專利名稱：診斷細(xì)菌性陰道炎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及檢測(cè)是否存在與細(xì)菌性陰道炎有關(guān)的細(xì)菌以及基于是否存在該細(xì)菌確定診斷分?jǐn)?shù)的方法。
背景技術(shù)：
提供以下描述來幫助讀者理解。所提供的信息或所引用的參考文獻(xiàn)都不能被認(rèn)為是本發(fā)明的現(xiàn)有技木。陰道炎是成年女性最為常見的婦科問題。感染性陰道炎本身主要以三種形式存在細(xì)菌性陰道炎、念珠菌性陰道炎和滴蟲性陰道炎。細(xì)菌性陰道炎在美國影響了正常臨床人群中的高達(dá)25%的女性，近乎為念珠菌性陰道炎的兩倍，且是陰道感染的最常見形式。細(xì)菌性陰道炎是通過兼性厭氧性細(xì)菌取代正常陰道菌群引起的。通常，細(xì)菌性陰道炎的癥狀 是非特異性的，鑒別診斷困難。與細(xì)菌性陰道炎相關(guān)的并發(fā)癥意味著較多的衛(wèi)生保健費(fèi)用負(fù)擔(dān)。例如，細(xì)菌性陰道炎的產(chǎn)科并發(fā)癥包括早產(chǎn)、出生體重過輕嬰兒；羊膜早期破水；羊水感染；產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎；和絨毛膜羊膜炎。而且，懷疑細(xì)菌性陰道炎是大腦性麻痹的多個(gè)原因之一。此外，細(xì)菌性陰道炎的婦科并發(fā)癥包括術(shù)后感染；盆腔炎(PID);異常宮頸涂片；性傳播疾病(STD)易感性増加和子宮切除后感染。而且，細(xì)菌性陰道炎可潛在地為宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)發(fā)展中的人乳頭瘤病毒的輔因子、宮頸癌的先兆。傳統(tǒng)上利用Amsel標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行細(xì)菌性陰道炎(BV)的診斷,或者通過計(jì)算Nugent評(píng)分來診斷，該Amesl標(biāo)準(zhǔn)包括下列中的任意三者陰道分泌物異常、pH值大于4. 5、加入氫氧化鉀后惡臭、或革蘭氏染色劑中存在線索細(xì)胞。所述Nugent評(píng)分是由測(cè)量乳酸桿菌屬(Lactobacillus ssp.)、陰道加特納菌(Gardnerella vaginalis)、擬桿菌屬(Bacteroidesssp.)和動(dòng)彎桿菌屬(Mobiluncus)類的物種的相對(duì)數(shù)量的微觀測(cè)試確定的。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供了一種用于診斷對(duì)象中的細(xì)菌性陰道炎的方法，所述方法包括以下步驟(a)利用來自所述對(duì)象的樣本中的ー種或多種乳酸桿菌的含量以及兩種或兩種以上的病原生物的含量來確定單ー診斷分?jǐn)?shù)；以及(b)將個(gè)體的所述診斷分?jǐn)?shù)與參考分?jǐn)?shù)進(jìn)行比較以確定細(xì)菌性陰道炎的存在，其中，所述單ー診斷分?jǐn)?shù)是通過求得所述ー種或多種乳酸桿菌的含量的對(duì)數(shù)函數(shù)與所述兩種或兩種以上的病原生物的含量的對(duì)數(shù)函數(shù)的比率來確定的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣本是陰道拭子。在一個(gè)實(shí)施方式中，應(yīng)用于所述ー種或多種乳酸桿菌的所述對(duì)數(shù)函數(shù)包括確定所使用的每ー種乳酸桿菌的含量的對(duì)數(shù)的和，且應(yīng)用于所述兩種或兩種以上的病原生物的對(duì)數(shù)函數(shù)包括確定所使用的每ー種病原生物的含量的對(duì)數(shù)的和。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述參考分?jǐn)?shù)為大約0. 2，小于大約0. 2的診斷分?jǐn)?shù)表示存在細(xì)菌性陰道炎。在一個(gè)實(shí)施方式中，應(yīng)用于所述ー種或多種乳酸桿菌的所述對(duì)數(shù)函數(shù)包括確定所使用的每ー種乳酸桿菌的含量的和的對(duì)數(shù)，且應(yīng)用于所述兩種或兩種以上的病原生物的對(duì)數(shù)函數(shù)包括確定所使用的每ー種病原生物的含量的和的對(duì)數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述參考分?jǐn)?shù)為大約0. 2，小于大約0. 2的診斷分?jǐn)?shù)表示存在細(xì)菌性陰道炎。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣本中的ー種或多種乳酸桿菌的含量和兩種或兩種以上的病原生物的含量是通過檢測(cè)表示所述ー種或多種乳酸桿菌和所述兩種或兩種以上的病原生物的核酸來確定的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述檢測(cè)是通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)或核酸雜交進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述檢測(cè)包括擴(kuò)增來自所述樣本中的所述ー種或多種乳酸桿菌以及所述兩種或兩種以上的病原生物(如果存在的話)中的每ー種的片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述片斷是16S核糖體核糖核酸基因的片段。在說明性實(shí)施方式中，所述檢測(cè)是利用TaqMan PCR檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述ー種或多種乳酸桿菌選自嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌、詹氏乳桿菌、惰性乳酸桿菌和陰道乳桿菌(Lactobacillus vaginalis)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述ー種或多種乳酸桿菌的含量是利用能夠檢測(cè)乳酸桿菌屬的引物檢測(cè)的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述能夠檢測(cè)乳酸桿菌屬的引物中的至少ー種引物選自SEQ ID NO :8-9或其互補(bǔ)鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述ー種或者多種乳酸桿菌的含量是利用能夠檢測(cè)嗜酸乳桿囷、卷曲乳桿囷和詹氏乳桿囷的一種或多種引物對(duì)來檢測(cè)的。在Iv實(shí)施方式中，能夠檢測(cè)嗜酸乳桿菌和卷曲乳桿菌的引物中的至少ー種引物選自SEQ ID N0:l-2或其互補(bǔ)鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，能夠檢測(cè)詹氏乳桿菌的引物中的至少ー種引物選自SEQ ID N0:4-5或其互補(bǔ)鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，能夠檢測(cè)陰道乳桿菌的引物中的至少ー種引物選自SEQ ID NO:20-21或其互補(bǔ)鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述兩種或兩種以上的病原生物中的至少ー種選自陰道阿托波氏菌、巨型球菌屬和陰道加持納菌。在一個(gè)實(shí)施方式中，能夠檢測(cè)陰道阿托波氏菌的引物中的至少ー種引物選自SEQ ID NO: 11-12或其互補(bǔ)鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，能夠檢測(cè)巨型球菌屬的引物中的至少ー種引物選自SEQ ID NO: 14-15或其互補(bǔ)鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，能夠檢測(cè)陰道加特納菌的引物中的至少ー種引物選自SEQ ID NO: 17-18或其互補(bǔ)鏈。在上述任一具體實(shí)施方式
中，所述對(duì)數(shù)函數(shù)可以是本文中確定的算法1-10中的任一算法。所述算法中確定的具體生物僅用作示例。任ー種乳酸桿菌物種的測(cè)量含量可以被任何其他非病原乳酸桿菌的測(cè)量含量代替。而且，任何病原菌的測(cè)量含量可以被任何其他病原菌的測(cè)量含量代替。一方面，本發(fā)明提供了一種用于診斷細(xì)菌性陰道炎的試劑盒，所述試劑盒包括用于擴(kuò)增來自ー種或多種乳酸桿菌的核酸的片段的引物對(duì)和用于擴(kuò)增來自兩種或兩種以上的病原生物的核酸的片段的多個(gè)引物對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，至少ー個(gè)引物對(duì)選自SEQID NO:1/2、SEQ ID NO:4/5,SEQ ID NO:8/9,SEQ ID NO:11/12、SEQ ID NO:14-15、SEQ IDNO: 17/18或其互補(bǔ)鏈?！矫?，本發(fā)明提供了ー種基本上純化的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有選自SEQID NO: 1-19或其互補(bǔ)鏈的序列。


、圖I為示出根據(jù)Nugent評(píng)分分類的包含各種細(xì)菌的拭子樣品的百分比的圖表。所述細(xì)菌是根據(jù)本發(fā)明的說明性實(shí)施方式檢測(cè)的。圖2為示出根據(jù)Nugent評(píng)分分類的來自患者的拭子樣品中的細(xì)菌的平均量的圖表。所述細(xì)菌是根據(jù)本發(fā)明的說明性實(shí)施方式檢測(cè)的。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了通過以下步驟來診斷細(xì)菌性陰道炎(BV)的方法在來自個(gè)體的測(cè)試核酸樣本中，檢測(cè)與BV的診斷相關(guān)的各種菌種所對(duì)應(yīng)的ー個(gè)或多個(gè)核酸片段。在特定的實(shí)施方式中，檢測(cè)對(duì)應(yīng)于乳酸桿菌和ー種或多種病原菌的核酸片段。可以在ー個(gè)或多個(gè)子測(cè)定中來進(jìn)行該測(cè)定以檢測(cè)所關(guān)注的細(xì)菌目標(biāo)。例如，ー個(gè)子測(cè)定檢測(cè)產(chǎn)生過氧化物的乳酸桿菌(“測(cè)定A”);一個(gè)子測(cè)定檢測(cè)所有的乳酸桿菌(“測(cè)定B”);一個(gè)子測(cè)定檢測(cè)病原菌巨型球菌屬和陰道阿托波氏菌(“測(cè)定C”)；以及ー個(gè)子測(cè)定檢測(cè)病原菌陰道加特納菌(“測(cè)定D”)。該信息可以用來確定個(gè)體是否患有BV。在一些實(shí)施方式中，確定對(duì)應(yīng)于BV診斷的診斷分?jǐn)?shù)。例如，可以通過求得ー種或多種乳酸桿菌的含量的對(duì)數(shù)函數(shù)與兩種或兩種以上的病原生物的含量的對(duì)數(shù)函數(shù)的比率來確定所述分?jǐn)?shù)。 在實(shí)施本文描述的方法中，使用分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA方面的很多傳統(tǒng)技術(shù)。這些技術(shù)是公知的且分別在例如以下的文獻(xiàn)中予以描述Current Protocols in Molecular Biology,第 I-III卷,Ausubel 編(1997) ；Sambrook 等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY，1989) ;DNA Cloning: A PracticalApproach,第 I 卷和第 II 卷，Glover 編(1985);Oligonucleotide Synthesis, Gait編(1984);Nucleic Acid Hybridization, Hames&Higgins 編(1985);Transcriptionand Translation, Hames&Higgins 編(1984);Animal Cell Culture, Freshney 編(1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL 出版社，1986);Perbal, A PracticalGuide to Molecular Cloning;系列期刊，Meth. Enzymol ，(美國學(xué)術(shù)出版社有限公司，1984) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos 編(冷泉港實(shí)驗(yàn)室,NY, 1987);和 Meth. EnzymoI.,第 154 卷和第 155 卷,分別由 ffu&Grossman 和 Wu 編。下文提供了本說明書中使用的一些術(shù)語的定義。除非另有說明，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)用語通常具有和本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的意思相同的意思。除非內(nèi)容另有清楚指明，否則本說明和所附的權(quán)利要求中使用的単數(shù)形式“一”和“該”包括復(fù)數(shù)的引用對(duì)象。例如，所提及的“一核酸“包括兩個(gè)核酸或兩個(gè)以上的核酸的組
I=I 寸 o本文中使用的術(shù)語“擴(kuò)增”表示現(xiàn)有技術(shù)已知的用于復(fù)制目標(biāo)核酸且由此增大所選擇的核酸序列的拷貝的數(shù)量的ー種或多種方法。擴(kuò)增可以是以指數(shù)的或線性的。目標(biāo)核酸可以是DNA或RNA。以此方式擴(kuò)增的序列形成“擴(kuò)增子”。盡管下文描述的示例性方法涉及利用聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)進(jìn)行擴(kuò)増，但在現(xiàn)有技術(shù)中已知用于擴(kuò)增核酸的很多其他方法(例如，等溫法、滾環(huán)法等)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，這些其他的方法可以替代PCR方法使用或者可以與PCR方法一起使用。例如，參見Saiki, “Amplification of GenomicDNA”, PCR Protocols, Innis 等編，Academic Press,圣地亞哥，カロ利福尼亞 1990，第 13-20頁;Wharam 等，Nucleic Acids Res.，2001，29(11):E54_E54;Hafner 等，Biotechniques2001，30 (4):852-6，858，860;Zhong 等，Biotechniques, 2001，30(4):852-6，858，860。本文中使用的術(shù)語“互補(bǔ)鏈”根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)沃森-克里克堿基配對(duì)法則表示核酸的互補(bǔ)序列?；パa(bǔ)序列還可是與DNA序列互補(bǔ)的RNA序列或者其互補(bǔ)序列，也可以是cDNA。本文中使用的術(shù)語“基本上互補(bǔ)” 表示兩個(gè)序列在嚴(yán)格的雜交條件下雜交。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，基本上互補(bǔ)的序列不需要沿著它們的整個(gè)長度雜交。尤其是，基本上互補(bǔ)的序列包括位于3’到5’的不與目標(biāo)序列或標(biāo)記序列雜交的堿基的連續(xù)序列或者在嚴(yán)格的雜交條件下與目標(biāo)序列或標(biāo)記序列雜交的堿基的連續(xù)序列。本文中使用的術(shù)語“診斷”指的是區(qū)分或確定疾病、綜合征或病癥，或者指的是區(qū)分或確定患有特定的疾病、綜合征或病癥的人。在本發(fā)明的說明性實(shí)施方式中，測(cè)定和算法用來基于分析樣本來診斷對(duì)象中的細(xì)菌性陰道炎。本文中使用的術(shù)語“雜交”或“特異性雜交”指的是兩個(gè)互補(bǔ)的核酸鏈在適當(dāng)嚴(yán)格的條件下彼此退火結(jié)合。通常利用探針長度的核酸分子來進(jìn)行雜交。核酸雜交技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的。例如，參見Sambrook 等，1989，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，普萊恩維尤，紐約州。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解如何估計(jì)和調(diào)整雜交條件的嚴(yán)格度，使得具有至少所需程度的互補(bǔ)性的序列將穩(wěn)定地雜交，而具有較低互補(bǔ)性的序列將不能穩(wěn)定地雜交。關(guān)于雜交條件和參數(shù)的示例，例如參見Sambrook 等，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，普萊恩維尤，紐約州;Ausubel, F. M.等，1994，Current Protocols in MolecularBiology. John Wiley & Sons,斯考克斯市，新澤西州。當(dāng)指的是核酸(例如，比如RNA、DNA的寡核苷酸或者混合聚合物)時(shí)，“分離”表示與基因組的大部分分開的核酸，在該基因組中，該核酸天然地存在；和/或基本上與天然地與該核酸一起的其他細(xì)胞成分分開的核酸。例如，以合成方式(例如，通過連續(xù)堿基縮合)產(chǎn)生的任何核酸被認(rèn)為是分離的。同樣，重組表達(dá)、克隆、由引物延伸反應(yīng)(例如，PCR)產(chǎn)生、或者從基因組切除的核酸也認(rèn)為是分離的。本文中使用的術(shù)語“片段”表示長度至少為約15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、300、400、500、1000個(gè)核苷酸或更多核苷酸的多核苷酸。本文中使用的術(shù)語“核酸”泛指染色體的段；DNA、cDNA和/或RNA的段或部分。核酸可以自最初與任何源分離的核酸樣本(例如，與樣本DNA或RNA分離、從樣本DNA或RNA純化、擴(kuò)增、克隆或逆轉(zhuǎn)錄)獲取或獲得。本文中使用的術(shù)語“寡核苷酸”表示由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任意組合構(gòu)成的短聚合物。寡核苷酸的長度通常在大約10個(gè)核苷酸和大約100個(gè)核苷酸之間。寡核苷酸優(yōu)選地長度為15個(gè)核苷酸到70個(gè)核苷酸，最通常的是20個(gè)核苷酸到26個(gè)核苷酸。寡核苷酸可以用作引物或探針。當(dāng)寡核苷酸和核酸對(duì)齊時(shí)，如果該寡核苷酸與該核酸的一部分具有至少50%的序列同源性，則該寡核苷酸對(duì)該核酸為“特異”的。對(duì)ー核酸特異的寡核苷酸是這樣的寡核苷酸在合適的雜交條件或洗滌條件下，其能夠與所關(guān)注的目標(biāo)雜交且基本上不與未關(guān)注的核酸雜交。較高程度的序列同源性是優(yōu)選的且包括至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同源性。
本文中使用的用于擴(kuò)增的“引物”是特異性地退火結(jié)合至目標(biāo)核苷酸序列或標(biāo)記核苷酸序列的寡核苷酸。該引物的3’核苷酸應(yīng)當(dāng)與相對(duì)應(yīng)的核苷酸位置的目標(biāo)序列或標(biāo)記序列相同以通過聚合酶實(shí)現(xiàn)最佳的引物延伸。本文中使用的術(shù)語“正向引物”(forwardprimer)是與雙鏈DNA (dsDNA)的反義鏈退火結(jié)合的引物?！胺聪蛞铩?reverse primer)與dsDNA的有義鏈退火結(jié)合。本文中使用的術(shù)語“樣本”或“測(cè)試樣本”指的是含核酸的任何液體材料或固體材料。在合適的實(shí)施方式中，測(cè)試樣本從生物源獲取(即，“生物樣本”)，比如培養(yǎng)中的細(xì)胞，或者是來自動(dòng)物且最優(yōu)選地來自人類的組織樣本。在示例性實(shí)施方式中，所述樣本是陰道拭子。本文中使用的術(shù)語“目標(biāo)核酸”指的是針對(duì)其設(shè)計(jì)探針或引物的染色體的片段、具有或者不具有基因間序列的完整基因、具有或不具有基因間序列的基因的片段或部分或者 核酸序列。目標(biāo)核酸可以包括野生型序列；含突變、刪除或復(fù)制的核酸序列；串聯(lián)重復(fù)區(qū)；所關(guān)注的基因；所關(guān)注的基因的區(qū)域或者其任何上游區(qū)域或下游區(qū)域。目標(biāo)核酸可以表示特定基因的替代序列或等位基因。目標(biāo)核酸可以從基因組DNA、cDNA或RNA獲得。本文中使用的目標(biāo)核酸可以是天然DNA或經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)核酸是來自細(xì)菌種群的16S核糖體RNA基因的片段。本文中使用的術(shù)語“嚴(yán)格性”用來指進(jìn)行核酸雜交的溫度、離子強(qiáng)度和其他化合物的存在的條件。在高嚴(yán)格性條件下，將僅在具有含高頻率的互補(bǔ)堿基序列的足夠長的片段的核酸之間發(fā)生核酸堿基配對(duì)。示例性的雜交條件如下。高嚴(yán)格性通常指的是這樣的條件在65°C下且在0. 018M的NaCl中，僅允許那些形成穩(wěn)定的雜交產(chǎn)物的核酸雜交。例如，可以通過以下來提供高嚴(yán)格性條件在50%的甲酰胺、5X Denhardt溶液、5X SSC (鹽水檸檬酸鈉)、0. 2%的SDS (十二烷基硫酸鈉)中且在42°C下雜交，之后在0. IX SSC和0. 1%SDS中且在65°C下洗滌。中度嚴(yán)格性指的是等效于以下的條件在50%的甲酰胺、5X Denhardt溶液、5X SSC,0. 2%的SDS中且在42°C下雜交，之后在0. 2X SSC和0. 2%的SDS中且在65°C下洗滌。低嚴(yán)格性指的是等效于以下的條件在50°C下，在10%的甲酰胺、5X Denhardt溶液、6X SSC,0. 2%的SDS中雜交，之后在IX SSC和0. 2%的SDS中洗滌。本文中使用的術(shù)語“患者”指的是接受醫(yī)療護(hù)理、照顧或治療的對(duì)象。本文中使用的該術(shù)語包括患有或疑似患有疾病的人，包括具有疾病的癥狀但尚未得到診斷的人。本文中使用的術(shù)語“病原體”和語法等效物指的是與病情(例如，細(xì)菌性陰道炎)有關(guān)的微生物。病原體可以包括被視為共生體但在某些條件下可以參與病理過程的生物體。因此，參與形成細(xì)菌性陰道炎的病原生物體包括陰道加特納菌，該陰道加特納菌在其他的環(huán)境下可以被分類為共生體。病原體可以以其細(xì)胞外成分(例如，蛋白質(zhì)等)表征，所述細(xì)胞外成分由該病原體分泌、產(chǎn)生或排出，由此使該對(duì)象患上與該病原體相關(guān)的病情。如本文中所公開的，與細(xì)菌性陰道炎相關(guān)的病原體包括但不限于陰道加特納菌、陰道阿托波氏菌和巨型球菌屬。該術(shù)語“病原體”還意欲包括目前未知但未來可以發(fā)現(xiàn)的致病原，因?yàn)樗鲋虏≡鳛椴≡w的特征將可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。用于檢測(cè)細(xì)菌件陰道炎的測(cè)定細(xì)菌性陰道炎(BV)是女性中最為常見的陰道感染，其特點(diǎn)為正常陰道菌群的失衡。在ー個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)是否存在與BV有關(guān)的細(xì)菌以及基于是否存在該細(xì)菌來確定診斷分?jǐn)?shù)的方法。盡管不期望受限于理論，但認(rèn)為各種乳酸桿菌菌種的存在對(duì)BV具有預(yù)防性，同時(shí)認(rèn)為ー種或多種病原體(比如，加持納菌屬、動(dòng)彎桿菌屬、擬桿菌屬、阿托波氏菌和巨型球菌屬)的存在是疾病的ー些指標(biāo)。僅這些細(xì)菌種類中的一種細(xì)菌對(duì)于提供BV的診斷而言是不必要且不充分的，但是，基于是否存在這些細(xì)菌的評(píng)分在診斷BV中是有用的(見下ー節(jié))。在一個(gè)實(shí)施方式中，BV的測(cè)定包括檢測(cè)與診斷BV相關(guān)的各種細(xì)菌種群所對(duì)應(yīng)的核酸片段。可以用下文進(jìn)ー步詳細(xì)描述的各種方式檢測(cè)核酸片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以利用PCR來執(zhí)行BV的測(cè)定。在具體的實(shí)施方式中，可以利用多重PCR形式來執(zhí)行BV的測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方式中，在兩個(gè)孔中都用多重形式進(jìn)行測(cè)試。例如，ー個(gè)孔可以包括乳酸桿菌的測(cè)試，而另一孔包括陰道阿托波氏菌和巨型球菌屬的測(cè)試。在另ー示例中，一個(gè)孔包括乳酸桿菌的測(cè)試，而另一孔包括病原體陰道阿托波氏菌、巨型球菌屬和陰道加特納菌的測(cè)試。在ー個(gè)方面中，本文描述的方法設(shè)計(jì)成檢測(cè)各種乳酸桿菌和與BV有關(guān)的致病物種?？梢砸远嘀氐男问揭圆煌呐渲媒M合測(cè)定。本文中稱為“測(cè)定A”的ー個(gè)子測(cè)定包括用·于檢測(cè)密切相關(guān)的菌種ー嗜酸乳酸菌和卷曲乳桿菌的ー個(gè)測(cè)試以及用于檢測(cè)詹氏乳桿菌的另ー測(cè)試。這三種菌種都是過氧化物產(chǎn)生者且與疾病呈負(fù)相關(guān)。用于過氧化物測(cè)定的示例性的TaqMan_ 引物和探針示在表I中。表I.用于測(cè)定A的示例性引物和探針
~試劑名稱~I~目標(biāo)細(xì)菌~I序列(5’至3’)I SEQ ID NO:
嗜酸釓桿菌/卷嗜酸乳軒菌 5’-TGCCCCATAGTCTGGGATAC-3’I
曲乳軒菌卷曲乳桿菌
正向
嗜酸乳桿菌/卷嗜酸乳桿菌 5,-ATGTGGCCGATCAGTCTCTC'V2
曲乳桿菌卷曲乳料菌
一反向____
嗜酸乳桿菌 / 卷嗜酸乳桿菌 5’[Q670]-CCGGATAArTAAAriCAGATCGCATrrA4BHQ2]-T3
曲乳ホf菌卷曲乳桿菌
探針.
詹氏乳桿鋳詹氏乳桿菌 5’-AGTAACGCGTGGGTAACCTG-3，4
正向
詹氏乳桿菌詹氏乳桿菌 5'-GTCCAICCTTTAGCGACAGC-3!5
反向
詹氏乳桿菌詹氏乳桿菌 5、[FAM ト CCGGATAAAAGCTACTTTCGCATGA-[BHQl；|-3， 6探針_^^^_本文中稱為“測(cè)定B”的第二子測(cè)定包括和測(cè)定A相同的用于嗜酸乳酸菌/卷曲乳桿菌和詹氏乳桿菌的測(cè)試，但還包括第三測(cè)試-乳酸桿菌屬測(cè)定，該乳酸桿菌屬測(cè)定檢測(cè)乳酸桿菌屬的所有成員。選擇性地，測(cè)定B還可包括用以檢測(cè)陰道乳桿菌(Lvaginalis)的測(cè)定。盡管并未示出與BV病情相關(guān)的所有乳酸桿菌，但在根據(jù)測(cè)定A在臨床樣本中不存在產(chǎn)生過氧化物的菌群的情況下測(cè)定B可以提供有用的信息。針對(duì)測(cè)定B的示例性引物和探針示在表2中。表2.用于測(cè)定B的示例性引物和探針
權(quán)利要求
1.一種用于診斷對(duì)象中的細(xì)菌性陰道炎的方法，所述方法包括以下步驟 (a)利用來自所述對(duì)象的樣本中的ー種或多種乳酸桿菌的含量以及兩種或兩種以上的病原生物的含量來確定單ー診斷分?jǐn)?shù)；以及 (b)將個(gè)體的所述診斷分?jǐn)?shù)與參考分?jǐn)?shù)進(jìn)行比較以確定細(xì)菌性陰道炎的存在， 其中，所述單ー診斷分?jǐn)?shù)是通過求得所述ー種或多種乳酸桿菌的含量的對(duì)數(shù)函數(shù)與所述兩種或兩種以上的病原生物的對(duì)數(shù)函數(shù)的比率來確定的。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，應(yīng)用于所述ー種或多種乳酸桿菌的所述對(duì)數(shù)函數(shù)包括確定所使用的每ー種乳酸桿菌的含量的對(duì)數(shù)的和，且應(yīng)用于所述兩種或兩種以上的病原生物的對(duì)數(shù)函數(shù)包括確定所使用的每ー種病原生物的含量的對(duì)數(shù)的和。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述參考分?jǐn)?shù)為大約0.2，小于大約0. 2的診斷分?jǐn)?shù)表示存在細(xì)菌性陰道炎。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，應(yīng)用于所述ー種或多種乳酸桿菌的所述對(duì)數(shù)函數(shù)包括確定所使用的每ー種乳酸桿菌的含量的和的對(duì)數(shù)，且應(yīng)用于所述兩種或兩種以上的病原生物的對(duì)數(shù)函數(shù)包括確定所使用的每ー種病原生物的含量的和的對(duì)數(shù)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述參考分?jǐn)?shù)為大約0.2，小于大約0. 2的診斷分?jǐn)?shù)表示存在細(xì)菌性陰道炎。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣本中的ー種或多種乳酸桿菌的含量和兩種或兩種以上的病原生物的含量是通過檢測(cè)表示所述ー種或多種乳酸桿菌和所述兩種或兩種以上的病原生物的核酸來確定的。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，ー種或多種生物的含量是通過聚合酶鏈反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)或核酸雜交來確定的。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其中，ー種或多種生物的含量是通過擴(kuò)增來自所述樣本中如果存在的所述ー種或多種乳酸桿菌以及所述兩種或兩種以上的病原生物中的每ー種的片段來確定的。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述片段是16S核糖體核糖核酸基因的片段。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中，所述擴(kuò)增是通過聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述擴(kuò)增利用可檢測(cè)到的被標(biāo)記的引物。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述檢測(cè)是利用電泳實(shí)現(xiàn)的。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述檢測(cè)是利用TaqMan PCR檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣本是陰道拭子。
15.如權(quán)利要求I到14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述ー種或多種乳酸桿菌選自嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌、詹氏乳桿菌、惰性乳酸桿菌和陰道乳桿菌。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述ー種或多種乳酸桿菌的含量是利用能夠檢測(cè)乳酸桿菌屬的弓I物檢測(cè)的。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述能夠檢測(cè)乳酸桿菌屬的引物中的至少ー種選自SEQ ID NO :8-9或其互補(bǔ)鏈。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述ー種或者多種乳酸桿菌的含量是利用能夠檢測(cè)嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌和詹氏乳桿菌的ー種或多種引物對(duì)來檢測(cè)的。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，能夠檢測(cè)嗜酸乳桿菌和卷曲乳桿菌的引物中的至少ー種選自SEQ ID NO: 1-2或其互補(bǔ)鏈。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，能夠檢測(cè)詹氏乳桿菌的引物中的至少ー種選自SEQ ID NO:4-5或其互補(bǔ)鏈。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，能夠檢測(cè)陰道乳桿菌的的引物中的至少ー種選自SEQ ID NO:20-21或其互補(bǔ)鏈。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述兩種或兩種以上的病原生物中的至少ー種選自陰道阿托波氏菌、巨型球菌屬和陰道加持納菌。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，能夠檢測(cè)陰道阿托波氏菌的引物中的至少ー種選自SEQ ID NO: 11-12或其互補(bǔ)鏈。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，能夠檢測(cè)巨型球菌屬的引物中的至少ー種選自SEQ ID NO: 14-15或其互補(bǔ)鏈。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，能夠檢測(cè)陰道加特納菌的引物中的至少ー種選自SEQ ID NO: 17-18或其互補(bǔ)鏈。
26.一種用于診斷細(xì)菌性陰道炎的試劑盒，所述試劑盒包括用于擴(kuò)增來自ー種或多種乳酸桿菌的核酸的片段的引物對(duì)和用于擴(kuò)增來自兩種或兩種以上的病原生物的核酸的片段的多個(gè)引物對(duì)。
27.如權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中，至少ー個(gè)引物對(duì)選自SEQID NO: 1/2, SEQ IDNO:4/5, SEQ ID NO:8/9, SEQ ID NO: 11/12、SEQ ID NO: 14-15、SEQ ID NO: 17/18、SEQ IDNO :20/21或其互補(bǔ)鏈。
28.—種基本上純化的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有選自SEQ ID NO: 1-22或其互補(bǔ)鏈的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于基于分析患者樣本來診斷細(xì)菌性陰道炎的方法。例如，分析患者測(cè)試樣本中是否存在一種或多種乳酸桿菌以及兩種或兩種以上的病原生物?？梢岳门c每一種目標(biāo)生物體相對(duì)應(yīng)的核酸片段的PCR分析，來檢測(cè)是否存在一種或多種乳酸桿菌以及兩種或兩種以上的病原生物。接著，所述目標(biāo)生物體的量可以用來確定指示細(xì)菌性陰道炎的診斷的分?jǐn)?shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102770559SQ201080063023
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日
發(fā)明者埃里克·P·約翰遜, 戴爾·A·施瓦布 申請(qǐng)人:奎斯特診斷投資有限公司