物有機體具有乙酰-CoA途徑,該乙酰-CoA途徑具有編碼乙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生乙酰-CoA的量表達(dá)的第三組外源性核酸，該第三組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，和丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶。在又一實施方式中，該微生物有機體具有琥珀酰-CoA途徑，該琥珀酰-CoA途徑具有編碼琥珀酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生琥珀酰-CoA的量表達(dá)的第三組外源性核酸，該第三組外源性核酸編碼PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原 酶，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶和琥珀酰-Cok合成酶。在另一方面，該第三組外源性核酸還編碼丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-Cok合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA還原酶，琥珀酸還原酶，
4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-Cok合成酶，4-羥基丁酰-Cok還原酶(形成醛)，4-羥基丁醛還原酶，4-羥基丁酸還原酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰磷酸還原酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脫氫酶，乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-Cok合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA還原酶，琥珀酸還原酶，
4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-Cok合成酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，3-羥基丁醛還原酶，3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基丁酰-CoA合成酶，3-羥基丁酰-CoA水解酶，3-羥基丁酸還原酶和3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脫氫酶，乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA還原酶，琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，
4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)_4_羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-Cok變位酶，3-羥基異丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-Cok合成酶，
3-羥基異丁酰-CoA水解酶，3-羥基異丁酰-CoA脫水酶，甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脫氫酶，乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶，甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸還原酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醛)，3-羥基異丁酸脫氫酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醇)和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脫氫酶，乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶和異丙醇脫氫酶。上述每個實施方式的另一方面，所述的外源性核酸是異源核酸。在每個所述實施方式的另一方面，所述的非天然存在的微生物有機體在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供一種具有正丙醇和異丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體，其中該非天然存在的微生物有機體包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)將選自如下的底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn) 化成草酰乙酸，草酰乙酸轉(zhuǎn)化成蘋果酸，蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸，延胡索酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸，琥珀酸轉(zhuǎn)化成琥珀酰-CoA，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)化成(R)-甲基丙二酰-CoA，(R)-甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化成(S)-甲基丙二酰-CoA，(S)-甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙酰-CoA，丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙醛，丙醛轉(zhuǎn)化成正丙醇,丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙酸，丙酸轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酸轉(zhuǎn)化成丙醛，丙酰磷酸轉(zhuǎn)化成丙醛，磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，丙酮酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-Cok和甲酸，甲酸轉(zhuǎn)化成CO2, 2分子乙酰-Cok底物轉(zhuǎn)化成I分子乙酰乙酰-Cok產(chǎn)物，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸，乙酰乙酸轉(zhuǎn)化成丙酮，丙酮轉(zhuǎn)化成異丙醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些僅僅是舉例性的，并且本發(fā)明公開的任何底物產(chǎn)物對都適合生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，并且可有效將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的合適的活性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說基于本發(fā)明的教導(dǎo)很容易確定。因此，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化正丙醇和異丙醇途徑中底物和產(chǎn)物，如附圖I所示。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供一種具有正丙醇和異丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體，其中該非天然存在的微生物有機體包括至少一種 編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)將選自如下組成的組的底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸，草酰乙酸轉(zhuǎn)化成蘇氨酸，蘇氨酸轉(zhuǎn)化成2-氧代丁酸，2-氧代丁酸轉(zhuǎn)化成丙酰-CoA，丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙醛，丙醛轉(zhuǎn)化成正丙醇，2-氧代丁酸轉(zhuǎn)化成丙醛，丙酰-Cok轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酰-Cok轉(zhuǎn)化成丙酸，丙酸轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酸轉(zhuǎn)化成丙醛，丙酰磷酸轉(zhuǎn)化成丙醛，磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，丙酮酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-Cok和甲酸，甲酸轉(zhuǎn)化成CO2, 2分子乙酰-Cok底物轉(zhuǎn)化成I分子乙酰乙酰-CoA產(chǎn)物，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸，乙酰乙酸轉(zhuǎn)化成丙酮，丙酮轉(zhuǎn)化成異丙醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些僅僅是舉例性的，并且本發(fā)明公開的任何底物產(chǎn)物對都適合生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，并且其中可有效將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的合適的活性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說基于本發(fā)明的教導(dǎo)很容易確定。因此，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化正丙醇和異丙醇途徑中底物和產(chǎn)物，如附圖2所示。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供一種具有正丙醇和異丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體，其中該非天然存在的微生物有機體包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)將選自如下組成的組的底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-Cok和甲酸，甲酸轉(zhuǎn)化成CO2，乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙二酰-CoA，丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙二酸半醛，丙二酸半醛轉(zhuǎn)化成3-羥基丙酸，3-羥基丙酸轉(zhuǎn)化成丙酰-CoA，丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙醛，丙醛轉(zhuǎn)化成正丙醇，丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙酸，丙酸轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酸轉(zhuǎn)化成丙醛，丙酰磷酸轉(zhuǎn)化成丙醛，2分子乙酰-Cok底物轉(zhuǎn)化成I分子乙酰乙酰-Cok產(chǎn)物，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸，乙酰乙酸轉(zhuǎn)化成丙酮，丙酮轉(zhuǎn)化成異丙醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些僅僅是舉例性的，并且本發(fā)明公開的任何底物產(chǎn)物對都適合生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，并且其中可有效將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的合適的活性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說基于本發(fā)明的教導(dǎo)很容易確定。因此，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化正丙醇和異丙醇途徑中底物和產(chǎn)物，如附圖3所示。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供一種具有正丙醇和異丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體，其中該非天然存在的微生物有機體包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)將選自如下組成的組的底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物丙酮酸轉(zhuǎn)化成D-乳酸，D-乳酸轉(zhuǎn)化成乳酰-CoA,乳酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙烯酰-CoA,丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙酰-CoA，丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙醛，丙醛轉(zhuǎn)化成正丙醇,丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙酸，丙酸轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酸轉(zhuǎn)化成丙醛，丙酰磷酸轉(zhuǎn)化成丙醛，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-Cok和甲酸，甲酸轉(zhuǎn)化成CO2, 2分子乙酰-Cok底物轉(zhuǎn)化成I分子乙酰乙酰-CoA產(chǎn)物，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸，乙酰乙酸轉(zhuǎn)化成丙酮，丙酮轉(zhuǎn)化成異丙醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些僅僅是舉例性的，并且本發(fā)明公開的任何底物產(chǎn)物對都適合生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，并且其中可有效將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的合適的活性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說基于本發(fā)明的教導(dǎo)很容易確定。因此，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機 體，其包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化正丙醇和異丙醇途徑中底物和產(chǎn)物，如附圖4所示。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供一種具有正丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體，其中該非天然存在的微生物有機體包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)將選自如下組成的組的底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙醛，丙醛轉(zhuǎn)化成正丙醇，丙酰-Cok轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙酸，丙酸轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酸轉(zhuǎn)化成丙醛，和丙酰磷酸轉(zhuǎn)化成丙醛。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些僅僅是舉例性的，并且本發(fā)明公開的任何底物產(chǎn)物對都適合生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，并且其中可有效將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的合適的活性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說基于本發(fā)明的教導(dǎo)很容易確定。因此，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化正丙醇和異丙醇途徑中底物和產(chǎn)物，如附圖1-4所示。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供一種具有1，4_BD0和異丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體，其中該非天然存在的微生物有機體包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)將選自如下組成的組的底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸，草酰乙酸轉(zhuǎn)化成蘋果酸，蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸，延胡索酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸，琥珀酸轉(zhuǎn)化成琥珀酰-CoA，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)化成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛轉(zhuǎn)化成
4-羥基丁酸，4-羥基丁酸轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酰-CoA，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)化成4-羥基丁醛，
4-羥基丁醛轉(zhuǎn)化成1，4-BD0，琥珀酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸半醛，4-羥基丁酸轉(zhuǎn)化成4-羥基丁醛，
4-羥基丁酸轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酰磷酸，4-羥基丁酰磷酸轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酰-CoA，4-羥基丁酰磷酸轉(zhuǎn)化成4-羥基丁醛，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)化成1，4-BD0，丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酰磷酸轉(zhuǎn)化成丙醛，磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，丙酮酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-Cok和甲酸，甲酸轉(zhuǎn)化成CO2, 2分子乙酰-Cok底物轉(zhuǎn)化成I分子乙酰乙酰-Cok產(chǎn)物，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸，乙酰乙酸轉(zhuǎn)化成丙酮，丙酮轉(zhuǎn)化成異丙醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些僅僅是舉例性的，并且本發(fā)明公開的任何底物產(chǎn)物對都適合生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，并且其中可有效將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的合適的活性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說基于本發(fā)明的教導(dǎo)很容易確定。因此，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化正丙醇和異丙醇途徑中底物和產(chǎn)物，如附圖5所示。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供一種具有1，3_BD0和異丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體，其中該非天然存在的微生物有機體包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)將選自如下組成的組的底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸，草酰乙酸轉(zhuǎn)化成蘋果酸，蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸，延胡索酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸，琥珀酸轉(zhuǎn)化成琥珀酰-CoA，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)化成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酸，4-羥基丁酸轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酰-CoA，琥珀酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸半醛，4-羥基丁酸轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酰磷酸，4-羥基丁酰磷酸轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酰-CoA，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)化成巴豆酰-Cok,巴豆酰-Cok轉(zhuǎn)化成3-羥基丁酰-Cok, 3-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)化成3-羥基丁醛，3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)化成3-羥基丁酸，3-羥基丁酸轉(zhuǎn)化成3-羥基丁醛，3-羥基丁醛轉(zhuǎn)化成1，3-BD0，3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)化成1，3-BD0，丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酰磷酸轉(zhuǎn)化成丙醛，磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，丙酮酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-Cok和甲酸，甲酸轉(zhuǎn)化成CO2, 2分子乙酰-Cok底物轉(zhuǎn)化成I分子乙酰乙酰-Cok產(chǎn)物，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸，乙酰乙酸轉(zhuǎn)化成丙酮，丙酮轉(zhuǎn)化成異丙醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些僅僅是舉例性的，并且本發(fā)明公開的任何底物產(chǎn)物對都適合生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，并且其中可有效將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的合適的活 性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說基于本發(fā)明的教導(dǎo)很容易確定。因此，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化正丙醇和異丙醇途徑中底物和產(chǎn)物，如附圖6所示。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供一種具有MAA和異丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體，其中該非天然存在的微生物有機體包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)將選自如下組成的組的底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸，草酰乙酸轉(zhuǎn)化成蘋果酸，蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸，延胡索酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸，琥珀酸轉(zhuǎn)化成琥珀酰-CoA，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)化成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酸，4-羥基丁酸轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酰-CoA，琥珀酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸半醛，4-羥基丁酸轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酰磷酸，4-羥基丁酰磷酸轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酰-CoA，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)化成3-羥基異丁酰-CoA，3-羥基異丁酰-CoA轉(zhuǎn)化成3-羥基異丁酸，3-羥基異丁酰-CoA轉(zhuǎn)化成甲基丙烯酰-CoA，甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)化成MAA，3-羥基異丁酸轉(zhuǎn)化成MAA，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)化成(R)-甲基丙二酰-CoA，(R)-甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化成(S)-甲基丙二酰-CoA，(S)-甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化成甲基丙二酸半醛，(S)-甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化成3-羥基異丁酸，甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化成3-羥基異丁酸，丙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙酰磷酸，丙酰磷酸轉(zhuǎn)化成丙醛，磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，丙酮酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA和甲酸，甲酸轉(zhuǎn)化成CO2, 2分子乙酰-CoA底物轉(zhuǎn)化成I分子乙酰乙酰-CoA產(chǎn)物，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸，乙酰乙酸轉(zhuǎn)化成丙酮，丙酮轉(zhuǎn)化成異丙醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些僅僅是舉例性的，并且本發(fā)明公開的任何底物產(chǎn)物對都適合生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，并且其中可有效將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的合適的活性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說基于本發(fā)明的教導(dǎo)很容易確定。因此，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其包括至少一種編碼一種酶或者蛋白質(zhì)的外源性核酸，其中該酶或者蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化正丙醇和異丙醇途徑中底物和產(chǎn)物，如附圖7和8所示。當(dāng)本發(fā)明一般地描述包括正丙醇和異丙醇，I, 4-BD0和異丙醇，I, 3-BD0和異丙醇或者M(jìn)AA和異丙醇途徑的微生物有機體時，可以理解本發(fā)明還提供一種包括至少一種外源性核酸的非天然存在的微生物有機體，該外源性核酸編碼正丙醇，異丙醇，1，4-BD0,I, 3-BD0和/或MAA途徑酶，并且以足以產(chǎn)生正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA途徑的中間體的量表達(dá)。例如，如本發(fā)明所公開的，正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA途徑在附圖1-8中舉例說明。因此，除包括正丙醇和異丙醇，1，4-BD0和異丙醇，I, 3-BD0和異丙醇或者M(jìn)AA和異丙醇途徑的微生物有機體之外，其中所述途徑產(chǎn)生正丙醇和異丙醇，I, 4-BD0和異丙醇，I, 3-BD0和異丙醇或者M(jìn)AA和異丙醇,本發(fā)明還提供一種包括至少一種外源性核酸的非天然存在的微生物有機體，該外源性核酸編碼正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA途徑酶，其中該微生物有機體產(chǎn)生正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,I，3-BD0和/或MAA途徑中間體，例如，丙酮，甲基丙二酰-Coh,丙酰磷酸，2-氧代丁酸，3-羥基丙酸，乳酰-Coh, 4-羥基丁酸，4-羥基丁酰磷酸，巴豆酰-Coh,琥珀酰-Coh,琥珀酸半醛或者3-羥基異丁酰-CoA?？梢岳斫獾氖牵魏伪景l(fā)明公開的途徑，如在實施例中所描述和在附圖中所舉例說明的，包括附圖1-8的途徑，可用于產(chǎn)生非天然存在的微生物有機體，其按需要生產(chǎn)任何途徑中間體或者產(chǎn)品。如本發(fā)明所公開的，這種產(chǎn)生中間體的微生物有機體可以與另一種表達(dá)下游途徑酶的微生物有機體相結(jié)合使用，來生產(chǎn)需要的產(chǎn)品。然而可以理解的是，產(chǎn)生正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA中間體的非天然存在的微生物有機體可用于生產(chǎn)期望產(chǎn)品的中間體。本文描述的發(fā)明一般涉及代謝反應(yīng)，反應(yīng)物或其產(chǎn)物，或者具體涉及一種或多種核酸或基因，所述核酸或基因編碼與所提及代謝反應(yīng)，反應(yīng)物或產(chǎn)物相關(guān)的酶或蛋白質(zhì)，或者催化所提及代謝反應(yīng)的酶。除非本發(fā)明另外明確說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解提及反應(yīng)也表示提及該反應(yīng)的反應(yīng)物和產(chǎn)物。類似地，除非本發(fā)明另外明確說明，提及反應(yīng)物或產(chǎn)物時也表示提及該反應(yīng)，并且提及任何這些代謝組成時也表示提及一種或多種編碼包括在所提及反應(yīng)，反應(yīng)物或產(chǎn)物中的催化酶或蛋白質(zhì)的基因。同樣，考慮到公知領(lǐng)域代謝生物化學(xué)，酶學(xué)和基因組學(xué)，本發(fā)明提及基因或編碼核酸也等同于提及相應(yīng)的編碼酶和其催化的反應(yīng)，或者與反應(yīng)相關(guān)的蛋白，以及該反應(yīng)的反應(yīng)物和產(chǎn)物。本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體可通過引入編碼一種或多種酶或蛋白質(zhì)的可表達(dá)核酸來產(chǎn)生，所述酶或蛋白質(zhì)參與一種或多種異丙醇，4-羥基丁酸酯或1，4_ 丁二醇生物合成途徑。取決于為生物合成所選的宿主微生物有機體，可表達(dá)部分或所有的特定異丙醇，4-羥基丁酸酯或1，4-丁二醇生物合成途徑的核酸。例如，如果所選宿主缺乏期望的生物合成途徑的一種或多種酶或蛋白質(zhì)，那么將用于所缺乏酶或蛋白質(zhì)的可表達(dá)核酸引入到宿主中供隨后的外源性表達(dá)?；蛘?，如果所選宿主展現(xiàn)出內(nèi)源性表達(dá)一些途徑基因，但是缺乏其它基因，那么需要編碼所缺乏東西酶或蛋白質(zhì)的核酸以便實現(xiàn)正丙醇，異丙醇，1，4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA的生物合成。因此，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體可通過引入外源性酶或蛋白質(zhì)活性以獲得期望的生物合成途徑來產(chǎn)生，或者期望的生物合成途徑可通過引入一種或多種外源性酶或蛋白質(zhì)活性來獲得，所述的一種或多種外源性酶或蛋白質(zhì)活性與一種或多種內(nèi)源性酶或蛋白質(zhì)一起產(chǎn)生例如正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA。取決于所選宿主微生物有機體的正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA生物合成途徑的組分，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體將包括至少一種外源性表達(dá)的編碼正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA途徑的核酸，并且最多包括正丙醇，異丙醇， 1，4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA生物合成途徑中一種或多種的所有編碼核酸。例如，正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA生物合成可在缺乏途徑酶或蛋白質(zhì)的宿主中通過外源性表達(dá)相應(yīng)的編碼核酸來實現(xiàn)。在缺乏正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0，I, 3-BD0和/或MAA途徑的所有酶或蛋白質(zhì)的宿主中，可包括該途徑中的所有酶或蛋白質(zhì)的外源性表達(dá)，但應(yīng)理解，即使宿主含有至少一種途徑酶或蛋白質(zhì)，也可表達(dá)途徑的所有酶或蛋白質(zhì)。例如，可包括產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的途徑的所有酶或蛋白質(zhì)的外源性表達(dá)，例如PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者琥珀酰-Cok合成酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶，甲基丙二酰-CoA脫羧酶，以及丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶和丙酰磷酸還原酶，丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶，如附圖I所述?？紤]到本發(fā)明提供的教導(dǎo)和指導(dǎo) ，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員將理解，以可表達(dá)形式內(nèi)導(dǎo)入的編碼核酸的數(shù)量將(至少)與所選宿主微生物有機體的正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1，3-BD0和/或MAA途徑缺失數(shù)相當(dāng)。因此，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體可具有I，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 或者 21，最多所有的編碼酶或者蛋白質(zhì)的核酸，所述的酶或者蛋白質(zhì)組成本發(fā)明公開的正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA生物合成途徑。在某些實施方式中，非天然存在的微生物有機體也可包括其它基因修飾，便于或者優(yōu)化正丙醇，異丙醇，1，4-BD0，I, 3-BD0和/或MAA生物合成或者給宿主微生物有機體賦予其它有用功能。一種該其它功能可包括，例如，增加一種或多種正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0，I, 3-BD0和/或MAA途徑前體的合成，例如磷酸烯醇式丙酮酸或者丙酮酸。一般來說，對宿主微生物有機體進(jìn)行選擇，以便其能產(chǎn)生正丙醇，異丙醇，1，4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA途徑的前體，該前提作為天然產(chǎn)生的分子或工程產(chǎn)物，該工程產(chǎn)物既可提供期望前體的從頭產(chǎn)生，或者增加由宿主微生物有機體天然產(chǎn)生的前體的產(chǎn)生。例如，磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸在宿主有機體如大腸桿菌中天然產(chǎn)生。宿主有機體可經(jīng)工程改造以便增加前體的產(chǎn)量，如本發(fā)明所公開。此外，已經(jīng)工程改造以產(chǎn)生期望前體的微生物有機體可用作宿主有機體，并且進(jìn)一步經(jīng)工程改造以表達(dá)正丙醇，異丙醇，1，4-BD0，1，3-BD0和/或MAA途徑的酶或蛋白質(zhì)。在一些實施方式中，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體是從包含合成正丙醇，異丙醇，1，4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA的酶促能力的宿主產(chǎn)生。在此具體實施方式
中，增加正丙醇，異丙醇，1，4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA途徑產(chǎn)物的合成或積累，對于例如促使正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA途徑反應(yīng)朝產(chǎn)生正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA的方向進(jìn)行可能是有用的。增加的合成或積累可通過例如編碼一種或多種上述正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA途徑酶或蛋白質(zhì)的核酸的過度表達(dá)來實現(xiàn)。正丙醇，異丙醇，1，4-800，1，3-800和/或祖八途徑的一種或多種酶和/或蛋白的過度表達(dá)可例如通過內(nèi)源基因的外源表達(dá)或通過異源基因的外源表達(dá)來進(jìn)行。因此，天然存在的有機體可容易地產(chǎn)生本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體，從而例如通過過度表達(dá)一種，兩種，三種，四種，五種，六種，七種，八種，九種，十種，^^一種，十二種，十三種,十四種，十五種，十六種，十七種，十八種，十九種，二十種或二 i 種，至多所有的編碼正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA生物合成途徑酶或蛋白質(zhì)的核酸，來產(chǎn)生正丙醇，異丙醇，1，4-BDO, I, 3-BDO和/或MAA。此外，非天然存在的 有機體可通過誘發(fā)內(nèi)源基因的突變，從而導(dǎo)致正丙醇，異丙醇，I, 4-BDO, I, 3-BD0和/或MAA生物合成途徑中的酶活性增加來產(chǎn)生。在尤其有用的實施方式中，利用編碼核酸的外源表達(dá)。外源表達(dá)賦予宿主定制表達(dá)和/或調(diào)控元件的能力，以及實現(xiàn)由使用者控制的期望表達(dá)水平的應(yīng)用。然而，在其它實施方式中也可利用內(nèi)源表達(dá)，例如當(dāng)連接于可誘導(dǎo)的啟動子或其它調(diào)控元件時通過移除負(fù)調(diào)控因子或誘導(dǎo)基因的啟動子。因此，具有天然存在的可誘導(dǎo)啟動子的內(nèi)源基因可通過提供適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑而得到上調(diào)，或內(nèi)源基因的調(diào)控區(qū)可經(jīng)工程改造以整合可誘導(dǎo)的調(diào)控元件，從而允許在期望時對內(nèi)源基因增加的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。類似地，可包含可誘導(dǎo)的啟動子作為將外源基因?qū)敕翘烊淮嬖诘奈⑸镉袡C體的調(diào)控元件。應(yīng)理解，在本發(fā)明的方法中，一種或多種外源核酸中的任一種都可導(dǎo)入到微生物有機體中以產(chǎn)生本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體。可將核酸導(dǎo)入以便賦予微生物有機體例如正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0，I, 3-BD0和/或MAA生物合成途徑?；蛘?，可導(dǎo)入編碼核酸以產(chǎn)生中間微生物有機體，該中間微生物有機體具有催化一些期望的反應(yīng)的生物合成能力，以賦予正丙醇，異丙醇，1，4-BDO, I, 3-BD0和/或MAA生物合成能力。例如，具有正丙醇和異丙醇，I, 4-BD0和異丙醇，I, 3-BD0和異丙醇，或者M(jìn)AA和異丙醇生物合成途徑的非天然存在的微生物有機體，可包括至少兩種編碼期望的酶或蛋白質(zhì)的外源核酸。例如丙醛脫氫酶和異丙醇脫氫酶的組合，或者丙酰-CoA合成酶和乙酰-CoA乙?；蚪饷傅慕M合，或者乳酸脫氫酶和乙酰-Cok硫解酶的組合，或者琥珀酰-Cok還原酶和4-羥基丁酰-Cok還原酶(形成醇)的組合，或者巴豆酸酶和乙酰乙酸脫羧酶的組合，或者4-羥基丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶的組合，或者甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醇)和丙酮酸激酶的組合等等。因此應(yīng)理解，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體可包括生物合成途徑的兩種或兩種以上酶或蛋白質(zhì)的任意組合。類似地，應(yīng)理解，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體根據(jù)需要可包括生物合成途徑的三種或三種以上酶或蛋白質(zhì)的任何組合，例如，PEP羧激酶，乙酰-CoA乙?；蚪饷负捅济摎涿福蛘弑峒っ?，乙酰乙酸脫羧酶和2-氧代丁酸脫氫酶，或者丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和異丙醇脫氫酶，或者乳酰-CoA轉(zhuǎn)移酶和乳酰-CoA脫水酶和丙酮酸甲酸裂解酶，或者琥珀酰-CoA脫氫酶，4-羥基丁酸還原酶和4-羥基丁醛還原酶，或者巴豆酸酶，PEP羧化酶和乙酰乙酸脫羧酶，或者3-羥基異丁酰-CoA合成酶，延胡索酸酶和異丙醇脫氫酶，或者乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酸脫羧酶和甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醇)等等，只要期望的生物合成途徑的酶和/或蛋白的組合導(dǎo)致產(chǎn)生對應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物即可。類似地，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體根據(jù)需要可包括如本發(fā)明所公開的生物合成途徑的四種或以上的酶或蛋白質(zhì)的任何組合，例如，丙酮酸羧化酶，蘋果酸脫氫酶，甲基丙二酰-Cok差向異構(gòu)酶和乙酰乙酰-Cok水解酶，或者乙酰-CoA乙?；蚪饷?，異丙醇脫氫酶，丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶，或者乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA還原酶，丙二酸半醛和乙酰乙酸脫羧酶，或者，丙烯酰-CoA還原酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酸脫羧酶和異丙醇脫氫酶，或者琥珀酰-CoA脫氫酶，4-羥基丁酸脫氫酶，
4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶和異丙醇脫氫酶，或者琥珀酸還原酶，3-羥基異丁酰-CoA合成酶，3-羥基異丁酸脫水酶和丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，或者乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙二酰-CoA變位酶和羥基異丁酸脫水酶，只要期望的生物合成途徑的酶和蛋白質(zhì)組合導(dǎo)致產(chǎn)生相應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)品即可。
應(yīng)理解，當(dāng)在微生物有機體中包括多個外源核酸時，該多個外源核酸是指提及的編碼核酸或生物合成活性，如上所述。能進(jìn)一步理解，如本發(fā)明所公開的，多個外源核酸可以被導(dǎo)入到宿主微生物有機體中的獨立核酸分子，多順反子核酸分子，或者其組合上，但仍然被認(rèn)為是多個外源核酸。例如，所本發(fā)明所公開，微生物有機體可以設(shè)計成表達(dá)兩個或兩個以上編碼期望的途徑酶或蛋白質(zhì)的外源核酸。在兩個編碼期望活性的外源核酸導(dǎo)入到宿主微生物有機體的情況下，應(yīng)理解，該兩個外源核酸可以作為單一核酸導(dǎo)入到(例如)單一質(zhì)粒上，獨立的質(zhì)粒上，可以整合到宿主染色體的單一位點或多位點，仍然被認(rèn)為是兩個外源核酸。同樣，應(yīng)理解，兩個以上的外源核酸可以任何需要的組合導(dǎo)入到宿主生物體中的(例如)單一質(zhì)粒上，單獨質(zhì)粒上，可在單一位點或多個為整合到宿主的染色體中，仍然被認(rèn)為是兩個或兩個以上的外源核酸，例如三個外源核酸。因此，所提及外源核酸的數(shù)量和生物合成活性是指編碼核酸的數(shù)量或者生物合成活性的數(shù)量，而不是導(dǎo)入到宿主生物體的獨立核酸的數(shù)量。除了本發(fā)明所述的正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA的生物合成外，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體和方法也可以彼此之間以及與本領(lǐng)域公知的其它微生物有機體和方法進(jìn)行各種組合來利用，以便通過其它途徑實現(xiàn)產(chǎn)物的生物合成。例如，除了使用正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0，1, 3-BD0和/或MAA的產(chǎn)生菌外，一種產(chǎn)生正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA的替代方案是添加另一種能夠?qū)⒄?，異丙醇，I, 4-BD0,I, 3-BD0和/或MAA途徑的中間體轉(zhuǎn)化為正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA的微生物有機體。一種所述程序包括例如發(fā)酵可產(chǎn)生正丙醇，異丙醇，1，4-BD0，I, 3-BD0和/或MAA途徑中間體的微生物有機體。然后正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA途徑中間體可用作底物以供第二微生物有機體將正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA途徑中間體轉(zhuǎn)化為正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA。正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1，3-BD0和/或MAA途徑中間體可直接添加到第二有機體的另一培養(yǎng)物中，或者正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA途徑中間體產(chǎn)生菌的原始培養(yǎng)物可通過例如細(xì)胞分離從這些微生物有機體中移除，然后可向發(fā)酵液中連續(xù)添加第二有機體，以便用于最終產(chǎn)物的產(chǎn)生而無需中間體純化步驟。在其它實施方式中，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體和方法可以眾多亞途徑裝配以便實現(xiàn)例如正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA的生物合成。在這些實施方式中，本發(fā)明目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成途徑可分配到不同的微生物有機體中，并且不同的微生物有機體可共培養(yǎng)以便產(chǎn)生最終產(chǎn)物。在這種生物合成方案中，一種微生物有機體的產(chǎn)物是第二種微生物有機體的底物，直到最終產(chǎn)物合成為止。例如，正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0,1，3-BD0和/或MAA的生物合成可通過構(gòu)建含有用于將一種途徑中間體轉(zhuǎn)化為另一種途徑中間體或產(chǎn)物的生物合成途徑的微生物有機體來實現(xiàn)。或者，正丙醇，異丙醇，1，4-BD0，1，3-BD0和/或MAA也可通過使用兩種有機體在同一容器中共培養(yǎng)或共發(fā)酵而從微生物有機體生物合成產(chǎn)生,其中第一微生物有機體產(chǎn)生丙酰-CoA，琥珀酰-CoA和/或乙酰-CoA中間體，而第二微生物有機體將所述中間體轉(zhuǎn)化為正丙醇，異丙醇，1，4-BD0,1, 3-BD0和/或MAA0根據(jù)本發(fā)明提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體和方法，與其它微生物有機體一起，與具有亞途徑的其它非天然存在的微生物有機體的共同培養(yǎng)物一起，以及與本領(lǐng)域中公知的用于產(chǎn)生正丙醇，異丙醇，1，4-BD0，1，3-BD0和/或MAA的其它化學(xué)和/或生物化學(xué)程序的組合一起，存在眾多組合和置換。
正丙醇，異丙醇，1，4-BD0，1，3-BD0和/或MAA途徑酶或蛋白質(zhì)的編碼核酸的來源可包括例如其中所編碼基因產(chǎn)物能夠催化所提及反應(yīng)的任何物種。這種物種包括原核和真核有機體，包括但不限于細(xì)菌(包括古細(xì)菌和真細(xì)菌)和真核生物(包括酵母，植物，昆蟲，動物和哺乳動物，包括人類)。所述來源的示例性物種包括例如大腸桿菌(Escherichiacoli)，醋酸菌(Acetobacter pasteurians),布氏酸菌(Acidanus brierleyi),貝氏不動桿菌(Acinetobacter baylyi)，醋酸 I丐不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)，不動桿菌 M-1 菌株(Acinetobacter sp. Strain M-1 )，玻拍酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)，玻 白酸厭氧螺桿菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)，Anaerostipes caccae DSM14662，擬南芥(Arabidopsis thaliana)，錯樣芽胞桿菌ATCC 14579 (Bacillus cereus ATCC 14579)，枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)，枯草芽抱桿菌亞種菌株 168 (Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168)，牛(Bostaurus),慢生型大豆根瘤菌 USDA110 (Bradyrhizobium japonicum USDA110)，秀 _隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)，空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)，萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii),禮色綠屈提菌(Chloroflexus aurantiacus),丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetobutylicum)，丙酮丁酸梭菌 ATCC 824 (ClostridiumacetobutylicumATCC 824)，拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)，C 型肉毒桿菌?？寺〉戮?Clostridium botulinum C str. Eklund),克氏梭狀芽抱桿菌(Clostridiumkluyveri)，克氏梭狀芽抱桿菌 DSM 555 (Clostridium kluyveri DSM 555)，諾維氏梭狀芽胞桿菌 _NT (Clostridium novyi-NT)，丙酸梭菌(Clostridium propionicum),糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobuty I icum),糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoperbutyl-acetonicum),谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)，非洲脫硫弧菌(Desulfovibrio africanus),赤桿菌 NAPl (Erythrobacter sp.NAPl)，大腸桿菌K12，大腸桿菌K12菌株MG1655，大腸桿菌0157:H7，熱糖苷酶地芽孢桿菌MlOEXG (Geobacillus thermoglucosidasius M10EXG)，流感嗜血桿菌(Haemohilusinfluenza，)，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori),智人(Homo sapiens)，肺炎桿菌 MGH78578 (Klebsiella pneumonia MGH78578)，乳酸克魯維酵母(KluyveromycesIactis),干酷乳桿菌(Lactobacillus casei)，植物乳桿菌 WCFSl (LactobacillusPI ant arum WCFSl),乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides),產(chǎn)玻 白酸曼氏桿菌(Mannheimia succiniciproducens),海洋 γ 蛋白菌 HTCC2080 (marine gamma proteobacterium HTCC2080)，百脈根慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti),勤奮金屬球菌(Metallosphaera sedula)，扭曲甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)，熱乙酸菌(Moorella thermoacetica)，恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)，結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，歐洲兔(Oryctolagus cunicuius)，卵形癥原蟲(Plasmodium ovale),牙銀卩卜啉單胞 菌(Porphyromonas gingivalis)，瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)，費氏丙酸桿菌謝氏亞種(Propionibacterium fredenreichii sp. shermanii)，費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)，中度產(chǎn)丙酸菌(Propionigenium modestum)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),銅綠假單胞菌 PAOl (Pseudomonas aeruginosaPAOl )，焚光假單胞菌(Pseudomonas f Iuorescens),惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，惡臭假單胞菌 E23 (Pseudomonas putidaE23)，惡臭假單胞菌 KT2440 (Pseudomonasputida KT2440)，假單胞菌屬(Pseudomonas sp)，斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri),真氧產(chǎn)減桿菌(Ralstonia eutropha)，真氧產(chǎn)減桿菌 H16 (Ralstonia eutropha H16)，褐家鼠(Rattus norvegicus)，球形紅桿菌(Rhodobacter spaeroides)，紅假單胞菌 DSM15236 (Rhodoferax ferrireducens DSM 15236)，深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum),Roseiflexus castenholzii，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，福氏志賀氏菌 (Shigella flexneri)，希蒙德木(Simmondsia chinensis)，變形鏈球菌(Streptococcusmutans)，嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)，硫橫礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)，超嗜熱古菌(Sulfolobus tokodaii)，Syntrophobacter fumaroxidans,嗜熱球菌(Thermococcus litoralis)，海棲熱袍菌(Thermotoga maritime),嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus),陰道毛滴蟲 G3 (Trichomonas vaginalisG3)，布氏維蟲(Trypanosoma brucei)，極小韋永氏球菌(Veillonella parvula)，弗氏耶爾森菌(Yersinia frederiksenii)，運動發(fā)酵單抱菌(Zymomonas mobilis)，巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)，丁酸產(chǎn)生菌 L2-50 (butyrate-producing bacterium L2-50)，氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum),熱糖苷酶地芽抱桿菌(Geobacillusthermoglucosidasius)，牛分枝桿菌 BCG (Mycobacterium bovis BCG)，皮疽諾卡氏菌IFM 10152 (Nocardia farcinica IFM 10152)，Nocardia iowensis(sp. NRRL 5646)，產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)，牙銀卩卜啉單胞菌 ATCC 33277 (Porphyromonasgingivalis ATCC 33277)，門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)，灰色鏈霉菌 NBRC13350 (Streptomyces griseus subsp. griseus NBRC 13350)，以及本發(fā)明公開的其它不例性物種，可作為相應(yīng)基因的來源有機體獲得。然而，目前可獲得具有完整基因組序列的物種超過550種(其中超過一半可從例如NCBI等公開數(shù)據(jù)庫獲得)，包括395種微生物基因組和多種酵母，真菌，植物和哺乳動物基因組，從近緣或遠(yuǎn)緣物種中的一種或多種基因鑒定編碼必需的正丙醇，異丙醇，1，4-BD0，1，3-BD0和/或MAA生物合成活性的基因是本領(lǐng)域常規(guī)的和眾所周知的，包括例如已知基因的同源物，直系同源物，旁系同源物和非直系同源基因置換，以及有機體之間基因變異的交換。因此，允許提及的具體有機體(例如大腸桿菌)生物合成本發(fā)明所述的正丙醇，異丙醇，1，4-BD0，1，3-BD0和/或MAA的代謝變異可容易地應(yīng)用于其它微生物，同樣包括原核和真核有機體。根據(jù)本發(fā)明所提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知悉在一種有機體中示例的代謝變異可同樣地應(yīng)用于其它有機體。 在某些情況下，例如當(dāng)非親緣物種中存在可替代的正丙醇，異丙醇，1，4_BD0，1，3-BD0和/或MAA生物合成途徑時，可給宿主物種賦予正丙醇，異丙醇，1，4-BD0，1，3-BD0和/或MAA生物合成，通過例如從非親緣物種外源表達(dá)一種或多種旁系同源物，其催化類似但不完全相同的代謝反應(yīng)以替代所提及的反應(yīng)。因為不同有機體的代謝網(wǎng)絡(luò)之間存在某些差別，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，不同有機體之間的實際基因用法可以不同。然而，根據(jù)本發(fā)明所提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，本發(fā)明的教導(dǎo)和方法可應(yīng)用于所有的微生物有機體，其中給本發(fā)明所示例的物種使用同源代謝變異以在可合成正丙醇，異丙醇，I, 4-BDO, I, 3-BD0和/或MAA的感興趣物種中構(gòu)建微生物有機體。宿主微生物有機體可選自(并且非天然存在的微生物有機體可從中產(chǎn)生)例如細(xì)菌，酵母，真菌或任何適用于發(fā)酵過程的各種其它微生物中。示例性的細(xì)菌包括選自以下的物種大腸桿菌，產(chǎn)酸克雷伯氏菌，琥珀酸厭氧螺菌，琥珀酸放線桿菌，琥珀酸曼海姆氏菌，菜豆根瘤菌，枯草芽孢桿菌，谷氨酸棒桿菌，Gluconobacter oxydans,運動發(fā)酵單孢菌,乳酸乳球菌，植物乳桿菌，天藍(lán)色鏈霉菌，丙酮丁酸梭菌，熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌。示例性的酵母或真菌包括選自以下的物種啤酒酵母，粟酒裂殖酵母，乳酸克魯維酵母，馬克斯克魯維酵母，土曲霉，黑曲 霉和畢赤酵母。大腸桿菌是尤其有用的宿主有機體，因為它是得到充分表征的適用于基因工程的微生物有機體。其它尤其有用的宿主有機體包括酵母，例如啤酒酵母。其它特別有用的宿主有機體包括自然生產(chǎn)足量的丙酰-C oA和/或乙酰-CoA協(xié)同產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的微生物有機體。這種有機體的實例包括但不限于，Clostriumpropionicum,大腸桿菌和費氏丙酸桿菌謝氏亞種。用于構(gòu)建非天然存在的產(chǎn)生正丙醇，異丙醇，I, 4-BDO, I, 3-BD0和/或MAA的宿主和測試其表達(dá)水平的方法可通過例如本領(lǐng)域公知的重組和檢測方法來進(jìn)行。描述于例如 Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring HarborLaboratory,New York(2001) ;^PAusubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley 和 Sons, Baltimore, MD (1999)中可找到這種方法。在產(chǎn)生正丙醇和異丙醇，I, 4-BD0和異丙醇，I, 3-BD0和異丙醇或者M(jìn)AA和異丙醇的途徑中所涉及的外源核酸序列，可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)穩(wěn)定地或暫時地導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，所述技術(shù)包括但不限于接合，電穿孔，化學(xué)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)染和超聲波轉(zhuǎn)化。對于在大腸桿菌或其它原核細(xì)胞中的外源表達(dá)，真核核酸的基因或cDNA中的某些核酸序列可編碼導(dǎo)向信號，例如N末端線粒體或其它導(dǎo)向信號，必要時其可在轉(zhuǎn)化到原核宿主細(xì)胞之前被移除。例如，移除線粒體前導(dǎo)序列會導(dǎo)致在大腸桿菌中的表達(dá)有所增加(Hoffmeister等，J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005))。對于在酵母或其它真核細(xì)胞中的外源表達(dá)，基因可在胞漿中表達(dá)而無需添加前導(dǎo)序列，或者通過添加合適的導(dǎo)向序列(例如適于宿主細(xì)胞的線粒體導(dǎo)向或分泌信號)而導(dǎo)入線粒體或其它細(xì)胞器或?qū)蚍置?。因此，?yīng)理解為了移除或包括導(dǎo)向序列而對核酸序列所作的適當(dāng)修飾可整合到外源核酸序列中以便賦予期望的性質(zhì)。此外，可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)對基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化以獲得蛋白的優(yōu)化表達(dá)。可構(gòu)建一種或多種表達(dá)載體以包括如本發(fā)明所示例的一種或多種正丙醇，異丙醇，I, 4-BD0，I, 3-BD0和/或MAA生物合成途徑編碼核酸，所述編碼核酸可操控性連接到在宿主有機體中具有功能的表達(dá)控制序列上。適用于本發(fā)明的微生物宿主有機體的表達(dá)載體包括例如質(zhì)粒，噬菌體載體，病毒載體，游離基因和人工染色體，其包括可用于穩(wěn)定整合到宿主染色體中的載體和選擇序列或標(biāo)記。另外，表達(dá)載體可包括一種或多種選擇性標(biāo)記基因和適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列。也可包括選擇標(biāo)記基因，其例如提供抗生素或毒素抗性，補充營養(yǎng)缺乏或供應(yīng)培養(yǎng)基中沒有的關(guān)鍵營養(yǎng)物。表達(dá)控制序列可包括本領(lǐng)域公知的組成型和誘導(dǎo)型啟動子，轉(zhuǎn)錄增強子，轉(zhuǎn)錄終止子等。當(dāng)要共表達(dá)兩種或兩種以上外源編碼核酸時，這兩種核酸皆可插入例如單一表達(dá)載體中或單獨的表達(dá)載體中。對于單一載體表達(dá)，編碼核酸可操控性地連接于一種常用表達(dá)控制序列或連接于不同的表達(dá)控制序列，例如一種誘導(dǎo)型啟動子和一種組成型啟動子。代謝或合成途徑中所涉及的外源核酸序列的轉(zhuǎn)化可使用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行證實。所述方法包括例如核酸分析，例如mRNA的Northern印跡或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，或基因產(chǎn)物表達(dá)的免疫印跡技術(shù)，或其它用于測試所導(dǎo)入核酸序列或其對應(yīng)基因產(chǎn)物的表達(dá)的合適分析方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解外源核酸是足量表達(dá)以產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物，并且應(yīng)進(jìn)一步理解可使用本領(lǐng)域公知且如本發(fā)明所公開的方法優(yōu)化表達(dá)水平以獲得充分表達(dá)定向進(jìn)化是一種有效方法，其包括為了改進(jìn)和/或改變酶的性質(zhì)引入導(dǎo)向特定基因的突變。改進(jìn)或改變的酶可以通過發(fā)展或進(jìn)行敏感的高通量篩選方法鑒定，所述方法允許自動篩選很多酶變異體(例如> 104)。通常進(jìn)行重復(fù)的突變和篩選循環(huán)來提供具有優(yōu)化性質(zhì)的酶。能幫助鑒定基因的突變區(qū)的計算算法已經(jīng)開發(fā)出來，并且能顯著減少需要產(chǎn)生和篩選的酶變異的數(shù)量。許多定向進(jìn)化技術(shù)(其綜述參見Hibbert等，Biomol.Eng 22:11-19(2005)；Huisman 和 Lalonde, In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnologyindustries 第 717-742 頁(2007), Patel(ed.), CRC Press ；0tten 和 Quax, Biomol.Eng22:1-9 (2005);以及 Sen 等，AppI Biochem. Biotechnol 143:212-223 (2007))已經(jīng)被開發(fā)成有效產(chǎn)生完全不同的變異庫，并且這些方法已經(jīng)成功應(yīng)用于在很多類酶之間改進(jìn)各種范圍的性質(zhì)。已經(jīng)由定向進(jìn)化技術(shù)改進(jìn)和/或改變的酶特性包括例如，選擇性/特異性一用于轉(zhuǎn)化非天然的底物；溫度穩(wěn)定性-耐高溫過程；pH值穩(wěn)定性——用于在更低或者更高pH值條件下的生物過程；底物或產(chǎn)物耐受性——以便獲得高的產(chǎn)品效價；結(jié)合力(Km)——擴(kuò)大結(jié)合的底物范圍，包括非天然底物；抑制率(Ki )-清除產(chǎn)物，底物，或者關(guān)鍵中間體的抑制作用；活性(kcat)——增加酶促反應(yīng)速率以獲得需要的通量；表達(dá)水平——增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量和總的途徑通量；氧穩(wěn)定性——用于在有氧條件下操作空氣敏感的酶，以及厭氧活性——用于在缺氧條件下操作需氧酶。以下示例的方法已經(jīng)開發(fā)用于基因的突變和多樣化，以定向獲得具體酶的期望性質(zhì)。任何這些都可用來改變/優(yōu)化脫羧酶的活性。EpPCR (Pritchard等，JJ Theor. Biol234:497-509(2005))通過添加Mn2+離子，偏倚dNTP濃度，或者通過其它條件變量，減少PCR反應(yīng)中DNA聚合成酶的保真度引入隨機點突變。把突變限制在感興趣目標(biāo)基因的五步克隆方法包括1)易錯的PCR擴(kuò)增目的基因；2)限制性內(nèi)切酶消化；3)所需DNA片段的凝膠純化；4)連接到載體；5)將基因變異體轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的宿主，和篩選性能改進(jìn)的庫。這種方法能在單一基因內(nèi)同時產(chǎn)生多個突變，這可能是有用的。通過EpPCR可以產(chǎn)生許多突變，因此高通量篩選方法或者選擇方法(尤其是使用機器人)對于鑒定那些具有需要的性質(zhì)的基因是有用的。除了整個環(huán)形質(zhì)粒用作模板外，易于出錯的滾環(huán)擴(kuò)增(epRCA) (Fujii等,NucleicAcids Res 32: el45 (2004);和 Fujii 等，Nat. Protoc. 1:2493-2497 (2006))與 epPCR 具有很多相同單元，并且在最后2個核苷酸具有抗外切核酸酶硫代磷酸連接體的隨機6堿基用于擴(kuò)增質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中，其中質(zhì)粒在串聯(lián)重復(fù)序列重新循環(huán)。調(diào)節(jié)Mn2+濃度可在一定程度改變突變率。此技術(shù)使用簡單的易錯的一步法來產(chǎn)生具有3-4突變/kbp的質(zhì)粒的完整副本。不需要無限制性內(nèi)切酶的消化或者特異的引物。另外，此方法通常作為試劑盒供應(yīng)。
DNA 或者家族改組(Stemmer,P;roc Natl Acad SciU. S. A. 91:10747-10751(1994);和 Stemmer, Nature 370:389-391(1994))通常包括消化具有核酸酶例如DNA酶I或者EndoV的兩個或多個變異基因，以產(chǎn)生一批隨機片，其在DNA聚合成酶存在下通過退火和延伸循環(huán)重組，以構(gòu)建一個嵌合基因庫。當(dāng)一個副本與另一副本(模板開關(guān))配對時片段相互配對并重組。這種方法可用于> Ikbp的DNA序列。除了由片段重組構(gòu)建的變異重組體之外，這種方法在延伸步驟以類似于易錯PCR的比率導(dǎo)入點突變。此方法可用于清除可能引起抗原性的有害的，隨機的和中性的突變。交錯延伸(StEP)(Zhao 等，Nat. Biotechnol 16:258-261 (1998))需要啟動模板，隨后重復(fù)變性和極短的退火/延伸期間(短達(dá)5秒)的2步PCR循環(huán)。增長的片段對不同的模板退火并進(jìn)一步延長，其重復(fù)直到生成全長序列。模板轉(zhuǎn)換意味著大多數(shù)產(chǎn)生的片段具有多個親本。因為相反的突變譜，低保真聚合酶(Taq和Mutazyme)的組合還減少易錯的偏倚。在隨機引發(fā)重組中(RPR)隨機序列引物用來產(chǎn)生很多與模板不同部分互補的短DNA 片段。(Shao 等，Nucleic Acids Res 26:681-683 (1998))通過印PCR 的堿基錯參和錯配產(chǎn)生點突變。基于同源的短DNA片段彼此配對，并且通過重復(fù)的熱循環(huán)重組和重組成全長。在此步驟之前模板的移除保證低的親本重組。與其它大多數(shù)方法一樣，這種方法可通過多次迭代來進(jìn)行以逐步形成獨特性質(zhì)。這項技術(shù)避免序列偏倚，不依賴于基因長度，應(yīng)用時需要非常少的親本DNA。在異源雙鏈重組中線性化的質(zhì)粒DNA用來形成異源雙鏈，其通過錯配修復(fù)來修復(fù)。(Volkov 等，Nucleic Acids Res 27: el8 (1999)；和 Volkov 等，MethodsEnzymoI. 328:456-463(2000))該錯配修復(fù)步驟至少有一些突變。異源雙鏈轉(zhuǎn)化比直鏈同源雙鏈體更有效。這種方法適于大的基因和整個操縱子。過渡模板隨機嵌合生長(RACHITT)(Coco 等，Nat. Biotechnol 19:354-359 (2001))使用DNA酶I斷裂和按大小分級ssDNA。同源片段在缺乏聚合酶的情況下與補充ssDNA腳手架雜交。任何重疊的非雜交片段末端被外切核酸酶向下配平。插入片段之間的缺口，然后連接到一批與腳手架雜交的全長多樣性鏈(包括妨礙擴(kuò)增的U)。該腳手架然后被破壞，并且被與通過PCR擴(kuò)增的多樣性鏈互補的新鏈替換。這種方法包括一個鏈(腳手架)，其來自僅一個親本，而引發(fā)片段來自其它基因；親本腳手架相對選擇。因此，親本片段沒有重退火發(fā)生。重疊片段用外切核酸酶配平。另外，這在概念上類似于DNA改組和StEP。因此，應(yīng)該沒有同胞種，很少無活性和沒有未改組的親本。這種技術(shù)優(yōu)點是相對于標(biāo)準(zhǔn)DNA改組很少或者沒有親本基因產(chǎn)生和導(dǎo)致更多交叉。截短模板重組延伸(RETT)需要使用一批模板在單向ssDNA片段存在下模板調(diào)控從引物單向生長鏈。(Lee等，J. Molec. Catalysis 26:119-129 (2003))不使用DNA內(nèi)切核酸酶。單向ssDNA由DNA聚合酶與隨機引物或者系列缺失與外切核酸酶制造。單向ssDNA僅是模板而非引物。隨機引發(fā)和外切核酸酶作為實際的DNA改組/RACHITT的酶解不導(dǎo)入序列偏倚。RETT可能比StEP容易優(yōu)化，因為其使用正常的PCR條件而不是非常短的延伸。重 組作為PCR步驟的一個組分發(fā)生一而不直接改組。由于缺乏暫停這種方法也可能比StEP更隨機。簡并寡核苷酸基因改組(DOGS)使用簡并引物用來控制分子之間的重組；(Bergquist and Gibbs,Methods MoI. Bio1352:191-204(2007) ;Bergquist等，Biomol.Eng22:63-72(2005) ;Gibbs等，Gene 271:13-20 (2001))這可用來控制其它方法的趨勢，例如DNA改組以再生親本基因。這種方法可以與選擇基因片段的隨機突變(印PCR)結(jié)合。這可能是阻斷親本序列重新形成的一種好 方法。不需要內(nèi)切核酸酶。通過調(diào)整所制片段的輸入濃度，一個能向需要的主鏈偏倚。此方法可使DNA從非親緣親本改組而沒有限制性的酶消化，并且可以選擇隨機突變方法。漸增切割法產(chǎn)生雜和酶(ITCHY)構(gòu)建一個具有I個堿基缺失的目的基因或者基因片段的組合文庫。(Ostermeier 等,Proc Natl Acad Sci U. S. A. 96:3562-3567 (1999);和Ostermeier等,Nat. Biotechnol 17:1205-1209 (1999))在2種不同的基因的相反方向上進(jìn)行截短。它們彼此連接并且融合分子被克隆。這種技術(shù)在2種親本基因之間不需要同源。當(dāng)ITCHY與DNA改組結(jié)合時，該系統(tǒng)稱為SCRATCHY (見下)。主要優(yōu)點都是在親本基因之間不需要同源；例如，在大腸桿菌和人類基因之間的功能融合通過ITCHY來構(gòu)建。當(dāng)建立ITCHY文庫時，所有可能的交叉都被捕獲。硫代磷酸dNTPs用來產(chǎn)生截短除了外，硫代漸增切割法產(chǎn)生雜和酶(THI0-ITCHY)類似于 ITCHY0 (Lutz 等，Nucleic Acids Res 29:E16 (2001))相對于 ITCHY 來說，THI0-ITCHY可能更容易優(yōu)化，提供更多的再現(xiàn)性和可調(diào)性。SCRATCHY與兩種方法ITCHY和DNA改組結(jié)合用于基因重組。(Lutz等，Proc NatlAcad Sci U. S. A. 98:11248-11253 (2001) ) SCRATCHY 與 ITCHY 和 DNA 改組的最好特征相結(jié)合。首先，ITCHY用來在基因片段之間以DNA同源依賴的方式創(chuàng)建一整套融合。這種人造家族然后經(jīng)過一個DNA改組步驟以增加交叉的數(shù)量。計算預(yù)測可用于優(yōu)化。當(dāng)序列同源性低于80%時，SCRATCHY比DNA改組更有效。在隨機漂移突變(RNDM)中突變通過epPCR產(chǎn)生，隨后篩選/選擇保留可用活性的那些(Bergquist等，Biomol. Eng 22:63-72(2005))。然后，將它們用于DOGS與多活性突變之間或者活性突變和某些其它期望的親本之間的融合物產(chǎn)生重組體。旨在促進(jìn)中性突變的分離；其目的是篩選保留的催化活性，不論該活性比原始基因中的更高或者更低。當(dāng)篩選能在背景上檢測活性時，RNDM可用于高通量方法。RNDM已經(jīng)在產(chǎn)生多樣性中用于DOGS前端。這種技術(shù)在改組或者其它后續(xù)過程之前對活性需要產(chǎn)生影響；中性漂移文庫表明導(dǎo)致更高/更快的從小分子文庫中的活性改進(jìn)。雖然已公開使用epPCR，但是這可適用于其它大規(guī)模的突變方法。序列飽和突變(SeSaM)是一種隨機突變方法，其I)使用隨機摻入硫代核苷酸和分裂產(chǎn)生隨機長度的片段池；2)在“普通”堿基例如次黃嘌呤核苷存在下所述的池用作延長的模板；3)復(fù)制含次黃嘌呤核苷的補體，得隨機的堿基摻入以及，從而，發(fā)生突變(Wong等，Biotechnol J 3:74-82 (2008) ;Wong 等，Nucleic Acids Res 32: e26 (2004);以及 Wong 等人，Anal. Biochem. 341:187-189 (2005) )0使用這種技術(shù)，用簡單方法在2_3天內(nèi)產(chǎn)生一個大的突變體文庫是可能的。這種技術(shù)與DNA聚合酶的突變偏倚相比是非定向的。此方法中的差別使這種技術(shù)是對epPCR的補充(或者替代)。在合成改組中，重疊的核苷酸被設(shè)計成編碼“所有的目的基因多樣性”，并且允許經(jīng)改組的后代有非常高的多樣性(Ness等，Nat. Biotechnol 20:1251-1255(2002))。在這種技術(shù)中，技術(shù)人員可設(shè)計待改組的片段。這有助于增加所得后代的多樣性。技術(shù)人員可設(shè)計序列/密碼子偏倚以使更遠(yuǎn)親緣關(guān)系的序列以接近于具有更近親緣關(guān)系的序列所觀察到的比率重新結(jié)合。另外，這種技術(shù)不需要物理上擁有模板基因。核苷酸交換和剪切技術(shù)NexT利用dUTP整合與哌啶進(jìn)行端點DNA片段的結(jié)合，其中dUTP整合之后通過用尿嘧啶DNA糖基化酶處理(Muller等，Nucleic AcidsRes 33:ell7(2005))?；蛴眯酆?酶延伸內(nèi)部PCR引物重組。改組的大小用不同dUPT::dTTP比率直接可控。這是將簡單方法用于尿嘧啶結(jié)合和分裂的一種反應(yīng)端點。其它核苷酸類似物可用于這種方法，例如8-氧代鳥嘌呤。另外，這種技術(shù)用非常短的片段(86bp)很有效，并且具有低的錯誤率。用于這種技術(shù)的DNA化學(xué)切割導(dǎo)致非常少的未改組克隆。在序列同源-獨立的蛋白質(zhì)重組(SHIPREC)中，連接體用于促進(jìn)在兩種遠(yuǎn)親/非親緣基因之間融合。核酸酶處理用于在兩個之間產(chǎn)生很多嵌合體。這些融合導(dǎo)致單點交叉的雜交文庫(Sieber等，Nat. Biotechnol 19:456-460(2001))。這產(chǎn)生有限類型的改組并且獨立過程法是突變所必需的。另外，由于不需要同源性，此技術(shù)可構(gòu)建兩條非親緣親本基因中每一條的各種大小片段的嵌合體文庫。SHIPREC采用細(xì)菌CP450的血紅素結(jié)合域與哺乳動物CP450的N末端區(qū)域的融合進(jìn)行檢驗；這在更易溶解的酶中產(chǎn)生哺乳動物活性。在基因位點飽和突變 (GSSM )中，起始原料是含有一個插入物和兩個引物的超螺旋dsDNA質(zhì)粒，所述引物在突變所期望的位點簡并(Kretz等，MethodsEnzymol. 388:3-11(2004))。引物攜帶有目的突變，在相反的DNA鏈退火成相同序列。突變通常在引物的中間，并且通過正確序列的 20個核苷酸與每邊側(cè)面相接。引物中的序列是NNN或者NNK (編碼^PMNN (非編碼)(N=全部4個堿基，K=G，T，M=A，C)。在延伸之后，DpnI用來消化dam-甲基化的DNA以消除野生型模板。這種技術(shù)在給定的基因座(即一個密碼子)尋找全部可能的氨基酸替換。該技術(shù)有利于不需要無義密碼子在單一位點產(chǎn)生全部可能的替換，并且導(dǎo)致與最大可能等位基因的接近等價的代表相等。這種技術(shù)不需要事先知曉目標(biāo)酶的結(jié)構(gòu)，機理或者結(jié)構(gòu)域。如果繼而進(jìn)行改組或者基因重組，這項技術(shù)產(chǎn)生一個包括單位點向上突變的所有可能組合的重組體的多樣性文庫。應(yīng)用這項技術(shù)的組合已經(jīng)證明成功進(jìn)化超過50種不同的酶，并且也證明了目標(biāo)酶超過一種特性。組合盒式突變(CCM)包括使用短的寡核苷酸盒子替換限制區(qū)域，使大量可能的氨基酸序列改變(Reidhaar-Olson 等，Methods Enzymol. 208:564-586 (1991)；和Reidhaar-Olson等,Science 241:53-57 (1988))。同時在兩個或三個位點替換可用到這種技術(shù)。此外，該方法檢驗在位點的有限范圍內(nèi)可能的序列改變的巨大多樣性。這項技術(shù)已經(jīng)被用于探索DNA結(jié)合域的λ抑制子信息含量。組合多重盒式誘變(CMCM)除了其用作一個更大程序的一部分外基本上類似于CCM: I)將印PCR以高突變率應(yīng)用于2) ID熱點和熱點區(qū)，然后3)通過CMCM延伸至覆蓋蛋白質(zhì)序列空間的定義區(qū)域(Reetz,Μ. Τ.，S. ffilensek, D. Zha,和K. E. Jaeger, 2001, DirectedEvolution of an Enantioselective Enzyme through Combinatorial Multiple-CassetteMutagenesis. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589-3591 )。正如 CCM,這種方法可以檢驗在目標(biāo)區(qū)域的幾乎所有可能的改變。如果隨產(chǎn)生隨機突變和基因改組的方法一起使用，其提供了一種產(chǎn)生多樣性的，改組蛋白質(zhì)的極好手段。這種方法成功增加酶的對映選擇性51倍。在突變株中技術(shù)條件ts突變質(zhì)粒允許在選擇和阻斷積累有害突變的過程中當(dāng)不需要選擇時增加20-至4000-X隨機性和自然突變頻率(Selifonova等，ApplEnviron Microbiol 67:3645-3649 (2001) )0這種技術(shù)是基于質(zhì)粒來源的mutd5基因，其編碼DNA聚合酶III的突變亞基。在含質(zhì)粒的任何菌株中此亞基結(jié)合到內(nèi)源性DNA聚合酶III并妨礙聚合酶III的校對能力。發(fā)生廣譜的堿基替換和移碼突變。為了有效利用，一旦獲得所需的表型應(yīng)刪除突變質(zhì)粒，這通過溫度敏感的復(fù)制起點完成，其可使質(zhì)粒在41°C固化。應(yīng)當(dāng)指出，突變株已經(jīng)被找到相當(dāng)一段時間(例如，參見Low等，J.Mol.Biol. 260:359-3680(1996))。在這種技術(shù)中觀察到非常高的自發(fā)突變率。條件的特性使不期望的背景突變降到最小。這項技術(shù)可以與適應(yīng)性進(jìn)化相結(jié)合，以提高突變率和更快獲得預(yù)期的表型。“精確突變(LTM)是一種多維突變方法，其評估和優(yōu)化組合所選氨基酸的突變?！?Rajpal 等，Proc Natl Acad Sci U.S.A. 102:8466-8471 (2005))，與其用所有可能的氨基酸變化飽和每個位點，不如選擇一組九個來覆蓋氨基酸R-基團(tuán)化學(xué)的范圍。每個位點很少的變化可使多個位點受到這種類型的突變。通過這種方法已經(jīng)實現(xiàn)抗體的親和力增加> 800倍，從低納摩爾到皮摩爾。這是一種合理的方法，通過極大地降低待篩選的克隆數(shù)使隨機組合最小化并且可以增加發(fā)現(xiàn)改進(jìn)性狀的能力。這已應(yīng)用到抗體工程，尤其是增加親和力和/或減少解離。該技術(shù)可與篩選或選擇相結(jié)合?；蛑亟M是一種DNA改組方法，其可同時應(yīng)用于多個基因或者產(chǎn)生單一基因的嵌合體(多個突變)的大型文庫。(可調(diào)的基因重組 (TGR )技術(shù)由Verenium公司提供)，通常這項技術(shù)用于與超高通量篩選組合，以查詢期望的改進(jìn)所代表的序列空間。這種技術(shù)可以讓多基因重組獨立于同源性。交叉事件的確切數(shù)量和位置可使用通過生物信息學(xué)分析設(shè)計的片段預(yù)先確定。這項技術(shù)導(dǎo)致非常高的水平的多樣性，幾乎沒有親本基因的再形成，以及低水平的無效基因。與GSSM 相結(jié)合，可以檢測到改進(jìn)活性的大范圍的突變。該方法可“協(xié)調(diào)”和“微調(diào)”DNA改組，例如密碼子的使用可以得到優(yōu)化。計算機蛋白質(zhì)設(shè)計自動化(PDA)是一種優(yōu)化算法，其錨著于具有特定折疊的結(jié)構(gòu)定義的蛋白質(zhì)骨架，搜尋序列空間的氨基酸替代物，其能夠穩(wěn)定折疊和總的蛋白質(zhì)能量(Hayes 等，Proc Natl Acad Sci U. S. A. 99:15926-15931 (2002) ) 該技術(shù)用于計算機基于結(jié)構(gòu)的熵預(yù)測，目的是尋找對蛋白質(zhì)的氨基酸變化的結(jié)構(gòu)耐受性。統(tǒng)計力學(xué)應(yīng)用于計算每個位置的耦合作用。對氨基酸替代的結(jié)構(gòu)耐受性是一種耦合的測量方法。最終，這項技術(shù)設(shè)計成產(chǎn)生蛋白質(zhì)性質(zhì)所需的修飾而保持結(jié)構(gòu)特點的完整性。方法進(jìn)行計算評估并可過濾極大量的可能的序列變異(105°)。選擇測試的序列變異與基于最有利熱力學(xué)的預(yù)測有關(guān)。表面上只有與穩(wěn)定性有關(guān)的穩(wěn)定性或性質(zhì)可以用這一技術(shù)有效地解決。該方法已成功地用于一些治療性蛋白質(zhì)，尤其是工程免疫球蛋白。計算機預(yù)測避免測試極大量的潛在變異。基于現(xiàn)有的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測很可能比基于假定結(jié)構(gòu)的預(yù)測更容易成功。這種技術(shù)可以很容易地預(yù)測，并且可定向篩選多個同時發(fā)生的突變，這對于純粹的實驗技術(shù)幾乎是不可能的，因為數(shù)量成指數(shù)上升。
重復(fù)飽和突變(ISM)包括1)使用結(jié)構(gòu)/功能知識選擇可能的改善酶的位點；2)使用Stratagene QuikChange (或其它合適的手段)在選擇的位點飽和突變；3)篩選/選擇期望的屬性；和4)用改良的克隆在另一位點開始，并繼續(xù)重復(fù)。(Reetz等，Nat. Protoc2:891-903 (2007);和 Reetz 等，Angew. Chem. Int. Ed Engl45:7745-7751 (2006))這是一個行之有效的方法，其確保在指定位置所有可能的替代都用來篩選/選擇。任何前述的突變方法都可以單獨或者以任何組合方式使用。另外，任何一種或者組合的定向進(jìn)化方法都可用于與合適的進(jìn)化技術(shù)結(jié)合。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該正丙醇途徑具有至少一種編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該正丙醇途徑包括丙醛脫氫酶，丙醇脫氫酶，丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶，丙酰-Cok水解酶，丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸還原酶或者丙酰磷酸還原酶,該異丙醇途徑包括至少一種編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該異丙醇途徑包括乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶或者異丙醇脫氫酶。在上述實施方式的另一方面，該方法包括具有乙酰-CoA途徑的微生物有機體，所述乙酰-Cok途徑具有至少一種編碼乙酰-Cok途徑酶并以足以產(chǎn)生乙酰-Cok的量表達(dá)的外源性核酸，該乙酰-CoA途徑包括丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶或者甲酸脫氫酶。在又一實施方式中，這種方法包括具有丙酰CoA途徑的微生物有機體，所述的丙酰CoA途徑具有至少一種編碼丙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-CoA的量表達(dá)的外源性核酸，該丙酰-Cok途徑包括PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶,琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶或者甲基丙二酰-CoA脫羧酶。另一方面，該丙酰-CoA途徑包括丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶。在又一實施方式中，這種方法包括具有丙酰-CoA途徑的微生物有機體，所述的丙酰-CoA途徑具有至少一種編碼丙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-CoA的量表達(dá)的外源性核酸，該丙酰-Cok途徑包括PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘇氨酸脫氨酶，或者2-氧代丁酸脫氫酶。另一方面，該正丙醇途徑包括2-氧代丁酸脫羧酶。在又一實施方式中，這種方法包括具有丙酰-CoA途徑的微生物有機體，所述的丙酰-CoA途徑具有至少一種編碼丙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-CoA的量表達(dá)的外源性核酸，該丙酰-CoA途徑包括乙酰-CoA羧化酶,丙二酰-CoA還原酶,丙二酸半醛還原酶或者丙酰-CoA合成酶。在又一實施方式中，這種方法包括具有丙酰-CoA途徑的微生物有機體，所述的丙酰-CoA途徑具有至少一種編碼丙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-CoA的量表達(dá)的外源性核酸，該丙酰-CoA途徑包括乳酸脫氫酶，乳酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，乳酰-CoA脫水酶或者丙烯酰-CoA還原酶。在又一實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，該正丙醇途徑具有編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶，丙酰 磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶，并且該異丙醇途徑具有編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在上述實施方式的另一方面，該方法包括具有乙酰-CoA途徑的微生物有機體，所述的乙酰-Cok途徑具有編碼乙酰-Cok途徑酶并以足以產(chǎn)生乙酰-Cok的量表達(dá)的第三組外源性核酸，該第三組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，以及丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原 酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶。在又一實施方式中，該方法包括具有丙酰-CoA途徑的微生物有機體，該丙酰-CoA途徑具有編碼丙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-CoA的量表達(dá)的第三組外源性核酸，該第三組外源性核酸編碼PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，以及甲基丙二酰-CoA脫羧酶。另一方面，該第三組外源性核酸還編碼甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶或者丙酮酸羧化酶。在又一實施方式中，該方法包括具有丙酰-CoA途徑的微生物有機體，該丙酰-CoA途徑具有編碼丙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-CoA的量表達(dá)的第三組外源性核酸，所述的第三組外源性核酸編碼PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘇氨酸脫氨酶，以及2-氧代丁酸脫氫酶。另一方面，該第三組外源性核酸還編碼甲基丙二酰-CoA脫羧酶或者丙酮酸羧化酶。又一方面，第二組外源性核酸還編碼2-氧代丁酸脫羧酶。在又一實施方式中，該方法包括具有丙酰-CoA途徑的微生物有機體，所述的丙酰-Cok途徑具有編碼丙酰-Cok途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-Cok的量表達(dá)的第三組外源性核酸，該第三組外源性核酸編碼乙酰-Cok羧化酶，丙二酰-Cok還原酶，丙二酸半醛還原酶，以及丙酰-CoA合成酶。在又一實施方式中，該方法包括具有丙酰-CoA途徑的微生物有機體，該丙酰-CoA途徑具有編碼乳酸脫氫酶，乳酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，乳酰-CoA脫水酶，以及丙烯酰-CoA還原酶的第三組外源性核酸。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的正丙醇途徑包括編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者琥珀酰-Cok合成酶，甲基丙二酰-Cok變位酶，甲基丙二酰-CoA脫羧酶，以及丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基轉(zhuǎn)移酶和丙酰磷酸還原酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的正丙醇途徑包括編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘇氨酸脫氨酶，以及2-氧代丁酸脫羧酶和丙醇脫氫酶；或者2-氧代丁酸脫氫酶，丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者2-氧代丁酸脫氫酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基轉(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者2-氧代丁酸脫氫酶，丙酰-Cok水解酶或者丙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-Cok合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者2-氧代丁酸脫氫酶，丙酰-Cok水解酶或者丙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。另一方面，該第二組外源性核酸還編碼丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的正丙醇途徑包括編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA還原酶，丙二酸半醛還原酶，丙酰-CoA合成酶，以及丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基轉(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶,并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生正丙醇和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的正丙醇途徑包括編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼乳酸脫氫酶，乳酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，乳酰-CoA脫水酶；烯丙酰-CoA還原酶，以及丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基轉(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶，乙酰-Cok乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生正丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑的微生物有機體，所述的正丙醇途徑包括至少一種編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該正丙醇途徑包括丙醛脫氫酶，丙醇脫氫酶，丙酰-CoA:磷酸丙?；D(zhuǎn)移酶，丙酰-Cok水解酶，丙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸還原酶或者丙酰磷酸還原酶。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生正丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有正丙醇途徑的微生物有機體，所述的正丙醇途徑包括一組編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該組外源性核酸編碼丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基轉(zhuǎn)移酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸還原酶和丙醇脫氫酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸還原酶和丙醇脫氫酶。在上述實施方式的另一方面，產(chǎn)生丙醇的方法包括培養(yǎng)具有正丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體，該有機體還具有丙酰-CoA途徑，所述的丙酰-CoA途徑包括編碼丙酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生丙酰-CoA的量表達(dá)的外源性核酸。例如，在某些方面外源性核酸編碼PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰內(nèi)-Cok轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-Cok合成酶，甲基丙二酰-Cok變位酶或者甲基丙二酰-Cok脫羧酶。另一方面，外源性核酸還編碼甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶。另外，在上述實施方式的又一方面，該產(chǎn)生丙醇的方法包括培養(yǎng)具有正丙醇途徑的非天然存在的微生物有機體，該正丙醇途徑具有編碼正丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生正丙醇的量表達(dá)的第一組外源性核酸，其中第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶或者PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者琥珀酰-Cok合成酶，甲基丙二酰-Cok變位酶，甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶，甲基丙二酰-CoA脫羧酶，丙醛脫氫酶和丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑具有至少一種編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的外源性核酸，該1，4-BD0途徑包括琥珀酰-Cok還原酶，琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，4-羥基丁醛還原酶，4-羥基丁酸還原酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰磷酸還原酶或者4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，該異丙醇途徑包括至少一種編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該異丙醇途徑包括乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶或者異丙醇脫氫酶。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑具有至少一種編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的外源性核酸，該1，3-BD0途徑包括琥珀酰-Cok還原酶，琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)_4_羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，3-羥基丁醛還原酶，3-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，3-羥基丁酰-Cok合成酶，3-羥基丁酰-Cok水解酶或者3-羥基丁酸還原酶或者3-羥基 丁酰-CoA還原酶(形成醇)，該異丙醇途徑包括至少一種編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該異丙醇途徑包括乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶或者異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑具有至少一種編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的外源性核酸，該MAA途徑包括琥珀酰-Cok還原酶，琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，
4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA變位酶，3-羥基異丁酰-CoA脫水酶，甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶，3-羥基異丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-CoA合成酶，3-羥基異丁酰-CoA水解酶，3-羥基異丁酸脫水酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶，甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸還原酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醛)，3-羥基異丁酸脫氫酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醇)或者3-羥基異丁酸脫水酶，該異丙醇途徑包括至少一種編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的外源性核酸，該異丙醇途徑包括乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶或者異丙醇脫氫酶。在上述實施方式的另一方面，該微生物有機體具有一種乙酰-CoA途徑，所述的乙酰-Cok途徑具有至少一種編碼乙酰-Cok途徑酶并以足以產(chǎn)生乙酰-Cok的量表達(dá)的外源性核酸，該乙酰-CoA途徑包括丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶或者甲酸脫氫酶。在上述實施方式的另一方面，該微生物有機體具有一種琥珀酰-CoA途徑，所述的琥珀酰-CoA途徑具有至少一種編碼琥珀酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生琥珀酰-CoA的量表達(dá)的外源性核酸，該琥珀酰-CoA途徑包括PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者琥珀酰-CoA合成酶。另一方面，該琥珀酰-CoA途徑包括丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸還原酶，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-Cok還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，4-羥基丁酰磷酸還原酶，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-Cok還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，以及4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，以及4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)；以及4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。 在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸還原酶，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，4-羥基丁酰磷酸還原酶，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，以及4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，以及4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3- BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者3-羥基丁酰-Cok合成酶或者3-羥基丁酰-Cok水解酶，3-羥基丁酸還原酶，和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-Cok還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA脫氫酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，和3-羥基丁醛還原酶和異丙醇的途徑，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙酰-Cok水解酶或乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA脫氫酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或3-羥基丁酰-CoA合成酶或3-羥基丁酰-CoA水解酶，3-羥基丁酸還原酶和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-Cok還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或4-羥基丁酰-CoA合成；4_羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，和3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙酰-Cok水解酶或乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙酰-Cok水解酶或乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外 源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或3-羥基丁酰-Cok合成酶或3-羥基丁酰-Cok水解酶，3-羥基丁酸還原酶，和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫
酶在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶編碼的外源核酸I磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醛)，和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙酰-Cok水解酶或乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶；4_羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或3-羥基丁酰-CoA合成酶或3-羥基丁酰-CoA水解酶，3-羥基丁酸還原酶，和3-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶；巴豆酸酶，和3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰乙酰-Cok硫解；乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙酰-Cok水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或4-羥基丁酰-Cok合成酶，4-羥基丁酰-Cok變位酶，3-羥基異丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-Cok合成酶或3-羥基異丁酰-CoA水解酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或4-羥基丁酰-Cok合成酶，4-羥基丁酰-Cok變位酶，3-羥基異丁酰-Cok脫水酶，和甲基丙烯酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成，或甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-Cok變位酶，3-羥基異丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-Cok合成酶或者3-羥基異丁酰-CoA水解酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA變位酶，3-羥基異丁酰-CoA脫水酶，以及甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酰-CoA變位酶，3-羥基異丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-CoA合成酶或者3-羥基異丁酰-CoA水解酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源 性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者4-羥基丁酰-Cok合成酶，4-羥基丁酰-CoA變位酶，3-羥基異丁酰-Cok脫水酶，以及甲基丙烯酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA變位酶，3-羥基異丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-CoA合成酶或者3-羥基異丁酰-CoA水解酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-CoA變位酶，3-羥基異丁酰-CoA脫水酶，以及甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醛)；3_羥基異丁酸脫氫酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶，甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶或者甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸還原酶，3-羥基異丁酸脫氫酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-Cok水解酶或者乙酰乙酰-Cok合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶或者甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸還原酶，3-羥基異丁酸脫氫酶，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼甲基丙二酰-Cok變位酶，甲基丙二酰-Cok還原酶(形成醇)，和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶，和異丙醇脫氫酶。在上述實施方式的另一方面，該微生物有機體具有乙酰-CoA途徑，所述的乙酰-Cok途徑具有編碼乙酰-Cok途徑酶并以足以產(chǎn)生乙酰-Cok的量表達(dá)的第三組外源性核酸，該第三組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，以及丙酮酸脫氫酶或者丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脫氫酶。在又一實施方式中，該微生物有機體具有琥珀酰-Cok途徑，所述的琥珀酰-Cok途徑具有編碼琥珀酰-CoA途徑酶并以足以產(chǎn)生琥珀酰-CoA的量表達(dá)的第三組外源性核酸，該第三組外源性核酸編碼PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶和琥珀酰-Cok合成酶。另一方面，該第三組外源性核酸還編碼甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶，丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，4-BD0途徑包括編碼1，4-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，4-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA還原 酶，琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-Cok合成酶，4-羥基丁酰-Cok還原酶(形成醛)，4-羥基丁醛還原酶，4-羥基丁酸還原酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰磷酸還原酶，
4-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，以及4-羥基丁醛還原酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脫氫酶，乙酰-CoA乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，3-BD0和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，3-BD0途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的1，3-BD0途徑包括編碼1，3-BD0途徑酶并以足以產(chǎn)生1，3-BD0的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA還原酶，琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-CoA合成酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-Cok脫水酶，巴豆酸酶，3-羥基丁酰-Cok還原酶(形成醛)，3-羥基丁醛還原酶，3-羥基丁酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，3-羥基丁酰-Cok合成酶，3-羥基丁酰-Cok水解酶，3-羥基丁酸還原酶和3-羥基丁酰-CoA還原酶(形成醇)，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脫氫酶，乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-Cok合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-Cok羧基轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA還原酶，琥珀酸還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-Cok合成酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酸化酶，4-羥基丁酰-Cok變位酶，3-羥基異丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，3-羥基異丁酰-CoA合成酶，3-羥基異丁酰-CoA水解酶，3-羥基異丁酰-CoA脫水酶，甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脫氫酶，乙酰-Cok乙?；蚪饷福阴Ｒ阴?Cok轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-Cok水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶和異丙醇脫氫酶。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生MAA和異丙醇的方法，包括培養(yǎng)一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有MAA途徑和異丙醇途徑的微生物有機體，所述的MAA途徑包括編碼MAA途徑酶并以足以產(chǎn)生MAA的量表達(dá)的第一組外源性核酸，該第一組外源性核酸編碼PEP羧激酶，PEP羧化酶，蘋果酸脫氫酶，延胡索酸酶，延胡索酸還原酶，琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶，甲基丙二酰-CoA變位酶，甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶，甲基丙二酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸還原酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醛)，
3-羥基異丁酸脫氫酶，甲基丙二酰-CoA還原酶(形成醇)和3-羥基異丁酸脫水酶，并且所述的異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶并以足以產(chǎn)生異丙醇的量表達(dá)的第二組外源性核酸，該第二組外源性核酸編碼丙酮酸激酶，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脫氫酶，乙酰-Cok乙?；蚪饷?，乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脫羧酶和異丙醇脫氫酶。 上述每個實施方式的另一方面，所述的外源性核酸是異源核酸。上述每個實施方式的另一方面，所述條件包括基本上厭氧的培養(yǎng)條件。檢測正丙醇，異丙醇，I, 4-BDO, I, 3-BD0和/或MAA的產(chǎn)生的合適的純化和/或方法可以使用眾所周知的方法進(jìn)行。合適的副本數(shù)例如一式三份培養(yǎng)可以用于被檢測的每種工程菌生長。例如，可以檢測在工程產(chǎn)生宿主中形成的產(chǎn)品和副產(chǎn)品。終產(chǎn)物和中間體及其它有機化合物通過如下方法使用本領(lǐng)域中眾所周知的程序分析，例如HPLC (高效液相色譜法)，GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜法)和LC-MS (液相色譜-質(zhì)譜法)或者在其它合適的分析方法。發(fā)酵液內(nèi)中產(chǎn)品的釋放也可用培養(yǎng)上清液檢測。副產(chǎn)品和殘余糖可以通過HPLC或者使用本領(lǐng)域公知的其它合適的分析法和檢測方法來定量，所述的HPLC使用例如示差折光檢測器用于葡萄糖和乙醇，以及紫外檢測器用于有機酸(Lin等，Biotechnol.Bioeng. 90:775-779(2005))。來自外源性DNA序列的個別酶或者蛋白質(zhì)的活性也可使用本領(lǐng)域公知的方法分析。各種醇可以通過氣相色譜法使用如離子焰檢測器來定量，所述的離子焰檢測器描述于 Atsumi 等，Metab Eng (2007)和 Hanai 等人 Appl Environ Microbiol73:7814-7818(2007)中。正丙醇，異丙醇，I, 4-BDO, I, 3-BD0和/或MAA可以使用本領(lǐng)域公知的各種方法從培養(yǎng)中的其它成分中分離出來。這種分離方法包括，例如，提取方法以及包括連續(xù)液-液萃取，滲透蒸發(fā)，膜過濾，膜分離，反滲透，電滲析，蒸餾，結(jié)晶，離心，抽濾，離子交換色譜法，體積排阻色譜法，吸附色譜法和超濾的方法。所有上述的方法都是本領(lǐng)域公知的?？膳囵B(yǎng)本發(fā)明所述的任何非天然存在的微生物有機體以產(chǎn)生和/或分泌本發(fā)明的生物合成產(chǎn)物。例如，可培養(yǎng)正丙醇，異丙醇，I, 4-BDO, I, 3-BD0和/或MAA產(chǎn)生菌以生物合成產(chǎn)生正丙醇，異丙醇，I, 4-BDO, I, 3-BD0和/或MAA。為了產(chǎn)生正丙醇，異丙醇，I, 4-BDO, I, 3-BD0和/或MAA，在含有碳源和其它必需營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌株。有必要保持發(fā)酵罐中的缺氧條件以降低整個方法的費用。這種條件可以例如，通過首先用氮氣給培養(yǎng)基鼓泡，然后用密封螺旋蓋密封燒瓶。對于厭氧下沒有觀察到生長的菌株來說，可以通過在隔板上打一小孔有限通風(fēng)來應(yīng)用微需氧的條件。示例性的厭氧條件前面已經(jīng)描述并且在本技術(shù)領(lǐng)域是眾所周知的。示例性的需氧和厭氧條件描述在，例如，2007年8月10日提交的美國
發(fā)明者A·P·博加德, M·J·伯克, 孫軍, 普里蒂·法克雅, 羅賓·E·奧斯特豪特 申請人:基因組股份公司