專利名稱：褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑抗藥性分子檢測方法
褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑抗藥性分子檢測方法
(一)、方法領(lǐng)域
本發(fā)明基于伽馬氨基丁酸受體突變的褐飛虱抗藥性分子檢測方法，屬于生物方法領(lǐng)域，專用于褐飛虱對作用于昆蟲Y-氨基丁酸受體(Y-GABA rec印tor)殺蟲劑(包括狄氏劑、氟蟲腈和丁烯氟蟲腈)抗性靶標(biāo)變異的高靈敏快速檢測。
(二 )、背景方法
我國是世界上農(nóng)林生物災(zāi)害發(fā)生最嚴(yán)重的國家之一，生物災(zāi)害發(fā)生頻繁，為害嚴(yán)重，損失巨大。目前全國范圍內(nèi)農(nóng)作物有害生物發(fā)生種類高達(dá)1700多種，可造成嚴(yán)重危害的有 100多種，2009年我國農(nóng)作物有害生物發(fā)生面積達(dá)70億畝次。有害生物抗藥性快速增長， 目前至少有30種農(nóng)作物害蟲對40種殺蟲劑、20多種病原菌對各類現(xiàn)代選擇性殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。病蟲抗藥性的暴發(fā)往往導(dǎo)致防治失敗，如果補救防治不及時或不到位，將造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，抗藥性的產(chǎn)生同時導(dǎo)致更多的化學(xué)農(nóng)藥投入田間，對環(huán)境造成嚴(yán)重污染，對有益生物造成毀滅性的殺傷。我國每年因使用農(nóng)藥引起的中毒人數(shù)超過9萬人；發(fā)生作物藥害的面積約300萬畝。由于化學(xué)農(nóng)藥過度和不當(dāng)使用，不僅造成嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境污染(高達(dá)80%的農(nóng)藥漂移或流失到非靶標(biāo)生物、土壤和水域中)，而且成為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的隱患。農(nóng)藥殘留和重金屬污染超標(biāo)是當(dāng)前農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的突出問題，已經(jīng)成為國際市場對我國農(nóng)產(chǎn)品設(shè)置綠色貿(mào)易壁壘的主要依據(jù)。水稻是我國第一大糧食作物，常年播種面積4. 77億畝左右，占糧食播種面積的 30%，總產(chǎn)量約2億噸，產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)的40%左右。水稻主要害蟲，褐飛虱、二化螟等，成為威脅水稻產(chǎn)量的主要因素之一；抗藥性的上升及由此導(dǎo)致的大量化學(xué)農(nóng)藥的使用，同時威脅著水稻品質(zhì)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全。隨著2005-2006年褐飛虱對吡蟲啉高抗性的產(chǎn)生，氟蟲腈隨著大量應(yīng)用；2009年10月1日氟蟲腈被禁止在稻田使用，丁烯氟蟲腈作為替代品種被廣泛使用。室內(nèi)篩選和田間監(jiān)測都發(fā)現(xiàn)，褐飛虱對氟蟲腈和丁烯氟蟲腈都產(chǎn)生了一定水平的抗性，尤其是室內(nèi)篩選品系抗性達(dá)到200倍以上。目前關(guān)于褐飛虱抗藥性的監(jiān)測大都局限于生物測定，除了本實驗室2006年報道了褐飛虱對吡蟲啉的分子檢測方法外，還未見其他快速檢測方法報道。生物測定本身的局限性是的這種常規(guī)的檢測方法不能檢測早期抗性和低頻率抗性等位基因。目前用于監(jiān)測褐飛虱抗藥性的生物測定方法主要有點滴法、浸苗法、浸莖法等。生物測定方法普片存在的缺點有(1)靈敏度低生物測定很難檢測早期抗性或低頻率抗性等位基因，尤其是抗性等位基因是隱性或不完全隱性時；(2)周期長生物測定結(jié)果一般需要M h以上，對特殊作用方式殺蟲劑需要更長的時間，如內(nèi)吸性殺蟲劑、生長調(diào)節(jié)劑、取食阻斷劑等；(3)對試蟲數(shù)量要求大測定一個標(biāo)準(zhǔn)曲線至少需要500頭標(biāo)準(zhǔn)化試蟲，對昆蟲飼養(yǎng)的要求高。在褐飛虱對殺蟲劑抗性日益上升之際，一種快速抗性檢測方法變得十分重要，而普通的生物測定方法根本不能滿足這些要求。(三)、發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有方法中褐飛虱抗藥性檢測方法靈敏度低、周期長、材料要求高、人力要求高等問題，提供褐飛虱對作用于Y-氨基丁酸受體殺蟲劑狄氏劑、氟蟲腈和丁烯氟蟲腈抗性的分子檢測方法，到達(dá)準(zhǔn)確性高、周期短、靈敏度高的目的。
技術(shù)方案
褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑抗藥性分子檢測方法
a、單頭褐飛虱2-3齡若蟲基因組DNA的提取
(1)配制提取液六1%化/11^)505，50 mmol/L Tris 'HCl, 25 mmol/L NaCl, 25 mmol/ L EDTA，溶劑為超純水；提取液B :3 mol/L KAC, PH 7. 2，溶劑為超純水。(2)將試蟲置于1.0 mL離心管中，液氮冰凍后用滅菌牙簽搗碎，然后加入60 μ L 提取液Α，并用另外60 yL A液清洗牙簽；
(3)65°C水浴45 min，每隔15 min混勻一次；
(4)加入120μ L提取液B，混勻后冰浴1 2 h ；
(5)IOOOOXg離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個滅菌離心管中；
(6)加入480μ L預(yù)冷的無水乙醇，混勻，-20°C放置1 濁；
(7)IOOOOXg離心15 min，傾盡上清液，收集沉淀，用70% (mL/mL)乙醇清洗1次；
(8)重復(fù)步驟(7)，37°C晾干或冷凍干燥沉淀，獲得單頭褐飛虱基因組DNA，加入50 μ L雙蒸水溶解沉淀，-20 ！保存?zhèn)溆茫?br> b、PCR反應(yīng)體系25μ L
2.5 μ L 10 X Buffer, 1. 25 U Ex-Taq DNA polymerase, 2. 5 yL 單頭褐飛虱基因組 DNA，終濃度 0. 2 mmol/L 的 dNIPs、1 mmol/L 的 MgCl2,1 μ mol/L 的內(nèi)外引物，加雙蒸水至反應(yīng)總體積為25 μ L ；其中所述的外引物P GGCTGATCGTCATCATATCGTGG ； Q GCAACGACGCGAACACCATGACG ；內(nèi)引物 A TGCGACACCGGCACGAGTGT ；B CGGTGGTGACGCCGAGTGC ；
c、PCR反應(yīng)程序
94 "C 3 min ;20 循環(huán)94°C 30 s，67 — 58°C 30 s，每 2 個循環(huán)降 1°C，72 °C 1 min ； 10 循環(huán)94°C 30 s，58°C 30 s，72 "C 1 min ；72 "C 5 min。、擴增產(chǎn)物的電泳檢測
取10 μ PCR擴增產(chǎn)物，在1% (g/mL)的瓊脂糖凝膠上進行電泳，穩(wěn)流80 mA，1. 5 h后在紫外光下檢測如果存在長度分別約為200 bp (PQ)和150 bp (AQ)大小的兩條帶，說明個體為抗性純合子；如果存在長度分別約為200 bp (PQ)和80 bp (PB)大小的兩條帶， 說明個體為敏感純合子；如果同時存在長度分別約為200 bp (PQ) ,150 bp (PB)和80 bp (AQ)大小的三條帶，說明個體為雜合子。有益效果
本發(fā)明與現(xiàn)有的生物測定方法相比，其優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)為 1、本發(fā)明經(jīng)過多年的篩選與純化，獲得了褐飛虱對氟蟲腈/ 丁烯氟蟲腈/狄氏劑的抗性和敏感品系，并發(fā)現(xiàn)了殺蟲劑作用靶標(biāo)伽馬氨基丁酸受體上抗性相關(guān)突變(Rdl突變， A302S)。A302S突變在很多種昆蟲均有發(fā)現(xiàn)，如德國蜚蠊、果蠅、家蠅等，并發(fā)現(xiàn)該突變時昆蟲對環(huán)戊二烯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的主要機理，并且該突變對氟蟲腈也表現(xiàn)出一定的交互抗性，在不同種類昆蟲中抗性程度不一致(Ffrench-Constant et al.，1993 ； Cole et al.， 1995 ； Scott and Wen, 1997 ； Wen and Scott, 1999 ； Kristensen et al. , 2005)。由于果蠅是模式昆蟲物種，因此該突變均以果蠅的GABA受體RDL蛋白位置來確定，即該突變導(dǎo)致了果蠅302位氨基酸的替換，故命名為A302S(Ffrench-Constant et al.，1993)。該突變發(fā)生在昆蟲伽馬氨基丁酸(GABA)門控的氯離子通道上，由于在果蠅中發(fā)現(xiàn)的A302S突變導(dǎo)致了昆蟲對狄氏劑的抗性，因此將該通道基因命名為RDL (resistance to dieldrin) (Ffrench-Constant et al. , 1993)。殺蟲劑靶標(biāo)突變是昆蟲抗藥性產(chǎn)生高抗性的主要機理之一，如害蟲對有機磷類殺蟲劑抗性相關(guān)的乙酰膽堿酯酶突變、害蟲對新煙堿類殺蟲劑抗性相關(guān)的煙堿型乙酰膽堿受體突變和昆蟲對環(huán)戊二烯類殺蟲劑抗性相關(guān)的RDL突變，這些突變大多為單堿基點突變，因此可以利用檢測單堿基變異的技術(shù)來檢測該點突變是否存在，如本實驗室已經(jīng)建立的褐飛虱對吡蟲啉突變Y151S的Bi-PASA方法，該方法靈敏度高、 準(zhǔn)確性高、周期短、需求材料少(Liu et al. , 2005;專利，ZL200310118523. 8)。在本實驗室篩選的高抗氟蟲腈和丁烯氟蟲腈的褐飛虱品系中，發(fā)現(xiàn)了與果蠅同源的A302S變異，核苷酸序列如下(加粗字體標(biāo)注單核苷酸變異)。標(biāo)注變異的核苷酸序列 GGGCTGATCGTCATCATATCGTGGGTCTCGTTCTGGCTGAACCGGAATGCGACACCGGCACGAGTGG/TCACT
CGGCGTCACCACCGTGTTGACCATGACCACGCTCATGTCATCCACCAACGCCGCTCTGCCCAAGATCAGCTACGTCA AGTCGATTGACGTCTACCTGGGAACCTGTTTCGTCATGGTGTTCGCGTCGTTGCTC (見 kq NO. 1)
2、靈敏度搞低頻率抗性純合子或雜合子的存在和一定的篩選壓力，是高水平抗性產(chǎn)生的關(guān)鍵因子。而生物測定監(jiān)測方法是一種粗放的檢測方法，不能檢測早期抗性或低頻率抗性純合子或雜合子，所以，生物測定方法很難進行抗藥性產(chǎn)生的風(fēng)險預(yù)測。本發(fā)明根據(jù)褐飛虱對幾種(類)殺蟲劑抗性的靶標(biāo)變異，設(shè)計適合于雙向PCR擴增特異等位基因 (Bi-PASA)的特異引物，經(jīng)過PCR擴增和凝膠檢測，可以直接判斷個體的基因型。通過一定數(shù)量個體的檢測，可以初步確定某個種群中抗性純合子、雜合子和敏感純合子的頻率，為抗藥性預(yù)測、抗藥性治理和害蟲綜合治理提供直接的證據(jù)。3、準(zhǔn)確性高生物測定方法要求試蟲標(biāo)準(zhǔn)化，蟲體之間的差異對結(jié)果影響很大，造成結(jié)果的不穩(wěn)定性。操作者的操作誤差也加大了這種不穩(wěn)定性。而本發(fā)明基于PCR擴增的檢測方法，由于PCR方法的日益成熟和智能化發(fā)展迅速，在一定程度上減少了這種不穩(wěn)定性，使得檢測結(jié)果可以作為褐飛虱防治策略制定的理想材料。4、周期短生物測定方法至少需要M h的觀測時間，而本發(fā)明中的PCR擴增和電泳檢測只需要不到5 h的時間，就可以得出理想的結(jié)果。5、材料要求少生物測定方法中測定一條標(biāo)準(zhǔn)曲線至少需要500頭標(biāo)準(zhǔn)試蟲，這些試蟲的飼養(yǎng)需要花費一定的人力、物力。而本發(fā)明對一個種群的檢測只需要100頭作用的使用，而且試蟲對蟲齡、長短翅的要求不高。如果抗性基因頻率別地，如1%作用，也只需要300頭左右的試蟲，這是生物測定方法無論用多少頭試蟲也不能檢測的。6、雙向PCR擴增特異等位基因(Bi-PASA)是建立在PCR (聚合酶鏈反應(yīng))基礎(chǔ)之上的遺傳標(biāo)記技術(shù)，是一種快速、方便和費用低的SNP檢測方法，具有兩對特異引物一對具等位基因特異性的內(nèi)引物(A和B)，一對外引物(P和Q)。A和B各自與一等位基因互補，
5P和Q在距突變堿基距離不等處與模板配對，以便在電泳凝膠上區(qū)分突變位點上游和下游的PASA片段。Bi-PASA方法可用于證實不同蟲種或種群中存在的抗性等位基因，或用來測定等位基因頻率，該技術(shù)操作簡單，具備常規(guī)PCR技術(shù)人員即可完成；檢測周期短，成本低， 只需要進行一輪PCR和一個普通的瓊脂糖電泳，即能判斷檢測昆蟲的抗性變異情況。雙向 PCR擴增特異等位基因是一種快速、有效的基因單堿基突變檢測方法，可以識別個體基因型的差異，進行低頻率點突變抗性等位基因的檢測，準(zhǔn)確性高、周期短、靈敏度搞，滿足了早期抗性和低頻率抗性等位基因檢測的要求。
(四)、說明書附圖


圖1不同品系個體雙向PCR擴增特異等位基因結(jié)果；
1-5泳道為抗性純合子(試蟲來自于抗性品系BPH-FR)，6-10泳道為敏感純合子(試蟲來自于抗性品系BPH-FSR)，11-15泳道為雜合子(試蟲來自于抗感品系雜交F2子代BPH-FR/ S-f2) ；M泳道為分子量marker，從上到下分別為200 bp、150 bp和100 bp的3條帶。圖2不同篩選世代和雜交F2代個體雙向PCR擴增特異等位基因結(jié)果；
1-5泳道的試蟲來自于BPH-SX-13世代，6-10泳道的試蟲來自于BPH-SX-25世代， 11-16泳道的試蟲來自于抗感品系雜交F2子代BPH-FR/S-f2 ；M泳道為分子量marker，從上到下分別為200 bp、150 bp和100 bp的3條帶。
五、具體實施方案
雙向PCR擴增特異等位基因(Bi-PASA)的特異引物有 外引物 P :GGCTGATCGTCATCATATCGTGG (見 kq NO. 2) Q :GCAACGACGCGAACACCATGACG (見 kq NO. 3) 內(nèi)引物 A :TGCGACACCGGCACGAGTGT (見 kq NO. 4) B CGGTGGTGACGCCGAGTGC (見 kq NO. 5) 單頭褐飛虱2-3齡若蟲基因組DNA的提取
(1)取單頭2-3齡褐飛虱100只，在雙蒸水中漂洗3次，用吸水紙吸干；(2)將單頭試蟲置于1.0 mL離心管中，液氮冰凍后用與離心管配套的塑料勻漿棒碾碎，然后加入60 μ L提取液 A (1% SDS, 50 mmol/L Tris 'HCl, 25 mmol/L NaCl, 25 mmol/L EDTA)，并用另外的 60 μ L提取液A清洗塑料勻漿棒；(3)65 °C水浴45 min，每隔15 min混勻一次；(4)加入 120 μ L 提取液 B (3 mol/L KAC, PH 7. 2)，混勻后冰浴 1 h 以上；(5) 10 OOOXg 離心 15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個滅菌離心管中；(6)10 OOOXg離心10 min，加入480 μ L預(yù)冷的無水乙醇，混勻，一 20°C放置1- ;(7) 10 OOOXg離心15 min，傾盡上清液，收集沉淀， 用70% (mL/mL)乙醇清洗1次；(8)重復(fù)步驟(7)，37 °C晾干或冷凍干燥沉淀，獲得單頭褐飛虱基因組DNA，加入50 μ L雙蒸水溶解沉淀，-20 ！保存?zhèn)溆茫?反應(yīng)體系(25 μ L)
2.5 μ L 10 XBuffer, 1. 25 U Ex-Taq DNA polymerase, 2. 5 μ L 單頭褐飛虱基因組 DNA，終濃度0. 2 mmol/L的dNTPs、1 mmol/L的MgCl2,1 μ mol/L的內(nèi)外引物，加雙蒸水至反應(yīng)總體積為25 UL0PCR反應(yīng)程序94 V 3 min ;20 循環(huán)94°C 30 s, 67-58°C 30 s，每 2 個循環(huán)降 1°C，72 V 1 min ； 10 循環(huán)94°C 30 s，58°C 30 s，72 "C 1 min ；72 "C 5 min。PCR產(chǎn)物分析
將10 μ PCR擴增產(chǎn)物上樣于1% (g/mL)的瓊脂糖凝膠(40 mL凝膠中加溴化乙錠EB 2 μL)，緩沖液為lXTAE，80 mA穩(wěn)流電泳1.5 h。凝膠在紫外光下觀察或凝膠成像。5小時內(nèi)即可獲得不同品系個體雙向PCR擴增特異等位基因結(jié)果如圖1 :1-5泳道均具有約為 200 bp (PQ)和150 bp (AQ)大小的兩條帶，個體為抗性純合子，該泳道試蟲是從抗性純合品系BPH-FR中選取的個體，已經(jīng)通過DNA測序驗證存在純合的突變(突變位點附近的核苷酸序列為ACACCG GCACGAGTGTCACTCGGCGTCACCAC 見 kq NO. 6) ；6-10 泳道均具有約為 200 bp (PQ)和80 bp (PB)大小的兩條帶，個體為敏感純合子，該泳道試蟲是從敏感純合品系BPH-FS中選取的個體，已經(jīng)通過DNA測序驗證不存在突變(突變位點附近的核苷酸序列為:ACACCGGCACGAGTGGCACTCGGCGTCACCAC 見 Seq NO. 7) ； 11-15 泳道均具有 200 bp (PQ)、 150 bp (AQ)和80 bp (PB)大小的三條帶，個體為雜合子，該泳道試蟲是從BPH-FR(早)和 BPH-FS( $ )的F2代(BPH-FR/S-f2)中選取的個體，該位點變異的雜合特性已經(jīng)通過測序驗證，突變位點序列存在雜合核苷酸，序列為(已經(jīng)通過DNA測序驗證存在純合的突變(突變位點附近的核苷酸序列為ACACCGGCACGAGTGG/TCACTCGGC
GTCACCAC 見 kq NO. 8))。為了驗證本發(fā)明對A302S突變檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，隨即從抗性篩選過程中不同世代(BPH-SX-13，BPH-SX-25和抗感品系雜交F2子代BPH_FR/S_f2)的個體，利用本發(fā)明的Bi-PASA方法，檢測個體的突變情況，然后通過測序檢測不同試蟲在突變位點附近的核苷酸序列，以驗證Bi-PASA方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見圖2 1-5泳道試蟲來自BPH-SX-13世代， 出現(xiàn)了 4個敏感純合子(具有PQ和PB條帶)和1個雜合子(具有PQ、AQ和PB條帶)；6-10 泳道試蟲來自于BPH-SX-25世代，出現(xiàn)了 1個抗性純合子(具有PQ和AQ條帶)和4個雜合子(具有PQ、AQ和PB條帶)；11-16泳道試蟲來自于BPH_FR/S_f2世代，出現(xiàn)了 1個抗性純合子(具有PQ和AQ條帶)、2個敏感純合子(具有PQ和PB條帶)和3個雜合子(具有PQ、AQ 和PB條帶)。為了驗證條帶檢測的準(zhǔn)確性，所有條帶均進行了 DNA測序驗證，驗證結(jié)果與通過條帶判斷的突變情況抑制，說明了該Bi-PASA方法的準(zhǔn)確性。通過長期實驗室篩選，獲得了高抗氟蟲腈、丁烯氟蟲腈等苯基吡唑類殺蟲劑高抗的褐飛虱品系(BPH-FR)，同時實驗室長期(從1997年開始室內(nèi)飼養(yǎng))飼養(yǎng)了對絕大多數(shù)殺蟲劑敏感的敏感品系，該品系對氟蟲腈、丁烯氟蟲腈等苯基吡唑類殺蟲劑敏感。圖1中，隨機選取敏感品系(BPH-FS)、抗性品系(BPH-FR)和抗感品系雜交F2子代BPH_FR/S_f2試蟲各5頭，經(jīng)過Bi-PASA方法檢測后，為了驗證Bi-PASA方法檢測的準(zhǔn)確性，對每個泳道條帶進行了 DNA純化和核苷酸測序，發(fā)現(xiàn)1-5泳道AQ條帶均具有造成A302S變異的點突變 G/T (該突變導(dǎo)致了 A302S的氨基酸替換，突變位點附近的核苷酸序列為ACACCGGCACGAG TGTCACTCGGCGTCACCAC見kq NO. 9),6-10泳道PB條帶均不具有造成A302S變異的點突變 G/T (突變位點附近的核苷酸序列為 ACACCGGCACGAGTGGCACT CGGCGTCACCAClkq NO. 10)； 在11-15泳道中，AQ條帶均具有造成A302S變異的點突變G/T (該突變導(dǎo)致了 A302S的氨基酸替換，突變位點附近的核苷酸序列為ACACCGGCACGAG TGTCACTCGGCGTCACCAC見Seq NO. 11)，PB條帶均不具有造成A302S變異的點突變G/T (突變位點附近的核苷酸序列為ACACCGGCACGAGT GGCACT CGGCGTCACCAClkq NO. 12)。圖 2 中，從不同篩選世代和雜交 F2 中隨機選取試蟲進行測試，發(fā)現(xiàn)Bi-PASA條帶檢測結(jié)果和測序結(jié)果完全一致，驗證了該方法的準(zhǔn)確性。
權(quán)利要求
1. 一種褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑抗藥性分子檢測方法，其特征在于如下步驟實現(xiàn)a、提取單頭褐飛虱2-3齡若蟲基因組DNA；b、PCR反應(yīng)體系 2.5 μ L 10 XBuffer, 1. 25 U Ex-Taq DNA polymerase, 2. 5 μ L 單頭褐飛虱基因組 DNA，終濃度 0. 2 mmol/L 的 dNIPs、1 mmol/L 的 MgCl2,1 μ mol/L 的內(nèi)引物、外引物，加雙蒸水至反應(yīng)總體積為25 μ L ；其中所述的外引物P :GGCTGATCGTCATCATATCGTGG ； Q GCAACGACGCGAACACCATGACG ；內(nèi)引物 A TGCGACACCGGCACGAGTGT ；B CGGTGGTGACGCCGAGTGC ；c、PCR反應(yīng)程序 94"C 3 min ;20 循環(huán)94°C 30 s，67 — 58°C 30 s，每 2 個循環(huán)降 1°C，72 °C 1 min ； 10 循環(huán)94°C 30 s，58°C 30 s，72 "C 1 min ；72 "C 5 min ；d、擴增產(chǎn)物的電泳檢測取10 μ PCR擴增產(chǎn)物，在l%g/mL的瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外光下檢測存在長度分別約為200 bp和150 bp大小的兩條帶，說明個體為抗性純合子；存在長度分別約為 200 bp和80 bp大小的兩條帶，說明個體為敏感純合子；同時存在長度分別約為200 bp、 150 bp和80 bp大小的三條帶，說明個體為雜合子。
全文摘要
本發(fā)明褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑抗藥性分子檢測方法屬于抗藥性綜合治理和褐飛虱綜合防治范疇。一種褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑抗藥性分子檢測方法，其特征在于如下步驟實現(xiàn)提取單頭褐飛虱2-3齡若蟲基因組DNA；PCR反應(yīng)體系;PCR反應(yīng)程序;擴增產(chǎn)物的電泳檢測該方法穩(wěn)定性高、周期短、靈敏度高，適合褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑抗性的早期檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102154461SQ20111000323
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者丁志平, 劉澤文, 劉淑華, 姚香梅 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)