專利名稱：從源于人胚胎干細(xì)胞的成血管細(xì)胞產(chǎn)生自然殺傷細(xì)胞和樹突細(xì)胞的方法
從源于人胚胎干細(xì)胞的成血管細(xì)胞產(chǎn)生自然殺傷細(xì)胞和樹突細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從成血管細(xì)胞產(chǎn)生自然殺傷(NK)細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DC)。
背景技術(shù)：
本文的所有出版物都通過引用并入，其引用程度就如同將每一個別出版物或?qū)＠暾執(zhí)囟ㄇ覀€別地指出通過引用并入。以下描述包括在理解本發(fā)明時可能有用的信息。并不承認(rèn)本文提供的任何信息是現(xiàn)有技術(shù)或與要求保護(hù)的本發(fā)明相關(guān)，或明確或暗中提到的任何出版物是現(xiàn)有技術(shù)。用人和小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)的研究顯示，血管(內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞)和稱之為成血管細(xì)胞的造血細(xì)胞系二者的共同前體可在培養(yǎng)中從源于ESC的胚狀體產(chǎn)生。發(fā)明人組開 發(fā)了簡單策略以在無血清的及無間質(zhì)的條件下自多種hESC系有效和可再現(xiàn)地產(chǎn)生成血管細(xì)胞，這對于它們在再生醫(yī)學(xué)中的生產(chǎn)用途是重要的。之前工作顯示，源于hESC的成血管細(xì)胞可有效分化為紅細(xì)胞系和骨髓樣系，但它們產(chǎn)生淋巴樣系細(xì)胞，包括具有免疫治療潛能的那些的能力是相對未知的。自然殺傷(NK)細(xì)胞，其通過淋巴樣系發(fā)生，且是先天性免疫系統(tǒng)的部分，可用于抗-癌治療，由于它們已被發(fā)現(xiàn)檢測及殺特定類型的腫瘤細(xì)胞。樹突細(xì)胞(DC)，其通常通過骨髓樣系(自單核細(xì)胞)發(fā)生，且是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的部分，可用于通過它們呈遞抗原及刺激幼稚和記憶T細(xì)胞的能力增強(qiáng)抗原-特異性免疫應(yīng)答(例如，基于DC的疫苗治療)?？紤]到免疫治療潛能，本領(lǐng)域中存在對產(chǎn)生自然殺傷(NK)細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DC)的方法的需求。發(fā)明概述連同組合物和方法描述和闡釋以下實施方案和其方面，這意為示例性和說明性的，并非對范圍的限制。本發(fā)明的各種實施方式提供產(chǎn)生自然殺傷(NK)細(xì)胞的方法，包括提供成血管細(xì)胞；在甲基纖維素和包含IL2，IL3，IL6，IL7，IL15，SCF和FL的第I細(xì)胞因子混合物上培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞；收獲培養(yǎng)的細(xì)胞；及在包含人血清，及包含IL7，IL15，SCF和FL的第2細(xì)胞因子混合物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)收獲的細(xì)胞以產(chǎn)生NK細(xì)胞。在各種實施方式中，甲基纖維素可為H4236甲基纖維素。在其他實施方式中，甲基纖維素可為H4536甲基纖維素。在各種實施方式中，IL2的濃度可為約5 10ng/ml，IL3的濃度可為約I IOng/ml, IL6的濃度可為約I 10ng/ml, IL7的濃度可為約5 20ng/ml, IL15的濃度可為約5 10ng/ml, SCF的濃度可為約10 50ng/ml,及FL的濃度可為約10 50ng/ml。在各種實施方式中，培養(yǎng)成血管細(xì)胞可持續(xù)約6 8天。在各種實施方式中，培養(yǎng)收獲的細(xì)胞可持續(xù)約14 21天。在各種實施方式中，方法可還包括每周更換培養(yǎng)基以更新第2細(xì)胞因子混合物。
在各種實施方式中，成血管細(xì)胞可分化自人胚胎干細(xì)胞(hESC)。在其他實施方式中，成血管細(xì)胞可分化自誘導(dǎo)的多能(iPS)細(xì)胞。在各種實施方式中，NK細(xì)胞可為未成熟的NK細(xì)胞，且可為⑶56+和⑶16-。在其他實施方式中，NK細(xì)胞可為成熟NK細(xì)胞，且可為⑶56-和⑶16+，或⑶561ο和⑶16+。本發(fā)明的各種實施方式提供產(chǎn)生自然殺傷(NK)細(xì)胞的方法，包括提供成血管細(xì)胞；在包含人血清，及包含IL2，IL3，IL6，IL7，IL15和SCF的第I細(xì)胞因子混合物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞；收獲培養(yǎng)的細(xì)胞；及在包含人血清，及包含IL7，IL15，SCF和FL的第2細(xì)胞因子混合物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)收獲的細(xì)胞以產(chǎn)生ΝΚ。在各種實施方式中，IL2的濃度可為約5 10ng/ml，IL3的濃度可為約I IOng/ml, IL6的濃度可為約I 10ng/ml, IL7的濃度可為約5 20ng/ml, IL15的濃度可為約5 10ng/ml, SCF的濃度可為約10 50ng/ml,及FL的濃度可為約10 50ng/ml。在各種實施方式中，培養(yǎng)成血管細(xì)胞可持續(xù)約6 8天。在各種實施方式中，培養(yǎng) 收獲的細(xì)胞可持續(xù)約14 21天。在各種實施方式中，方法可還包括每周更換培養(yǎng)基以更新第2細(xì)胞因子混合物。在各種實施方式中，成血管細(xì)胞可分化自人胚胎干細(xì)胞(hESC)。在其他實施方式中，成血管細(xì)胞可分化自誘導(dǎo)的多能(iPS)細(xì)胞。在各種實施方式中，NK細(xì)胞可為未成熟的NK細(xì)胞，且可為⑶56+和⑶16-。在其他實施方式中，NK細(xì)胞可為成熟NK細(xì)胞，且可為⑶56-和⑶16+，或⑶561ο和⑶16+。本發(fā)明的各種實施方式提供由本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的自然殺傷(NK)細(xì)胞。本發(fā)明的其他實施方式提供藥學(xué)可接受的組合物，其包含一定量的由本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的NK細(xì)胞。本發(fā)明的各種實施方式提供產(chǎn)生樹突細(xì)胞(DC)的方法，包括提供成血管細(xì)胞；在包含人血清，SCF，F(xiàn)L，IL3和GM-CSF的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞；將IL4添加到所述液體培養(yǎng)基；及進(jìn)一步培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞以產(chǎn)生DC。在各種實施方式中，培養(yǎng)成血管細(xì)胞可持續(xù)約7 11天。在各種實施方式中，在添加IL4之后培養(yǎng)成血管細(xì)胞可持續(xù)約8 10天。在各種實施方式中，方法可還包括添加包含ILlb，TNFa和IL6的細(xì)胞因子混合物以誘導(dǎo)DC的成熟。在各種實施方式中，可添加細(xì)胞因子混合物持續(xù)約48小時。在各種實施方式中，細(xì)胞因子混合物可還包含選自下列的細(xì)胞因子PGE2，IFNa 2b，聚I:C，IFNy和其組合。在各種實施方式中，方法可還包括添加LPS，IFN Y和/或S-28463以刺激IL12p70自DC產(chǎn)生和/或HLA-DR自DC表達(dá)。在各種實施方式中，SCF的濃度可為約20 100ng/ml，F(xiàn)L的濃度可為約10 50ng/ml, IL3的濃度可為約5 50ng/ml, GM-CSF的濃度可為約50 100ng/ml,且IL4的濃度可為約50 100ng/ml。在各種實施方式中，ILlb的濃度可為約10ng/ml, TNF Y的濃度可為約10ng/ml，且IL6的濃度可為約150ng/ml。在各種實施方式中，PGE2的濃度可為約I μ g/ml，IFN a 2b的濃度可為約3000U/ml，聚I: C的濃度可為約20 μ g/ml，且IFN Y的濃度可為約20ng/ml。在各種實施方式中，DC可為成熟DC且表達(dá)⑶83。在其他實施方式中，DC可為成熟DC,且⑶209，HLA DR和/或CDllc的表達(dá)增加。本發(fā)明的各種實施方式提供樹突細(xì)胞(DC)，其由本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生。本發(fā)明的其他實施方式提供藥學(xué)可接受的組合物，其包含一定量的由本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的DC0本發(fā)明的其他特征和益處將從以下詳述并連同考慮附圖而變得明顯，附圖以示例的方式闡釋本發(fā)明實施方案的多種特征。

在提到的附圖中闡釋示例性的實施方案。預(yù)期本文公開的實施方案和附圖應(yīng)被認(rèn)為是闡釋性而非限制性的。圖I顯示，根據(jù)本發(fā)明的各種實施方式，成血管細(xì)胞是可產(chǎn)生造血(A-C)和血管(D-F)系二者的雙潛能的前體細(xì)胞。 圖2顯示，根據(jù)本發(fā)明的各種實施方式，具有免疫治療潛能的細(xì)胞，諸如樹突細(xì)胞可分化自成血管細(xì)胞。A.樹突細(xì)胞表面標(biāo)記物在分化的第28天表達(dá)。B.條形圖顯示，48小時暴露于成熟細(xì)胞因子可增加DC表面標(biāo)記物表達(dá)。C.直方圖顯不,在30分鐘測定中,DC可獲取及加工DQ-卵白蛋白抗原。D. DC的Wright-Giemsa染色劑，20xo E. DC的Wright-Giemsa染色劑，ΙΟΟχ。圖3顯示，根據(jù)本發(fā)明的各種實施方式，在暴露于淋巴樣-誘導(dǎo)細(xì)胞因子后，源于hESC的成血管細(xì)胞可在無滋養(yǎng)層的培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生⑶561ow/⑶16+自然殺傷細(xì)胞。A.在甲基纖維素培養(yǎng)期間，成血管細(xì)胞的亞組獲取共同的白細(xì)胞抗原，CD45。B.將成血管細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)物(含人血清和細(xì)胞因子的混合物)允許獲取NK細(xì)胞標(biāo)記物，⑶56。C.在總共28 40天分化之后出現(xiàn)⑶561ow/tD16+NK細(xì)胞。圖4顯示，根據(jù)本發(fā)明的各種實施方式，類似于典型51Cr釋放測定，細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)可用于評定NK-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。圖5顯示，根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，在標(biāo)準(zhǔn)4小時共培養(yǎng)之后，源于成血管細(xì)胞的NK效應(yīng)細(xì)胞可在K562紅白血病靶細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。圖6顯不根據(jù)本發(fā)明的一實施方式產(chǎn)生NK細(xì)胞的方法。發(fā)明詳述本文提及的所有參考文獻(xiàn)通過引用全文并入(如同完全列出)。除非另外指明，否則本文使用的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典)第 3 版,J. Wiley & Sons (New York, NY 2001) ；March, Advanced OrganicChemistry Reactions,Mechanisms and Structure (高級有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、機(jī)理和結(jié)構(gòu))第 5版，J. Wiley & Sons (New York,NY 2001);以及 Sambrook 和 Russel,Molecular Cloning:ALaboratory Manual (分子克隆實驗手冊)第 3 版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (Cold Spring Harbor, NY 2001),為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供本申請中使用的許多術(shù)語的一般指導(dǎo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到與本文描述的方法和材料相似或相當(dāng)?shù)脑S多方法和材料可用于實踐本發(fā)明。事實上，本發(fā)明不以任何方式限制于所描述的方法和材料。為了本發(fā)明的目的，下面定義以下術(shù)語。如在本文的說明書和在整個隨后的權(quán)利要求書中所用，"a"，" an"和"the"的含義包括復(fù)數(shù)個參照物，除非情景明顯另外指明。而且，如本文所用，"in"的含義包括"in"和"on"，除非情景明顯另外指明。術(shù)語"胚胎干細(xì)胞"(ES細(xì)胞)用在本文如同其用于本領(lǐng)域。此術(shù)語包括源于人胚泡或桑椹胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，包括已連續(xù)傳代為細(xì)胞系的那些。ES細(xì)胞可源于卵細(xì)胞與精子的受精，以及使用DNA，核轉(zhuǎn)移，孤雌生殖或通過手段產(chǎn)生在HLA區(qū)中具有純合性的ES細(xì)胞。ES細(xì)胞也是源于通過精子和卵細(xì)胞的融合，核轉(zhuǎn)移，孤雌生殖，雄核發(fā)育，或染色質(zhì)的重編程和隨后重編程的染色質(zhì)并合入質(zhì)膜而產(chǎn)生細(xì)胞所產(chǎn)生的合子，卵裂球或胚泡-階段的哺乳動物胚胎的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞，無論它們的來源或產(chǎn)生它們使用的特定方法，可基于以下鑒定(i)分化為全部3個胚層的細(xì)胞的能力，(ii)至少Oct-4和堿性磷酸酶的表達(dá)，及(iii)當(dāng)移植進(jìn)免疫缺陷型動物時產(chǎn)生畸胎瘤的能力。
如本文所用，術(shù)語"多能干細(xì)胞"包括胚胎干細(xì)胞，源于胚胎的干細(xì)胞，及誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，無論衍生多能干細(xì)胞的方法。多能干細(xì)胞被功能性地定義為這樣的干細(xì)胞Ca)當(dāng)移植進(jìn)免疫缺陷型(SCID)小鼠時能誘導(dǎo)畸胎瘤；(b)能分化為全部3個胚層的細(xì)胞類型(例如，可分化為外胚層，中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞類型);及(C)表達(dá)胚胎干細(xì)胞的一種或更多標(biāo)記物(例如，表達(dá)0ct4，堿性磷酸酶，SSEA-3表面抗原，SSEA-4表面抗原，nanog, TRA-l-60, TRA-1-81, S0X2, REXI,等)。例示多能干細(xì)胞可使用，例如本領(lǐng)域知道的方法產(chǎn)生。例示多能干細(xì)胞包括源于胚泡階段胚胎的ICM的胚胎干細(xì)胞，以及源于卵裂階段的一個或更多卵裂球或桑椹胚階段胚胎的胚胎干細(xì)胞(任選地不毀壞胚胎其余部分)。該胚胎干細(xì)胞可產(chǎn)生自由受精或由無性手段產(chǎn)生的胚胎物質(zhì)，所述無性手段包括體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(SCNT)，孤雌生殖和雄核發(fā)育。還例示多能干細(xì)胞包括由通過表達(dá)因子(在本文稱之為重編程因子)的組合重編程體細(xì)胞產(chǎn)生的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。iPS細(xì)胞可使用胚胎，出生后，新生兒，青少年或成年體細(xì)胞產(chǎn)生。在特定實施方式中，可用于將體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的因子包括，例如，0ct4 (有時稱之為0ct3/4)，Sox2，c_Myc和Klf4的組合。在其他實施方式中，可用于將體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的因子包括，例如，0ct4, Sox2, Nanog和Lin28的組合。在其他實施方式中，通過表達(dá)至少2種重編程因子，至少3種重編程因子，或4種重編程因子來重編程體細(xì)胞。誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞可通過表達(dá)體細(xì)胞中重編程因子的組合來產(chǎn)生。在特定實施方式中，在體細(xì)胞中表達(dá)至少2種重編程因子來成功地重編程體細(xì)胞。在其他實施方式中，在體細(xì)胞中表達(dá)至少3種重編程因子來成功地重編程體細(xì)胞。在其他實施方式中，在體細(xì)胞中表達(dá)至少4種重編程因子來成功地重編程體細(xì)胞。誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞可由體細(xì)胞中重編程因子的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生。在特定實施方式中，將至少2種重編程蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)體細(xì)胞來成功地重編程體細(xì)胞。在其他實施方式中，將至少3種重編程蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)體細(xì)胞來成功地重編程體細(xì)胞。在其他實施方式中，將至少4種重編程蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)體細(xì)胞來成功地重編程體細(xì)胞。在其他實施方式中，鑒定額外的重編程因子及單獨(dú)使用或與一種或更多知道的重編程因子組合使用來將體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞。誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞功能性地定義，及包括使用任何各種方法(整合載體，非-整合載體，化學(xué)手段，等)重編程的細(xì)胞。多能干細(xì)胞可來自任何物種。胚胎干細(xì)胞已成功地來源于，例如，小鼠，多種非-人靈長類動物物種，及人和胚胎干-樣細(xì)胞已產(chǎn)生自多種另外的物種。由此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可自任何物種產(chǎn)生源于胚胎干細(xì)胞和胚胎的干細(xì)胞，所述物種包括但不限于，人，非-人靈長類動物，嚙齒動物(小鼠，大鼠)，有蹄動物(牛，綿羊，等)，犬科動物(家養(yǎng)和野生犬科動物)，貓科動物(家養(yǎng)和野生貓科動物諸如獅，虎，獵豹)，兔，倉鼠，沙鼠，松鼠，豚鼠，山羊，象，熊貓(包括大熊貓)，豬，浣熊，馬，斑馬，海洋哺乳動物(海豚，鯨，等)等。在特定實施方式中，物種是瀕危的物種。在特定實施方式中，物種是目前滅絕的物種。類似地，iPS細(xì)胞可來自任何物種。已使用小鼠和人細(xì)胞成功地產(chǎn)生iPS細(xì)胞。已使用胚胎，胚胎，新生兒和成年組織成功地產(chǎn)生iPS細(xì)胞。因此，可容易使用自任何物種的供體細(xì)胞產(chǎn)生iPS細(xì)胞。由此，可自任何物種產(chǎn)生iPS細(xì)胞，所述物種包括但不限于，人，非-人靈長類動物，嚙齒動物(小鼠，大鼠)，有蹄動物(牛，綿羊，等)，犬科動物(家養(yǎng)和野生犬科動物)，貓科動物(家養(yǎng)和野生貓科動物諸如獅，虎，獵豹)，兔，倉鼠，山羊，象，熊貓(包括大熊貓)，豬，浣熊，馬，斑馬，海洋哺乳動物(海豚，鯨，等)等。在特定實施方式中，物種是瀕危的物種。在特定實施方式中，物種是目前滅絕的物種。

誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞可使用，實際上是任何發(fā)育階段的任何體細(xì)胞作為起點產(chǎn)生。例如，細(xì)胞可來自胚胎，胎兒，新生兒，青少年或成年供體。可使用的例示體細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞，諸如由皮膚樣品或活組織檢查獲得的真皮成纖維細(xì)胞，自滑膜組織的滑膜細(xì)胞，包皮細(xì)胞，頰細(xì)胞或肺成纖維細(xì)胞。盡管皮膚和頰提供適當(dāng)?shù)募?xì)胞的容易可利用的和容易可得到的來源，但可使用實際上是任何細(xì)胞。在特定實施方式中，體細(xì)胞不是成纖維細(xì)胞。術(shù)語"成血管細(xì)胞"和"血管-集落形成細(xì)胞"將貫穿本申請互換使用。所述細(xì)胞具有多種結(jié)構(gòu)和功能特征。這些細(xì)胞的特征中尤其是當(dāng)施用于宿主時移入骨髓的能力。這些細(xì)胞可基于多種結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)描述，包括但不限于一種或更多標(biāo)記物的表達(dá)(RNA或蛋白)或表達(dá)(RNA或蛋白)缺乏。血管-集落形成細(xì)胞能分化而產(chǎn)生至少造血細(xì)胞類型或內(nèi)皮細(xì)胞類型。血管-集落形成細(xì)胞是優(yōu)選雙-潛能的，且能分化而產(chǎn)生至少造血細(xì)胞類型和內(nèi)皮細(xì)胞類型。像這樣，本發(fā)明的血管-集落形成細(xì)胞是至少單-潛能的，且優(yōu)選雙-潛能的。然而另外，血管-集落形成細(xì)胞可具有更大程度的發(fā)育潛能，且可，在特定實施方式中，分化而產(chǎn)生其他系的細(xì)胞類型。在特定實施方式中，血管-集落形成細(xì)胞能分化而產(chǎn)生其他中胚層衍生物，諸如心臟細(xì)胞(例如，心肌細(xì)胞)和/或平滑肌細(xì)胞。術(shù)語"非-移入成血管細(xì)胞"或"非-移入血管細(xì)胞"貫穿本申請用來指稱共享血管-集落形成細(xì)胞的一些特征的細(xì)胞群。但是，非-移入血管細(xì)胞是可區(qū)分的，因為它們當(dāng)施用于免疫缺陷型宿主時不移入骨髓。盡管有此差異，非-移入血管細(xì)胞可共享一種或多于一種(2，3，4，5，6，7，8，9，10)血管-集落形成細(xì)胞的功能或結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì)。例如，在特定實施方式中，非-移入血管細(xì)胞松散地彼此附著。在其他實施方式中，非-移入血管細(xì)胞不表達(dá)一種或多于一種(2，3，4)下列蛋白⑶34，KDR，⑶133，⑶31。不受限于理論，非-移入血管細(xì)胞可提供相比血管-集落形成細(xì)胞多少更定型，且仍能產(chǎn)生一系列造血細(xì)胞類型的不同的干細(xì)胞群。發(fā)明人開發(fā)了體外培養(yǎng)系統(tǒng)，以自人ESC產(chǎn)生具有免疫治療潛能的細(xì)胞。此策略不同于現(xiàn)有技術(shù)，因為其涉及源于hESC的成血管細(xì)胞作為中間體細(xì)胞來源的使用。發(fā)明人已能使用無滋養(yǎng)層的培養(yǎng)條件直接將成血管細(xì)胞分化為自然殺傷(NK)和樹突細(xì)胞(DC)。NK細(xì)胞通過淋巴樣系發(fā)生，且是先天性免疫系統(tǒng)的部分，可用于抗-癌治療，由于它們已被發(fā)現(xiàn)檢測及殺特定類型的腫瘤細(xì)胞。DC通常通過骨髓樣系(自單核細(xì)胞)發(fā)生，且是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的部分，可用于通過它們呈遞抗原及刺激幼稚和記憶T細(xì)胞二者的能力來增強(qiáng)抗原-特異性免疫應(yīng)答(例如基于DC的疫苗治療)。各種活化及抑制性信號之間的相互作用控制NK細(xì)胞的3種主要功能，其為細(xì)胞因子釋放，天然的細(xì)胞毒性和抗體-依賴性細(xì)胞毒性。使用自H7和HuES-3hESC系產(chǎn)生的成血管細(xì)胞，發(fā)明人已能產(chǎn)生成熟⑶561ow/-，⑶16+NK細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)，它們的產(chǎn)生不需要使用間質(zhì)滋養(yǎng)層。分化過程涉及初始4天培養(yǎng)，以產(chǎn)生胚狀體，之后是在補(bǔ)充了一組用于產(chǎn)生和擴(kuò)展成血管細(xì)胞群的細(xì)胞因子和生長因子的甲基纖維素中的10 14天培養(yǎng)。在加人血清和細(xì)胞因子混劑的液體培養(yǎng)中另外的14 21天允許NK細(xì)胞的分化，入由流式細(xì)胞術(shù)評定。類似于51Cr釋放測定的非-放射性細(xì)胞毒性測定顯示，源于這些成血管細(xì)胞的NK細(xì)胞包含天然的細(xì)胞毒性功能，由于它們在標(biāo)準(zhǔn)4小時共培養(yǎng)之后能在靶K562成紅細(xì)胞白血 病細(xì)胞中有效誘導(dǎo)凋亡。使用成血管細(xì)胞作為中介細(xì)胞來源可增強(qiáng)hESC體外分化的能力和/或效率，且重要地，允許開發(fā)用于產(chǎn)生具有免疫治療潛能的細(xì)胞的無滋養(yǎng)層的系統(tǒng)。本發(fā)明的實施方式提供產(chǎn)生淋巴樣系細(xì)胞的方法。在各種實施方式中，本發(fā)明提供產(chǎn)生自然殺傷(NK )細(xì)胞的方法。在各種實施方式中，產(chǎn)生NK細(xì)胞的方法包括提供成血管細(xì)胞；在甲基纖維素和IL2，IL3，IL6，IL7，IL15，SCF和FL上平鋪及培養(yǎng)成血管細(xì)胞；收獲細(xì)胞；及在包含人血清，IL7，IL15，SCF和FL的液體培養(yǎng)基中再平鋪/培養(yǎng)收獲的細(xì)胞。在各種實施方式中，液體培養(yǎng)基每周更換。在各種實施方式中，甲基纖維素是H4236甲基纖維素。在其他實施方式中，甲基纖維素是H4536甲基纖維素。在各種實施方式中，細(xì)胞因子的濃度是 IL2 (5 10ng/ml), IL3 (I 10ng/ml), IL6 (I 10ng/ml), IL7(5 20ng/ml), IL15 (5 10ng/ml), SCF (10 50ng/ml)和 FL (10 50ng/ml)。在各種實施方式中，收獲細(xì)胞在6 8天的培養(yǎng)細(xì)胞之后進(jìn)行。在各種實施方式中，在細(xì)胞再平鋪之后將細(xì)胞培養(yǎng)另外的14 21天。在各種實施方式中，液體培養(yǎng)基是αΜΕΜ或DMEM:F12。在另一實施方式中，產(chǎn)生自然殺傷(NK)細(xì)胞的方法包括提供成血管細(xì)胞；在包含IL2，IL3，IL6，IL7，IL15，SCF和人血清的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)成血管細(xì)胞；收獲細(xì)胞；及在包含人血清，IL7，IL15，SCF和FL的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)收獲的細(xì)胞。在各種實施方式中，液體培養(yǎng)基每周更換。類似于上述，在各種實施方式中細(xì)胞因子的濃度是 IL2 (5 10ng/ml), IL3 (I 10ng/ml), IL6 (I 10ng/ml), IL7 (5 20ng/ml), IL15 (5 10ng/ml), SCF (10 50ng/ml)和 FL (10 50ng/ml)。在各種實施方式中，收獲細(xì)胞在6 8天的培養(yǎng)細(xì)胞之后進(jìn)行。在各種實施方式中，在細(xì)胞再平鋪之后將細(xì)胞培養(yǎng)另外的14 21天。在各種實施方式中，液體培養(yǎng)基是αΜΕΜ或DMEM:F12。本發(fā)明的各種實施方式提供由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的自然殺傷細(xì)胞。在各種實施方式中，NK細(xì)胞提供在包含一定量的由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的NK細(xì)胞的藥學(xué)可接受的組合物中。本發(fā)明的其他實施方式提供產(chǎn)生樹突細(xì)胞(DC)的方法。在一實施方式中，所述產(chǎn)生DC的方法包括提供成血管細(xì)胞；在包含人血清，SCF, FL, IL3和GM-CSF的液體培養(yǎng)基中平鋪及培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞；將IL4添加到所述液體培養(yǎng)基；及進(jìn)一步培養(yǎng)所述細(xì)胞。在其他實施方式中，方法還包括添加包含ILlb，TNFa和IL6的細(xì)胞因子混劑以誘導(dǎo)DC的成熟。在進(jìn)一步實施方式中，細(xì)胞因子混劑還包含選自下列的細(xì)胞因子PGE2，IFNa 2b，聚I:C，IFNy和其組合。在其他實施方式中，方法還包括添加LPS，IFNy和/或S-28463以刺激IL12p70自DC產(chǎn)生和/或HLA-DR自DC表達(dá)。在各種實施方式中，液體培養(yǎng)基每6 7天更換。在各種實施方式中液體培養(yǎng)基是aMEM*DMEM:F12。在各種實施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)7 11天。在各種實施方式中，在細(xì)胞培養(yǎng)7 11天之后添加IL4。在各種實施方式中，在添加IL4之后將細(xì)胞培養(yǎng)另外的8 10天。在各種實施方式中，人血清，SCF，F(xiàn)L，IL3和GM-CSF的濃度是人血清(10 20%)，SCF (20 100ng/ml)，F(xiàn)L (10 50ng/ml)，IL3 (5 50ng/ml)和 GM-CSF (50 IOOng/ml)。在另一實施方式中，IL4的濃度是50 100ng/ml。在各種實施方式中，ILlb，TNFa和 IL6 的濃度是ILlb (10ng/ml),TNF a (10ng/ml)和 IL6 (150ng /ml)。在各種實施方式中，PGE2，IFNa 2b，聚 I ;C，及 IFNy 的濃度是PGE2 (I μ g/ml), IFN a 2b (3000U/ml)，聚I:C (20μ g/ml)，及 IFNy (20ng/ml)。由于自成血管細(xì)胞產(chǎn)生樹突細(xì)胞的效率相對良好，用DC的未來工作可涉及優(yōu)化用于各種新功能測定的條件及開發(fā)用于各種新功能測定。例如，改變包含DC成熟混劑的組分可改善IL12p70分泌測定。而發(fā)明人目前使用6種不同的用于成熟的細(xì)胞因子的混劑，可需要LPS和/或IFNy的添加，以便刺激IL12p70自源于胚細(xì)胞的DC產(chǎn)生。類似地，合成化合物，S-28463可輔助增加IL12p70產(chǎn)生和HLA-DR表達(dá)。本發(fā)明的各種實施方式提供由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的樹突細(xì)胞。在各種實施方式中，DC提供在包含一定量的由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的DC的藥學(xué)可接受的組合物中。在本發(fā)明的各種實施方式中，成血管細(xì)胞可由包括下列步驟的方法獲得提供hESC ;在包含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)hESC以產(chǎn)生胚狀體(EB);解聚EB ;過濾個體細(xì)胞；將個體細(xì)胞接種于包含TPO，VEGF, FL和bFGF的甲基纖維素；及自甲基纖維素收獲胚細(xì)胞-樣細(xì)胞。在各種實施方式中，在解聚EB之前，首先將hESC培養(yǎng)4天。在各種實施方式中，用以產(chǎn)生胚狀體的細(xì)胞因子包含VEGF和BMP4。在各種實施方式中，在EB形成的整個過程中使用VEGF和BMP4。在另一實施方式中，用以產(chǎn)生胚狀體的細(xì)胞因子還包含bFGF。在一實施方式中，在頭2天的培養(yǎng)hESC之后添加bFGF。在各種實施方式中，EB的解聚包括用胰蛋白酶解聚EB，然后用含血清的培養(yǎng)基滅活胰蛋白酶。在一實施方式中，胰蛋白酶是O. 05%。在各種實施方式中，過濾個體細(xì)胞包括經(jīng)40 μ M細(xì)胞粗濾器過濾個體細(xì)胞。在各種實施方式中，甲基纖維素是Η4436或Η4536甲基纖維素。在各種實施方式中，細(xì)胞因子的濃度是TPO (50 μ g/ml), VEGF (50 μ g/ml), FL (50 μ g/ml)和 bFGF (20 50 μ g/ml)。在各種實施方式中，在第6天和第10天之間自甲基纖維素收獲胚細(xì)胞-樣細(xì)胞。在特定實施方式中，諸如制備用于在產(chǎn)生NK細(xì)胞中使用的成血管細(xì)胞，甲基纖維素可包含另外的細(xì)胞因子。這些另外的細(xì)胞因子選自IL2，IL7，IL15和其組合。在各種實施方式中，這些細(xì)胞因子的濃度是IL2 (I 10yg/ml)，IL7 (I 20 μ g/ml)和IL15(I 10 μ g/ml)。在各種實施方式中，以50，000 150，000細(xì)胞/ml的濃度平鋪甲基纖維素培養(yǎng)物。在特定實施方式中，在無紅細(xì)胞生成素的甲基纖維素中產(chǎn)生成血管細(xì)胞。在一實施方式中，無紅細(xì)胞生成素的甲基纖維素是H4536甲基纖維素。在替代實施方式中，多能干細(xì)胞(包括iPS細(xì)胞和人iPS細(xì)胞)用于代替hESC。在其他實施方式中，成血管細(xì)胞可為非-移入成血管細(xì)胞。2009年5月6日提交且通過引用整體并入本文的國際申請No. PCT/US09/43050和PCT/US09/43043提供另外的產(chǎn)生成血管細(xì)胞和非-移入成血管細(xì)胞的教導(dǎo)。在各種實施方式中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含藥學(xué)可接受的賦形劑，以及治療有效量的本發(fā)明的自然殺傷細(xì)胞或樹突細(xì)胞。"藥學(xué)可接受的賦形劑"是指通常安全的，非-毒性和期望的在制備藥物組合物中有用的賦形劑，且包括用于獸醫(yī)學(xué)用途以及人藥物用途的可接受的賦形劑。該賦形劑可為固體，液體，半固體，或，在氣霧劑組合物的情況中是氣體。在各種實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可配制為用于經(jīng)任何施用途徑遞送。"施用途徑"可指稱本領(lǐng)域知道的任何施用通路，包括但不限于氣霧劑，鼻，口腔，經(jīng)粘 膜，經(jīng)皮或腸胃外。"腸胃外"指稱通常與注射，包括眶內(nèi)，輸注，動脈內(nèi)，囊內(nèi)，心內(nèi)，真皮內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，肺內(nèi)，脊柱內(nèi)，胸骨內(nèi)，鞘內(nèi)，子宮內(nèi)，靜脈內(nèi)，蛛網(wǎng)膜下，囊下，皮下，經(jīng)粘膜或經(jīng)氣管注射關(guān)聯(lián)的施用途徑。經(jīng)腸胃外途徑，組合物可為用于輸注或注射的溶液或懸浮液，或作為冷凍干燥的粉形式。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物也可含有任何藥學(xué)可接受的載體。本文所用的"藥學(xué)可接受的載體"指稱涉及將目的化合物從身體的一種組織，器官或部分?jǐn)y帶或運(yùn)輸?shù)缴眢w的另一組織，器官或部分的藥學(xué)可接受的材料，組合物或媒質(zhì)。例如，載體可為液體或固體填料，稀釋劑，賦形劑，溶劑或包裹材料，或其組合。載體的各組分必需是"藥學(xué)可接受的"，因為其必需與制劑的其他成分相容。其必需也適合于與其可接觸的任何組織或器官接觸使用，這是指，其必需不攜帶蓋過其治療性益處的毒性，刺激，過敏性應(yīng)答，免疫原性或任何其他并發(fā)癥的風(fēng)險。
實施例提供以下實施例以更好地說明所要求保護(hù)的發(fā)明，并不解釋為限制本發(fā)明的范圍。在提及具體材料的程度，僅是為了說明的目的而不意為限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可開發(fā)等價的手段或反應(yīng)物，而無需創(chuàng)造性活動，也不偏離本發(fā)明的范圍。實施例I:初始分化兩種細(xì)胞類型的初始分化過程是相同的，且涉及hESC在加細(xì)胞因子的StemlineII (Sigma)中的4天培養(yǎng)以便產(chǎn)生胚狀體(EB)。貫穿EB培養(yǎng)使用細(xì)胞因子，VEGF和BMP4，而在頭2天之后添加bFGF。共4天之后，將得到的EB用O. 05%胰蛋白酶解聚，然后將胰蛋白酶用含血清的培養(yǎng)基滅活。將個體細(xì)胞隨后經(jīng)40 μ M細(xì)胞粗濾器過濾，計數(shù)及接種于含有另外的細(xì)胞因子，諸如 TPO (50μ g/ml), VEGF (50μ g/ml), FL (50 μ g/ml)和 bFGF (20 50μ g/ml)的 H4436 或 H4536 甲基纖維素(Stem Cell Technologies)。對于 NK 分化，也可在此階段添加細(xì)胞因子IL2 (I 10μ g/ml)，IL7 (I 20 μ g/ml)和/或IL15 (I 10 μ g/ml)。以50,000 150,000細(xì)胞/ml的濃度平鋪甲基纖維素培養(yǎng)物，用于產(chǎn)生和擴(kuò)展成血管細(xì)胞群。在第6和10天之間從甲基纖維素收獲胚細(xì)胞-樣細(xì)胞，并通過下列過程之一進(jìn)一步分化。實施例2:NK分化胚細(xì)胞可再平鋪于加IL2 (5 10ng/ml), IL3 (I 10ng/ml), IL6 (I IOng/ml), IL7 (5 20ng/ml), IL15 (5 10ng/ml), SCF (10 50ng/ml)和 FL (10 50ng/ml)的H4236甲基纖維素中或含有相同的細(xì)胞因子和10 20%人血清的液體培養(yǎng)中。在6 8天培養(yǎng)之后，收獲細(xì)胞并再平鋪于加10 20%人血清和細(xì)胞因子IL7 (5 20ng/ml)，ILl5 (5 10ng/ml)，SCF (10 50ng/ml)和 FL (10_50ng/ml)的液體培養(yǎng)基(a MEM或DMEM:F12)中經(jīng)歷另外的14 21天。每周更換培養(yǎng)基用于更新細(xì)胞因子混劑。貫穿分化過程間歇性地使用流式細(xì)胞術(shù)，以評定細(xì)胞的免疫表型和NK細(xì)胞表面標(biāo)記物的獲取。細(xì)胞表面標(biāo)記物包括⑶34，⑶45，⑶56，⑶16，⑶94，NKG2D,⑶3，⑶7，⑶4，⑶8a和⑶45RA。用于檢查源于成血管細(xì)胞的NK細(xì)胞的功能的測試包括(I)使用K562紅 白血病靶細(xì)胞的天然的細(xì)胞毒性測定，(2)應(yīng)答IL12/IL18或佛波醇肉豆蘧酸乙酸酯處理的IFNy產(chǎn)生，(3)穿孔素和粒酶B酶存在的細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)，及(4)使用Raji細(xì)胞和抗-CD20抗體的抗體-依賴性細(xì)胞毒性測定。迄今，發(fā)明人已能自H7和HuES3hESC 二者產(chǎn)生NK細(xì)胞。類似于51Cr釋放測定的非-放射性細(xì)胞毒性測定顯示，源于我們的成血管細(xì)胞的NK細(xì)胞包含天然的細(xì)胞毒性功能，由于它們在標(biāo)準(zhǔn)4小時共培養(yǎng)之后能在靶K562成紅細(xì)胞白血病細(xì)胞中有效誘導(dǎo)凋亡。實施例3:DC分化將胚細(xì)胞平鋪于加10 20%人血清和細(xì)胞因子SCF (20 100ng/ml)，F(xiàn)L (10 50ng/ml), IL3 (5 50ng/ml)，及 GM-CSF (50 100ng/ml)的液體培養(yǎng)基(a MEM 或DMEM:F12)中。在7 11天培養(yǎng)之后，也將IL4 (50 100ng/ml)添加到培養(yǎng)物，并允許細(xì)胞生長另外的8 10天。每6 7天進(jìn)行培養(yǎng)基更換。可將另外的細(xì)胞因子混劑(IOng/ml ILlb, 10ng/ml TNF y，150ng/ml IL6)加入培養(yǎng)持續(xù)48小時，以便誘導(dǎo)DC的成熟。貫穿分化過程間歇性地使用流式細(xì)胞術(shù)，以評定細(xì)胞的免疫表型和DC表面標(biāo)記物的獲取。細(xì)胞表面標(biāo)記物包括CDllc，CD209 (DC-SIGN)，HLA ABC (I 類 MHC)，HLA DRCII類MHC)，⑶Ia和⑶14。成熟通過T-細(xì)胞共刺激受體⑶83的獲取來評定，而⑶209，HLA DR和⑶Ilc的表達(dá)也可在成熟后增加。在特定測定中，可將另外的細(xì)胞因子諸如I μ g/ml PGE2，3000U/ml IFNa 2b，20 μ g/ml聚I :C，或IFNy 20ng/ml加入成熟混劑，以增強(qiáng)DC功能應(yīng)答。解決源于成血管細(xì)胞的DC的功能性的測定包括(I)經(jīng)DQ-卵白蛋白(BDBiosciences)處理的抗原攝取，(2)應(yīng)答化學(xué)吸引物MIP-3b的轉(zhuǎn)孔遷移，(3)用于測定DC增加HLA-錯配的T細(xì)胞增殖的能力的同種異體混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)測定，(4) DC刺激后的IL12-p70分泌，及(5)用于測定是否抗原-裝載的DC可在之前抗原-激發(fā)的外周血單核細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN Y產(chǎn)生的抗原呈遞測定。發(fā)明人已能自HuES3和MAOlhESC 二者產(chǎn)生DC。觀察到CD83，HLA-DR，CDllc，及⑶209應(yīng)答48小時成熟細(xì)胞因子混劑的上調(diào)。發(fā)現(xiàn)這些DC能在30分鐘測定中攝取及蛋白水解DQ-卵白蛋白。實施例4:成血管細(xì)胞生長條件的改變使用在H4436甲基纖維素中生長的成血管細(xì)胞進(jìn)行以上NK和DC分化過程。但是，自Stem Cell Technologies的無紅細(xì)胞生成素的甲基纖維素H4536也可用于有效產(chǎn)生成血管細(xì)胞。這些"印0_"成血管細(xì)胞相當(dāng)類似于原"印O+"胚細(xì)胞；它們能分化為各種造血和血管細(xì)胞類型。初步結(jié)果提示，對于成血管細(xì)胞分化為各種造血系，包括NK細(xì)胞和DC，H4536的使用可提供超過H4436甲基纖維素的顯著優(yōu)勢。胚細(xì)胞生長培養(yǎng)基中epo的缺失已發(fā)現(xiàn)減少表達(dá)紅細(xì)胞標(biāo)記物⑶235a的細(xì)胞的百分率，及增加表達(dá)⑶34，⑶45和⑶41a的細(xì)胞的百分率。由于細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)中的此差異，"epo—"生長條件可增強(qiáng)向骨髓樣和/或淋巴樣系的分化。實施例5:自iPS細(xì)胞的MK產(chǎn)生使用0P9共培養(yǎng)系統(tǒng)，發(fā)明人顯示，MK可自iPS細(xì)胞產(chǎn)生。自數(shù)十萬iPS細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)千CD41a+MK。實施例6:自人ESC的NK細(xì)胞分化分化過程如下進(jìn)行
將H7ESC經(jīng)4天分化為胚狀體(EB)。收獲EB及轉(zhuǎn)移到富含細(xì)胞因子的甲基纖維素持續(xù)10 15天，用于成血管細(xì)胞產(chǎn)生和擴(kuò)展。收獲成血管細(xì)胞，并放入加10 20%人AB血清，和一組細(xì)胞因子的無滋養(yǎng)層的液體培養(yǎng)培養(yǎng)基持續(xù)另外的14 17天，每3 4天
更換一半培養(yǎng)基。免疫表型分型(使用流式細(xì)胞術(shù))未成熟的NK 細(xì)胞是 CD56bright，CD161o，KIRlo, CDl 17+，CD94-，NKG2D+。通過使用以上過程的變化形式，在32天的分化之后20 30%的活細(xì)胞是⑶56+⑶16-。成熟NK細(xì)胞是 CD56dim，CD16hi, KIRhi，CDl 171o/-，CD94+，NKG2D+。通過使用以上過程，在 31 天的分化之后20%的活細(xì)胞是⑶56-⑶16+，且5%的活細(xì)胞是⑶561ο⑶16+。功能測定天然的細(xì)胞毒性成熟NK細(xì)胞可引發(fā)靶細(xì)胞諸如人Κ562紅白血病，MCF7，U87，PC3，NTERA2細(xì)胞的凋亡。"3FC"測定用于評定細(xì)胞毒性的效率。其類似于51Cr釋放測定，但不需要放射性。見 Derby et al. , Immunol. Letters 78:35-39 (2001)。在標(biāo)準(zhǔn) 4 小時實驗中發(fā)現(xiàn)，上述成熟NK細(xì)胞的異源群(項目B2-a)引發(fā)65 70%的K562細(xì)胞的凋亡?？贵w-依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC) :NK細(xì)胞表面上的FcyRIII (⑶16)結(jié)合于附接于靶細(xì)胞的抗-⑶20抗體的fc區(qū)，并誘導(dǎo)ADCC。將Raji細(xì)胞(源于Burkett氏淋巴瘤)與抗-⑶20抗體預(yù)溫育，并用作ADCC測定中的祀。(Tsirigotis et al.，J ofSteroid Biochem and Mol Bio 108:267-271(2008))。IFN Y細(xì)胞因子產(chǎn)生未成熟的NK細(xì)胞應(yīng)答用加離子霉素或IL12加IL18的PMA(佛波醇肉豆蘧酸乙酸酯)過夜處理而產(chǎn)生大量的IFNy。用布雷菲德菌素a阻斷IFNy分泌，將細(xì)胞就細(xì)胞表面標(biāo)記物染色，并使用細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)測量IFNy。見Woll etal.J. of Immunol. 175:5095-5103 (2005)。使用異種移植物小鼠模型，NK細(xì)胞的體內(nèi)免疫治療潛能將生物發(fā)光的(含有螢光素酶的)K562細(xì)胞注入N0D/SCID小鼠用于腫瘤移入，之后是NK細(xì)胞的藥團(tuán)和每天IP注射IL2和IL15。生物發(fā)光成像用于經(jīng)時監(jiān)控體內(nèi)NK免疫治療潛能。見WolI et al. Blood113(24):6094-6101 (2009)。實施例7通過使用成血管細(xì)胞作為骨髓-群體恢復(fù)細(xì)胞或通過將它們分化為樹突細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，T細(xì)胞和/或間葉干細(xì)胞(MSC)，我們可產(chǎn)生對抗癌，HIV和/或自身免疫疾病的大規(guī)模，有效的基于細(xì)胞的治療。發(fā)明人能以40 55%效率實現(xiàn)樹突細(xì)胞(DC)自hESC和iPS細(xì)胞的分化。除了 2種新功能測定之外，源于人骨髓的DC的并排比較現(xiàn)在已確認(rèn)，源于hESC的DC與源于人BM的DC共享許多可比較的特征，并也鑒定需要進(jìn)一步優(yōu)化的區(qū)。對于自然殺傷細(xì)胞分化，與源于人骨髓的NK細(xì)胞的并排比較確認(rèn)，體外NK細(xì)胞分化不是非常有效，即便當(dāng)使用骨髓細(xì)胞來源時。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，源于胚細(xì)胞的NK細(xì)胞顯示天然的細(xì)胞毒性能力。進(jìn)行抗體-依賴性細(xì)胞毒性測定。對于T細(xì)胞分化，發(fā)明人已成功地創(chuàng)建了表達(dá)人δ -配體的OP9間質(zhì)細(xì)胞系，以刺激Notch信號傳導(dǎo)，且使用此間質(zhì)細(xì)胞系以刺激成血管細(xì)胞的T細(xì)胞分化。源于成血管細(xì)胞的樹突細(xì)胞(40 55%效率)細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶11c，45，209顯示在源于胚細(xì)胞的DC和源于人骨髓的DC上可比較的表達(dá)，而HLA-DR相比人BM DC，在胚細(xì)胞DC上以低得多的水平表達(dá)。功能測定(之前在抗原攝取和遷移測定報道的)。IL12-P70分泌IL12p70由成熟 DC分泌，以便引發(fā)自CD4+T細(xì)胞的Thl-導(dǎo)向的應(yīng)答。源于人BM的DC可產(chǎn)生>500pg/ml的IL12p70，而源于胚細(xì)胞的DC在成熟后未產(chǎn)生任何可檢測的IL12p70?；旌系牧馨图?xì)胞反應(yīng)(MLR)測定MLR測定測定DC刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力。將臍帶血單核細(xì)胞(CBMC，其包括T細(xì)胞)用作熒光標(biāo)記的應(yīng)答者，并在與源于未成熟的或成熟胚細(xì)胞的DC的4 5天共培養(yǎng)之后測量它們的增殖。初步結(jié)果顯示，應(yīng)答者細(xì)胞應(yīng)答成熟(m)DC而增殖。源于成血管細(xì)胞的自然殺傷細(xì)胞在源于胚細(xì)胞和源于人骨髓的NK細(xì)胞中評價細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶45，⑶7，⑶94，⑶56，⑶16，及NKG2D。NK分化效率研究重組人Sox7蛋白的增加用于NK分化的⑶34+起始祖先庫的能力。結(jié)果提示，rhSox7不顯著影響⑶34+細(xì)胞的％。研究鼠AFT024作為間質(zhì)滋養(yǎng)層，其可提供關(guān)鍵細(xì)胞間接觸及用于NK細(xì)胞分化的分泌的因子。如通過細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)指示，AFT024間質(zhì)共培養(yǎng)未增強(qiáng)人BM或胚細(xì)胞的NK分化。源于成血管細(xì)胞的T細(xì)胞Notch信號傳導(dǎo)對于T細(xì)胞分化是關(guān)鍵的。像這樣，將人S -樣配體I (hDLLl)的cDNA克隆進(jìn)基于MSCV-ires-GFP的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，并使用得到的病毒上清液感染0P9間質(zhì)細(xì)胞。在病毒整合之后，0P9細(xì)胞會在它們的細(xì)胞表面表達(dá)hDLLl，且是gfp陽性。基于FACS的分選用于自感染的0P9細(xì)胞的異源庫純化最高gfp-陽性細(xì)胞。將這些0P9-hDLlS (" S"代表分選的)擴(kuò)展及表征。Q-RT-PCR，免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)全部確認(rèn)這些細(xì)胞中hDLLl蛋白的表達(dá)。實施例8將臍帶血和外周血單核細(xì)胞二者用作應(yīng)答者，且發(fā)明人使用源于人骨髓的DC作為陽性對照效應(yīng)子。已顯示E4BP4對于NK系開發(fā)是關(guān)鍵的(見Gascoyne et al. Nature Immunology10(10) :1118-1125, 2009)，且可提供對于體外更有效必需的轉(zhuǎn)錄程序。NK細(xì)胞分化。發(fā)明人將E4BP4cDNA克隆進(jìn)用于其在成血管細(xì)胞中過表達(dá)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，并評價其增加NK分化的能力。RT-PCR用于監(jiān)控對于細(xì)胞功能性關(guān)鍵的各種KIR受體同種型和酶，穿孔素和粒酶B的表達(dá)。對于功能測定，發(fā)明人顯示，源于胚細(xì)胞的NK細(xì)胞顯示天然的細(xì)胞毒性，因此評定它們的抗體-依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)能力。ADCC測定需要的試劑包括源于伯基特淋巴瘤的Raji細(xì)胞和抗-⑶20抗體。⑶20-標(biāo)記的Raji細(xì)胞與NK細(xì)胞的共培養(yǎng)應(yīng)引發(fā)特定ADCC應(yīng)答，其將通過流式細(xì)胞手段監(jiān)控。NK參考文獻(xiàn)I. Woll, P et al. , J. of Immunology. 175:5095-5103 (2005) ·2. Woll1P et al. , Bloodll3 (24) :6094-101(2009).3. Bordoni et al. , Hepatology 39:1508-1516(2004).4. Tabatoabaei-Zavareh et al. , PLOS One Issue 2, e232(2007).5. McCullar, V et al. , Exp. Hematology 36 (5) : 598-608 (2008).
6. Freud, AG et al. , Immunity 22:295-304 (2005).7. Yu, H et al. , Blood 92(10) :3647-3657(1998).DC參考文獻(xiàn)I. Su et al. , Clinical Cancer Research 14(19):6207-6217(2008).2. Tseng et al. , Regenerative Medicine 4 (4):513-526 (2009).3. Bandi et al. , AIDS Research and Therapy 5:1 (2008).(開放獲取)4. Slukvin, II et al. , J of Immunology 176:2924-2932 (2006).以上在詳述中描述了本發(fā)明的多種實施方案。盡管這些描述直接描述了以上實施方案，但是應(yīng)理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)想對本文顯示和描述的具體實施方案的修改和/或變化。落入本描述的范圍之內(nèi)的任何這樣的修改或變化意指也包括在本文中。除非具體指明，否則發(fā)明人的意圖是，說明書和權(quán)利要求書中的字詞和語句以對于適用領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員而言是普通且習(xí)慣的含義提供。已經(jīng)呈現(xiàn)了申請人在提交本申請時所知的本發(fā)明的多種實施方案的以上描述，且意指用于闡釋和描述的目的。本描述不意為窮盡的，也不意為限制本發(fā)明為公開的確切形式，且鑒于以上教導(dǎo)，許多修改和變化是可能的。描述的實施方案用于解釋本發(fā)明的精神和其實際應(yīng)用，并使得本領(lǐng)域其他技術(shù)人員能夠以多種實施方案和適合預(yù)期的具體用途的多種修改利用本發(fā)明。因此，預(yù)期本發(fā)明不限于為了進(jìn)行本發(fā)明而公開的具體實施方案。盡管已經(jīng)顯示和描述了本發(fā)明的具體實施方案，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，基于本文的教導(dǎo)，可進(jìn)行改變和修改而不偏離本發(fā)明和其更寬泛的方面，且因此所附的權(quán)利要求書是為了在其范圍中涵蓋所有這樣改變和修改，因為它們在本發(fā)明的實際精神和范圍中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，通常本文使用的術(shù)語一般預(yù)期為“開放”術(shù)語(如，術(shù)語“包括”應(yīng)解釋為“包括但不限于”，術(shù)語“具有”應(yīng)解釋為“至少具有”，術(shù)語“包括”應(yīng)解釋為“包括但不限于”、等)。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生自然殺傷(NK)細(xì)胞的方法，包括 提供成血管細(xì)胞； 在甲基纖維素和包含IL2，IL3，IL6，IL7，IL15，SCF和FL的第I細(xì)胞因子混合物上培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞； 收獲培養(yǎng)的細(xì)胞；以及 在包含 人血清,及 包含IL7，IL15，SCF和FL的第2細(xì)胞因子混合物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)收獲的細(xì)胞以產(chǎn)生NK細(xì)胞。
2.權(quán)利要求I的方法，其中甲基纖維素是H4236甲基纖維素。
3.權(quán)利要求I的方法，其中甲基纖維素是H4536甲基纖維素。
4.權(quán)利要求I的方法，其中 IL2的濃度是約5 10ng/ml, IL3的濃度是約I 10ng/ml, IL6的濃度是約I 10ng/ml, IL7的濃度是約5 20ng/ml, IL15的濃度是約5 10ng/ml, SCF的濃度是約10 50ng/ml，且 FL的濃度是約10 50ng/ml。
5.權(quán)利要求I的方法,其中培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞持續(xù)約6 8天。
6.權(quán)利要求I的方法，其中培養(yǎng)收獲的細(xì)胞持續(xù)約14 21天。
7.權(quán)利要求I的方法，還包括每周更換培養(yǎng)基以更新第2細(xì)胞因子混合物。
8.權(quán)利要求I的方法，其中成血管細(xì)胞分化自人胚胎干細(xì)胞(hESC)。
9.權(quán)利要求I的方法，其中成血管細(xì)胞分化自誘導(dǎo)的多能(iPS)細(xì)胞。
10.權(quán)利要求I的方法，其中NK細(xì)胞是未成熟的NK細(xì)胞，且是⑶56+和⑶16-。
11.權(quán)利要求I的方法，其中NK細(xì)胞是成熟NK細(xì)胞，且是⑶56-和⑶16+，或⑶561ο和 CD16+o
12.自然殺傷(NK)細(xì)胞，其由權(quán)利要求I 11之任一項的方法產(chǎn)生。
13.藥學(xué)可接受的組合物，其包含一定量的權(quán)利要求12的NK細(xì)胞。
14.產(chǎn)生自然殺傷(NK)細(xì)胞的方法，包括 提供成血管細(xì)胞； 在包含人血清，及包含IL2，IL3，IL6，IL7，IL15和SCF的第I細(xì)胞因子混合物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞； 收獲培養(yǎng)的細(xì)胞；以及 在包含 人血清,及 包含IL7，IL15，SCF和FL的第2細(xì)胞因子混合物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)收獲的細(xì)胞以產(chǎn)生ΝΚ。
15.權(quán)利要求14的方法，其中IL2的濃度是約5 10ng/ml, IL3的濃度是約I 10ng/ml, IL6的濃度是約I 10ng/ml, IL7的濃度是約5 20ng/ml, IL15的濃度是約5 10ng/ml, SCF的濃度是約10 50ng/ml，且 FL的濃度是約10 50ng/ml。
16.權(quán)利要求14的方法，其中培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞持續(xù)約6 8天。
17.權(quán)利要求14的方法，其中培養(yǎng)收獲的細(xì)胞持續(xù)約14 21天。
18.權(quán)利要求14的方法，還包括每周更換培養(yǎng)基以更新第2細(xì)胞因子混合物。
19.權(quán)利要求14的方法，其中成血管細(xì)胞分化自人胚胎干細(xì)胞(hESC)。
20.權(quán)利要求14的方法，其中成血管細(xì)胞分化自誘導(dǎo)的多能(iPS)細(xì)胞。
21.權(quán)利要求14的方法，其中NK細(xì)胞是未成熟的NK細(xì)胞，且是⑶56+和⑶16_。
22.權(quán)利要求14的方法，其中NK細(xì)胞是成熟NK細(xì)胞，且是⑶56-和⑶16+，或⑶561ο和 CD16+o
23.自然殺傷(NK)細(xì)胞，其由權(quán)利要求14 22之任一項的方法產(chǎn)生。
24.藥學(xué)可接受的組合物，其包含一定量的權(quán)利要求24的NK細(xì)胞。
25.產(chǎn)生樹突細(xì)胞(DC)的方法，包括 提供成血管細(xì)胞； 在包含人血清，SCF, FL, IL3和GM-CSF的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞； 將IL4添加到所述液體培養(yǎng)基；以及 進(jìn)一步培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞以產(chǎn)生DC。
26.權(quán)利要求25的方法，其中培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞持續(xù)約7 11天。
27.權(quán)利要求25的方法，其中在添加IL4之后進(jìn)一步培養(yǎng)所述成血管細(xì)胞持續(xù)約8 10天。
28.權(quán)利要求25的方法，還包括添加包含ILlb，TNFa和IL6的細(xì)胞因子混合物以誘導(dǎo)DC的成熟。
29.權(quán)利要求28的方法，其中添加細(xì)胞因子混合物持續(xù)約48小時。
30.權(quán)利要求28的方法，其中細(xì)胞因子混合物還包含選自下列的細(xì)胞因子PGE2，IFNa 2b，聚 I :C，IFNy 和其組合。
31.權(quán)利要求25的方法，還包括添加LPS,IFN Y和/或S-28463以刺激IL12p70自DC產(chǎn)生和/或HLA-DR自DC表達(dá)。
32.權(quán)利要求25的方法，其中 SCF的濃度是約20 100ng/ml， FL的濃度是約10 50ng/ml, IL3的濃度是約5 50ng/ml, GM-CSF的濃度是約50 100ng/ml，且 IL4的濃度是約50 100ng/ml。
33.權(quán)利要求28的方法，其中ILlb的濃度是約10ng/ml, TNFy的濃度是約10ng/ml，且 IL6的濃度是約150ng/ml。
34.權(quán)利要求30的方法，其中 PGE2的濃度是約I μ g/ml, IFN a 2b的濃度是約3000U/ml， 聚I: C的濃度是約20 μ g/ml，且 IFNy的濃度是約20ng/ml。
35.權(quán)利要求25的方法，其中DC是成熟DC，且表達(dá)⑶83。
36.權(quán)利要求25的方法，其中DC是成熟DC，且⑶209，HLADR和/或⑶IIc的表達(dá)增加。
37.樹突細(xì)胞(DC)，其由權(quán)利要求25 36之任一項的方法產(chǎn)生。
38.藥學(xué)可接受的組合物，其包含一定量的權(quán)利要求37的DC細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供產(chǎn)生自然殺傷(NK)細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DC)的方法。方法利用人成血管細(xì)胞作為中間體細(xì)胞以產(chǎn)生NK細(xì)胞和DC。在各種實施方式中，方法不需要使用間質(zhì)滋養(yǎng)層。
文檔編號C12N5/078GK102822332SQ201080062968
公開日2012年12月12日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日
發(fā)明者E·金步雷爾, S-J·魯 申請人:干細(xì)胞及再生醫(yī)學(xué)國際股份有限公司