專利名稱：雞crbp1基因遺傳變異的檢測方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因變異的檢測方法，具體涉及雞CRBPl基因遺傳變異的檢測方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotid印olymorphisms，SNPs)，主要是指由基因組核 苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/ 缺失等。第1代分子標記限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)主要研究對象是由限制性酶切位點 的差異造成的DNA片段長度多態(tài)性；第2代分子標記是數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)， 包括小衛(wèi)星(minisatellite)和微衛(wèi)星(microsatellite)。與前二代分子標記相比，SNPs 具有以下特點(1)數(shù)量多、覆蓋密度大，據(jù)估計平均每IOOObp就會出現(xiàn)一個。目前已檢測 出93 %的人類基因包含SNPs，98 %的SNPs其距離不超過51Λ，因此，可以在幾乎每個基因的 內(nèi)部或附近提供一系列標記；O)由于SNPs —般只有2個等位基因，在檢測時只需要通過 一個簡單的“+/_”方式即可進行基因分型，這使得檢測、分析易于實現(xiàn)自動化；(3)遺傳穩(wěn) 定性強，與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性標記相比，SNPs具有更高的遺傳穩(wěn)定性；(4)多態(tài)性豐 富，SWs包含了目前已知DNA多態(tài)性的80%以上，是最常見的遺傳變異類型。基于單核苷 酸多態(tài)性的上述優(yōu)點，研究SNP有助于解釋不同個體表形性狀的差異，不同群體和個體對 疾病、環(huán)境因子等反應(yīng)的差異。目前對SNP進行檢測的方法較多，而大多數(shù)實驗室采用的是成本相對較低、技術(shù) 易掌握、檢出率較高、快捷、安全和步驟簡單的PCR-SSCP技術(shù)。該方法原理是經(jīng)PCR擴增 的目的片段在變性劑或低離子濃度下經(jīng)高溫處理使之解鏈并確保成為DNA單鏈，然后在一 定濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時， DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關(guān)外，更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構(gòu)象。在 非變性條件下，DNA單鏈可自身折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，這種構(gòu)象由DNA單鏈堿 基決定，其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用(主要為氫鍵)來維持。相同長度的DNA 單鏈其順序不同，甚至單個堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，電泳遷移率也不同，PCR產(chǎn)物變性 后，單鏈產(chǎn)物經(jīng)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，因靶DNA中發(fā)生單堿基置換，或個別堿基插入或 缺失時，因遷移產(chǎn)生變化會出現(xiàn)泳動變位，從而可將變異DNA與正常DNA區(qū)分開。相同長度 的單鏈DNA因其順序不同或單個堿基差異，所形成的構(gòu)象就會不同，其在凝膠中泳動速度 不一樣，從而顯示出帶型的差異，即多態(tài)型。SNP有非同義cSNP、同義cSNP、內(nèi)含子區(qū)SNP、調(diào)控區(qū)的rSNP幾類，均能從不同角 度影響基因功能，其中非同義cSNP由于改變基因編碼的氨基酸，從而影響基因功能；同義 cSNP可通過改變mRNA的二級結(jié)構(gòu)、翻譯速度等影響基因功能的發(fā)揮；內(nèi)含子區(qū)SNP可通過 改變剪接位點的活性來影響基因功能；調(diào)控區(qū)的rSNP則可通過影響啟動子元件來調(diào)節(jié)基 因的功能。CRBPl是一類與維生素A (VA)代謝有關(guān)的疏水性小分子，擔(dān)任著轉(zhuǎn)運視黃醇(VA)的任務(wù)，從而參與體內(nèi)許多生物學(xué)過程，如視覺、繁殖、上皮細胞的維持、骨的生長發(fā)育等。 Su等Q004)以79個人組織和61鼠組織為研究材料，采用微陣列技術(shù)制作了 CRBPl基因 的表達模式圖，其結(jié)果顯示，該基因在機體表達水平表現(xiàn)出組織差異性，在下丘腦、子宮、卵 巢、睪丸幾個繁殖軸組織中均有表達，以卵巢表達量最高。RICHARD等(1996)分別采用免疫 組織化學(xué)、甲硫氨酸標記親和層析兩種方法僅從小鼠子宮的間質(zhì)細胞中分離CRBP1。因此研 究CRBPl基因遺傳變異和分子遺傳特征對動物生長發(fā)育、繁殖具有重要理論意義和實踐意 義。迄今為止，國內(nèi)外均未見雞CRBPl基因遺傳變異的研究，由于中國地方雞種CRBPl 基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與產(chǎn)蛋性狀(如產(chǎn)蛋 量、開產(chǎn)體重、開產(chǎn)蛋重等)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，采用PCR-SSCP技術(shù)檢測雞CRBPl基因的單核苷酸多態(tài)性，并 將其與生產(chǎn)性狀進行關(guān)聯(lián)分析，以篩選出SNP位點以輔之于育種，加快畜禽育種進程。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案一種雞CRBPl基因遺傳變異的檢測方法，其特征在于包括提取雞血樣 基因組DNA ；對基因組DNA進行PCR擴增，在PCR擴增時使用的上游引物序列為 TAAATTTATAGTTGCGGTCAT,下游引物序列為AGTTCCAGGTGACGGGTGAG ；將擴增產(chǎn)物進行凝膠 電泳并拍照，分析電泳結(jié)果。本發(fā)明的一個實施方式中，其中PCR擴增步驟包括30-40個循環(huán)的變性、退火、延
伸步驟。本發(fā)明的一個實施方式中，其中PCR擴增為對包括雞CRBPl基因第14604位點的 基因進行擴增。本發(fā)明的一個實施方式中，PCR擴增片段長度為320bp。本發(fā)明的一個實施方式中，還包括對基因片段進行測序。本發(fā)明還涉及一種或一對PCR擴增引物，其序列為TAAATTTATAGTTGCGGTCAT或 AGTTCCAGGTGACGGGTGAG。本發(fā)明還涉及雞CRBPl基因第14604位點G/T多態(tài)性在畜禽育種中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及將所述的檢測方法在雞育種中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及所述的PCR擴增引物在雞CRBPl基因第14604位點G/T多態(tài)性檢測 中的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)CRBPl基因的序列設(shè)計引物，分別以2個雞品種/系的基因組DNA為 模板，進行PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物進行測序，測序后得到的雞的CRBPl基因的部分序列與 NCBI公布的原雞的序列進行比較發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)第14604位存在SNP多態(tài)性。針對上述第14604位的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其篩查和檢測方法，通過設(shè)計 特定的引物PCR擴增包含SNP位點的基因片段，然后進行高溫變性再進行聚丙烯酰胺凝膠 電泳鑒定，能夠簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對2個雞品種/系的SNP基因型進行了檢測和基因頻率分析，對上述SNP 位點與雞產(chǎn)蛋性狀(開產(chǎn)體重、300日齡產(chǎn)蛋量、開產(chǎn)蛋重、平均產(chǎn)蛋間隔)進行關(guān)聯(lián)分析，CN 102134606 A
說明書
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該SNP位點的TT基因型可以做為一個提高雞300日齡產(chǎn)蛋量的候選分子遺傳標記。


圖IPCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果；圖2PCR擴增產(chǎn)物的測序驗證；
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。(1)特定引物的設(shè)計針對雞CRBPl基因第14604位點發(fā)生密碼子突變而可 能引起剪接位點的活性進而影響基因功能的單核苷酸多態(tài)性，以NCBI公布的原雞序列 (NC_006096. 2REGI0N :6984276. · 7001797)為參考，利用 Primer5. 0 設(shè)計能夠擴增包括 14604位點的PCR引物，其引物序列M對為上游引物TAAATTTATAGTTGCGGTCAT (14480 14500)，下游引物AGTTCCAGGTGACGGGTGAG(14780 14799)。擴增片段長度為 320bp。對 不同品系和個體的血樣混合成DNA池后以該對引物進行擴增，得到與目的片段大小一致的 片段，經(jīng)雙向測序鑒定后，與NCBI公布的序列進行比較發(fā)現(xiàn)在14604位存在G/T多態(tài)性。(2)雞樣本的采集以2個雞品種/系作為檢測對象，具體采集樣本見下表。
品種樣品數(shù)樣品名稱樣品來源釆樣方 式二郎山山地 雞02品系(SD02)188血樣四川農(nóng)業(yè) 大學(xué)科研 雞場翅下靜 脈采血二郎山山地 雞03品系(SD03)161(3)雞血樣基因組DNA的提?、倮鋬鲅涸谑覝厝诨院螅?0 μ L移至離心管中，加入500 μ LSTE緩沖液， IOyL SDS，加入IOyL蛋白酶Κ(濃度為10 μ g/uL)，混合，上下充分搖動，37°C搖床水浴2 小時，然后55°C水浴過夜。②將溶液冷卻至室溫，加入等體積苯酚，輕搖離心管20分鐘，直至兩相混合形成 乳濁液，4°C，12000r/min離心10分鐘。③取上清，再加入等體積苯酚，輕搖離心管10分鐘，4°C，12000r/min離心10分鐘。④取上清，加入等體積酚氯仿異戊醇混合液04 23 1)，緩慢顛倒離心管 10 分鐘，4°C，12000r/min 離心 10 分鐘。⑤取上清，加入等體積氯仿，緩慢顛倒離心管10分鐘，4°C，12000r/min離心10分鐘。⑥取上清，加入2倍體積的預(yù)冷-20°C冰乙醇沉淀DNA，緩慢的轉(zhuǎn)動離心管，可見白 色DNA沉淀。
⑦4°C，12000r/min離心10分鐘，去上清，然后加4°C預(yù)冷的70%乙醇快速沖洗兩 次，12000r/min離心10分鐘，去上清。⑧將DNA置于室溫下自然風(fēng)干干燥(注意不能太干燥)，根據(jù)沉淀的量加入 適量(100-200 μ L) TE (pH8.0)緩沖液溶解，置4°C冰箱溶解過夜；溶解后的DNA可貯于 4°C、-20°C、-70°C 中備用。注意在抽吸上清液時，盡量小心勿將中間的蛋白質(zhì)層抽出。(4) PCR 擴增PCR 反應(yīng)體系 QXTaq PCR MasterMix 5 μ L、ddH20 3.4yL、引物(10pmol/yL) 各0· 4μ L、模板DNA(50ng/mL)0. 8μ L，共 ομ L)采用的是混合法，即先把引物、酶、ddH20 比擴增量多一點的份數(shù)混勻后分裝，最后加入模板短暫離心后進行PCR擴增，擴增程序為 94°C預(yù)變性 5min — (94°C變性 30s — 50. 7°C退火 30s — 72°C 30s) X35cycle — 72°C延伸 IOmin.(5)電泳及基因型判定將擴增產(chǎn)物99°C變性5min后于10%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，電泳完畢后 進行硝酸銀染色拍照。根據(jù)電泳結(jié)果直接判定個體基因型，兩條帶的為雜合子，上面一條帶 為GG純合型，下面一條帶的為TT純合子，具體見附圖1。(6)不同基因型個體PCR產(chǎn)物的測序驗證對不同基因型個體各5個50 μ 1大體系擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測有目的條帶后直 接送華大公司純化測序，結(jié)果見附圖2，雙峰為雜合型個體。(7)雞CRBPl基因SNP位點的基因和基因型頻率統(tǒng)計分析①基因型頻率指一個群體中某一性狀的各種基因型之間的比率。由于PCR-SSCP 方法的檢測結(jié)果為共顯性等位基因，因此，表型頻率即為基因型頻率?；蛐皖l率=基因型個數(shù)/檢測群體總數(shù)②等位基因頻率記為Pi，表示在一個群體中某一等位基因的數(shù)量與占據(jù)同一基 因座位的全部等位基因總數(shù)的比例，取值0-1之間。Pi = [2(ii) + (ijl) + (ij2)+……(ijn)]/2NPi 第i個等位基因的頻率i 純合復(fù)等位基因jl、j2、……jn:與i共顯的第1到第η個等位基因雞CRBPl基因第14604位SNP基因頻率分布表
權(quán)利要求
1.一種雞CRBPl基因遺傳變異的檢測方法，其特征在于包括提取雞血樣基因組DNA ；對 基因組DNA進行PCR擴增，在PCR擴增時使用的上游弓丨物序列為TAAATTTATAGTTGCGGTCAT， 下游引物序列為AGTTCCAGGTGACGGGTGAG ；將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳并拍照，分析電泳結(jié)果；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中PCR擴增步驟包括30 40個循環(huán)的變性、退 火、延伸步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中PCR擴增為對包括雞CRBPl基因第14604位 點的基因片段進行擴增。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于PCR擴增片段長度為320bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于還包括對擴增的基因片段進行測序。
6.—種或一對PCR擴增引物，其序列為TAAATTTATAGTTGCGGTCAT和/或 AGTTCCAGGTGACGGGTGAG。
7.雞CRBPl基因第14604位點G/T多態(tài)性在畜禽育種中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-5任意一項所述的檢測方法在雞育種中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用，其特征是篩選產(chǎn)蛋率高的雞。
10.權(quán)利要求6所述的PCR擴增引物在雞CRBPl基因第14604位點G/T多態(tài)性檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了雞CRBP1基因遺傳變異的檢測方法，包括提取雞血樣基因組DNA；對基因組DNA進行PCR擴增，在PCR擴增時使用的上游引物序列為TAAATTTATAGTTGCGGTCAT，下游引物序列為AGTTCCAGGTGACGGGTGAG；將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳并拍照，分析電泳結(jié)果。其中雞基因組第14604位點G/T多態(tài)性與產(chǎn)蛋性狀(如產(chǎn)蛋量、開產(chǎn)體重、開產(chǎn)蛋重等)相關(guān)，選出的單核苷酸多態(tài)性位點以輔之于育種，可以加快畜禽育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK102134606SQ20111000332
公開日2011年7月27日 申請日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者劉益平, 朱慶, 肖禮華, 趙小玲 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)