專利名稱：一種抗心肌肥大藥物篩選模型及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物篩選模型，具體地說，涉及一種基于新基因MR-I的抗心肌肥大藥物篩選模型及其構(gòu)建和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心血管系統(tǒng)疾病是當今世界的頭號殺手之一，每年心血管系統(tǒng)疾病死亡率達到 1670萬人。心肌肥厚是高血壓、瓣膜病等臨床常見心血管疾病的重要靶器官損害表現(xiàn)之一， 是心血管疾病的獨立危險因素，且呈現(xiàn)多樣性、復(fù)雜性和易致猝死性。某些成人可不出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但其壽命會明顯縮短，因此人們對無癥狀及輕癥病人亦日益重視，導(dǎo)致心肌肥厚成為基礎(chǔ)和臨床研究的重點領(lǐng)域。心肌肥厚的產(chǎn)生除與血流動力異常有關(guān)外，還與各種神經(jīng)、體液因子，尤其是血管緊張素II(Ang II)、內(nèi)皮素、兒茶酚胺等有關(guān)。Ang II是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中最為重要的活性成分，可以在不增加血管阻力和心臟后負荷的情況下直接導(dǎo)致心肌肥厚。AngII的生物學(xué)作用是由位于組織細胞上的特異性受體介導(dǎo)的。根據(jù)不同的藥理學(xué)特性，Ang II受體可分為兩種亞型=ATl受體(ATl-R)和AT2受體(AT2-R)，這兩種亞型都是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員。Ang II可通過ATl-R作用于G蛋白，促使與之結(jié)合的GTP(三磷酸鳥苷)釋放， 激活PLC (磷脂酶C)，產(chǎn)生第二信使DAG ( 二?；视?和IP3 (三磷酸肌醇)，其中IP3引起細胞內(nèi)儲存鈣離子的釋放，進而提高胞內(nèi)鈣離子水平，DAG可激活H(C(蛋白激酶C)，進而激活MAPK (絲裂原活化蛋白激酶)。ATl-R還可以活化二氫吡啶敏感的電壓依賴性鈣離子通道和激活受體酪氨酸激酶信號通路。相關(guān)資料表明，Ang II能刺激心肌細胞蛋白合成增加和纖維細胞增生，誘導(dǎo)心肌細胞β-MHC基因表達，引起心肌肥大。用ATl-R拮抗劑Losartan 可阻斷上述作用，表明該效應(yīng)是由ATl-R介導(dǎo)完成[Paradis P，Dali-Youcef N, Paradis Fff et al, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica，2000，97 (2)，931-936]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，Ang II通過ATl-R導(dǎo)致多種即刻早期反應(yīng)基因(c-fos，c-jun，c-myc)和晚期心肌肥厚相關(guān)基因(actin-a，ANP)表達，最終導(dǎo)致心肌月巴厚[Li jnen P,Petrov V, Journal of molecular andcellular cardiology, 1999, 21(5)，949-970]。MR-I (Myofibrillogenesis regulator-1)是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所王以光課題組首次從人類骨骼肌cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的與心肌肥大相關(guān)新基因。生物信息學(xué)分析表明，MR-I基因在人、大鼠、小鼠、牛和豬等高等哺乳動物中相當保守。該基因編碼 142個氨基酸。Northern blot和SAGE表達譜分析表明，在人正常組織中，MR-I基因在骨骼肌、心臟、肝臟、腎、肺、結(jié)腸、胰腺中均有表達，尤其在骨骼肌及心肌中表達較高，而在乳腺、皮膚、血液中表達很低。其中，在21-M歲人骨骼肌中，MR-I的轉(zhuǎn)錄水平比66-77歲人高約50倍。此外，MR-I還與肌球蛋白輕鏈調(diào)節(jié)蛋白(myosin regulatory light chain)、肌動蛋白素(myomesin), β -烯醇化酶(β-enolase)等蛋白有相互作用[Li TBet al, Acta biochimica et biophysica Sinica,2004,36 (6),412—418]。
體外研究發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞經(jīng)AngII誘導(dǎo)肥大反應(yīng)后，MR-I蛋白表達上調(diào)；用ATl-R拮抗劑Losartan預(yù)處理則抑制肥大反應(yīng)的發(fā)生，MR-I蛋白表達也未見上調(diào)，沉默MR-I基因則阻止AngII誘導(dǎo)心肌細胞肥大反應(yīng)的發(fā)生[Liu X et al,American journal of physiology. Hear and circulatoryphysiology,2006,290(1), H279-285]。 此夕卜，在MR-I轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)，MR-I過表達能加劇AngII誘導(dǎo)心肌肥厚，提示MR-I可能在AngII誘導(dǎo)的心肌肥大中起重要作用[Li HL et al，Hypertension，2007，49 (6)， 1399-1408]。所以，下調(diào)MR-I蛋白水平有望成為預(yù)防與治療心肌肥大的的一種研究策略。 本發(fā)明提供的以新基因MR-I為靶點的抗心肌肥大藥物篩選模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，迄今為止，尚未見有國內(nèi)外的相關(guān)報道。本發(fā)明的目的是，提供一種以新基因MR-I為靶點的抗心肌肥大藥物篩選模型及其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在建立一種從基因轉(zhuǎn)錄水平抑制由Ang II誘導(dǎo)MR-I表達的模型，所述模型采用可傳代培養(yǎng)的分裂型心肌細胞，構(gòu)建含MR-I基因啟動子-熒光素酶報告基因并穩(wěn)定表達的心肌細胞株。根據(jù)熒光素酶的表達，篩選MR-I啟動子抑制劑，為高通量化合物庫篩選奠定基礎(chǔ)，以期發(fā)現(xiàn)能有效下調(diào)MR-I基因表達的化合物，尋找預(yù)防/治療心肌肥大疾病藥物或其先導(dǎo)化合物。本發(fā)明的主要技術(shù)方案包括以下方面1、在可分裂的心肌細胞如H9c2中，檢測Ang II誘導(dǎo)MR-I蛋白表達的上調(diào)，結(jié)果表明，1 μ M的Ang II能較顯著地提高MR-I在H9c2細胞中的表達；2、擴增MR-I基因啟動子不同區(qū)域，克隆于含報告基因的表達質(zhì)粒載體，如含熒光素酶報告基因的表達質(zhì)粒載體PGL4. 17，獲得四種重組質(zhì)粒pGL4. 17-MR-1/2. 5k、 pGL4. 17-MR-l/l. 5k、pGL4. 17-MR-1/0. 8k、pGL4. 17-MR-1/0. 4k ；3、重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染H9c2細胞后，通過熒光素酶表達活性及對Ang II反應(yīng)性檢測，確定最適MR-I啟動子反應(yīng)區(qū)域位于pGL4. 17-MR-1/0. 8k重組質(zhì)粒內(nèi)；4、在G418(氨基糖苷類抗生素)篩選壓力下，構(gòu)建含pGL4. 17-MR-l/0Jk重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細胞株；5、所構(gòu)建的穩(wěn)定細胞株在篩選抑制Ang II誘導(dǎo)MR-I基因表達化合物中的應(yīng)用。發(fā)明優(yōu)點本發(fā)明以新基因MR-I為靶點，建立了一種抑制心肌肥大的高通量化合物篩選模型，該模型有利于研發(fā)新的預(yù)防和治療心肌肥大疾病藥物或其先導(dǎo)化合物。


圖IAng II誘導(dǎo)H9c2細胞MR-1蛋白表達上調(diào)其中1.MR1，2.肌動蛋白(對照)；A.不加Ang II (對照)，B. Ang II 0. 1 μ M, C. Ang II ΙμΜ圖2MR-1啟動子不同區(qū)域PCR產(chǎn)物電泳檢測圖其ψ :1.-2392-+144(2536bp) ；2.-1375-+144(1519bp) ；3.-709-+144(853bp)； 4. -284-+144 (428bp) ；5. DNA Marker Trans5k(北京全式金生物技術(shù)有限公司)
圖3陽性克隆質(zhì)粒Kpnl/Bglll雙酶切鑒定電泳圖其中1.pGL4. 17-MR-1/2. 5k2. pGL4. 17-MR-l/l. 5k3. pGL4. 17-MR-1/0. 8k4. pGL4. 17-MR-1/0. 4k5. DNA Marker Trans5k圖4MR-1基因啟動子不同區(qū)域克隆于pGL4. 17載體熒光素酶報告基因上游得到的四種重組質(zhì)粒圖譜圖5四種重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染H9c2細胞后熒光素酶的表達及Ang II處理對其熒光素酶表達的影響其中EI·空載體對照，Ang II 1 μ M處理縱坐標相對熒光量；橫坐標1.載體對照，2. pGL4. 17-MR-1/2. 5k， 3. pGL4. 17-MR-l/l. 5k, 4. pGL4. 17-MR-1/0. 8k, 5. pGL4. 17-MR-1/0. 4k ；*P<0. 05,***P<0. 001(與空載體對照相比)，#P < 0. 05(同一表達質(zhì)粒Ang II處理與不加藥相比)。圖6陽性藥物對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染H9c2-MR-l/0. 8k細胞株熒光素酶表達活性的影響。其中1.+Ang II 1 μ M處理或-不加Ang II ；2. +陽性藥物或-不加陽性藥物；縱坐標相對熒光量，橫坐標A. H9c2細胞含空載體對照，B. H9c2細胞含pGL4. 17-MR-1/0. 8k 表達質(zhì)粒。*〃？<0.001(與空載體對照相比)，flP < 0.05(同一表達質(zhì)粒Ang II處理與不加藥相比)。
具體實施例方式以下實施例是為進一步說明本發(fā)明提供的基于新基因MR-I的抗心肌肥大藥物篩選模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，但不以任何方式限制本發(fā)明?！秾嵤├弧稟ngII處理H9c2細胞對MR-I蛋白表達的影響MR-I蛋白在人心肌細胞中具有較高表達水平，而人源心肌細胞不易獲取，大鼠與人基因同源性很高，因而本發(fā)明選用但不限于大鼠可傳代心肌細胞H9c2(購自美國ATCC， 編號CRL-1446)，該細胞來源于BDlX胚胎大鼠的心肌組織，是永生化細胞，可無限傳代，從而克服了原代培養(yǎng)的心肌細胞傳代次數(shù)有限的局限性。H9c2用含有10%胎牛血清(美國 Invitrogen公司)的DMEM-高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)在飽和濕度、37°C、5% CO2 通用培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，每2 3天即用胰酶(0. 25%，美國^witrogen公司)消化傳代一次。取處于對數(shù)生長期的H9c2細胞接種于ΦΙΟΟπιπι培養(yǎng)皿中，待其貼壁生長24h后，分別用0. 1 μ M、1 μ M的AngII誘導(dǎo)處理Mh，收集細胞并提取細胞總蛋白，用Brandford法測定蛋白濃度。取20μ g蛋白上樣，經(jīng)15% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，以hMR_l_T蛋白多克隆抗體[李天伯等，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2005年2月，第27卷第1期，42-47頁]1 1000 倍稀釋作為一抗進行Astern blot檢測MR-I蛋白的表達水平。結(jié)果表明，ΙμΜ的Ang II 能較為顯著地提高MR-I在H9c2細胞中的表達(圖1)?！秾嵤├稭R-I啟動子-熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定1. MR-I啟動子-熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建
人源MR-I基因在GenBank中對應(yīng)編號為AF417001，通過NCBI的BLAST程序獲得了大鼠MR-I基因啟動子區(qū)的部分序列，并選擇轉(zhuǎn)錄起始位點(Transcriptional Starting Site,TSS)上/下游一系列片段，作為參考序列設(shè)計、合成4對引物，并在正向引物5’端加入Kpn I酶切位點，反向引物5’端加入Bgl II酶切位點(表1)。禾U用設(shè)計的引物，以大鼠H9c2心肌細胞中提取的基因組DNA為模板，擴增大鼠MR-I基因啟動子區(qū)各片段，并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物的大小(圖2)，回收大小正確的目的產(chǎn)物。MR-I啟動子擴增產(chǎn)物與含報告基因的表達載體，選用合適的酶切位點，酶切連接。本發(fā)明采用含熒光素酶報告基因的PGL4. 17質(zhì)粒(由本所司書毅研究員饋贈)，但不限于該質(zhì)粒載體。本發(fā)明將 MR-I啟動子擴增產(chǎn)物和pGL4. 17質(zhì)粒分別進行Kpn I、Bgl II雙酶切并回收酶切片段，按照1 3摩爾比進行連接和轉(zhuǎn)化，挑選克隆，分別通過菌落PCR和陽性克隆質(zhì)粒以Kpn I、 Bgl II雙酶切方法進行鑒定(圖3)。經(jīng)測序(委托中美泰和生物技術(shù)有限公司完成)分析證明，所插入的四個片段準確性為100%，最終獲得四種重組質(zhì)粒pGL4. 17-MR-1/2. 5k、 pGL4. 17-MR-l/l. 5k、pGL4. 17—MR-1/0. 8k、pGL4. 17—MR-1/0. 4k (圖 4)。表一擴增大鼠MR-I基因啟動子區(qū)各片段的引物序列
名稱正丨M引物反句引物MR-1 /2.5K (-2392-+144)cggggtaccCTGCAAAGAGAAGTAGGCAGgaagatctTGTTCGGGTCCCACCCCCCTTMR-1 /1.5K (-1375-+144)cggggtaccATTGGTAATGCTTCTTTTCGgaagatctTGTTCGGGTCCCACCCCCCTTMR-1/0.8K(-709-+144)cggggtaccTAGGTCTGAAGACCCGGTGTgaagatctTGTTCGGGTCCCACCCCCCTTMR-1/0.4K(-284-+144)cggggtaccACTTCTCTGGGCCCAAACGCgaagatctTGTTCGGGTCCCACCCCCCTT注ggtaCC為Kpn I識別的酶切序列，agatct為Bgl II識別的酶切序列2.四種表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染H9c2細胞后，熒光素酶表達活性及對Ang II反應(yīng)性檢測pGL4. 17質(zhì)粒對照和構(gòu)建的四種表達質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染H9c2細胞，轉(zhuǎn)染在96孔板進行，按照10 μ 1/孔無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋IOOng DNA, 10 μ 1/孔無血清DMEM培養(yǎng)基 ## 0. 3μ 1 TurboFectin Transfection Reagent ( OriGene ^w] ), ^iUMW 5min 后與稀釋的DNA合并混勻，室溫孵育20min。取處于對數(shù)生長期的H9c2細胞用胰酶消化后，加入含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基適量，輕輕吹打制成單細胞懸液，并調(diào)整細胞濃度為 IO5個/ml。在合并后的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物溶液中按照每孔100 μ 1加入單細胞懸液，吹吸均勻，使細胞與DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物充分混勻。將混合后的細胞-DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物溶液加到96孔板中，每孔120 μ 1。將96孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37°C培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染他后換液，一組不加藥，另一組加ΙμΜ Ang II，繼續(xù)培養(yǎng)Mh，檢測熒光素酶的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):pGL4. 17-MR-1/2. 5k、pGL4. 17-MR-l/l. 5k、pGL4. 17-MR-1/0. 8k、pGL4. 17-MR-1/0. 4k 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比PGL4. 17質(zhì)粒對照轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性分別高18、27、43和123倍Γ P
<0. 05,***Ρ< 0. 001與空載體對照相比)(圖5)。說明MR-I啟動子已經(jīng)準確插入到了熒光素酶基因上游，并在細胞內(nèi)啟動了熒光素酶基因的表達。其中，Ang II可以較為顯著上調(diào)pGL4. 17-MR-1/0. 8K質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的熒光素酶表達，相對于未加藥組上調(diào)了 23倍(#P
<0. 05)，因而選擇pGL4. 17-MR-1/0. 8K質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株?！秾嵤├贩€(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建
1.確定最適G418篩選濃度將處于對數(shù)生長期的H9c2細胞以5000/孔接種于M孔板，待細胞貼壁加G418 (美國 Amersco 公司)篩選，其中 G418 終濃度分別為 0，100，200，300，400，500，600，700，800， 900，1000，1100 μ g/ml共12組；持續(xù)培養(yǎng)10-14天，每2-3天更換含對應(yīng)G418濃度的培養(yǎng)基，觀察細胞生長狀態(tài)。14天后，G418為700 μ g/ml組細胞全部死亡，從而確定本實驗所用的H9c2細胞抗G418的篩選濃度為800 μ g/ml，培養(yǎng)維持濃度為600 μ g/ml。2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選將質(zhì)粒pGL4. 17-MR-1/0. 8k轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞H9c2，在G418篩選壓力下制備穩(wěn)定表達的細胞克隆。經(jīng)800 μ g/ml G418處理30天后，以轉(zhuǎn)染pGL4. 17的H9c2細胞作為陰性對照，檢測其熒光素酶活性。統(tǒng)計學(xué)分析表明，pGL4-MR-l/0Jk質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的H9c2細胞株較pGL4. 17空載體轉(zhuǎn)染的H9c2細胞對照株熒光素酶表達有顯著性差異(圖6) P < 0. 001)，表明質(zhì)粒pGL4. 17-MR-1/0. 8k已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入了 H9c2細胞。繼續(xù)傳代培養(yǎng)10次， 熒光素酶的表達活性無明顯降低，即確定為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株?！秾嵤├摹贩€(wěn)定細胞株在篩選抑制AngII誘導(dǎo)MR-I基因表達化合物中的應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株H9c2-MR-l/0. 8k按照每孔1 X IO4個數(shù)量接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔150 μ L，37°C、5% CO2培養(yǎng)他后，吸棄培養(yǎng)液上清，更換無血清DMEM培養(yǎng)液，并加入待篩化合物(終濃度為10 μ g/mL)處理0. 5h，之后吸棄藥液，加入1 μ M Ang II處理Mh。細胞熒光素酶表達活性的測定參照熒光素酶檢測系統(tǒng)(!Iomega)說明進行，吸棄 96孔細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液上清，每孔加入PBS洗滌細胞2次后，加入20 μ L細胞裂解液 (美國Promega公司)，37°C靜置15min以充分裂解，每孔加入60 μ L熒光素酶檢測液，用多功能微孔板讀板(Wallac Envision，美國PerkinElmer公司)讀取熒光素酶活性值。采用Losartan (美國sigma公司)作為陽性藥物，檢測其抑制Ang II誘導(dǎo)MR-I 啟動子-報告基因表達的情況。與未加藥細胞相比，Ang II可以顯著上調(diào)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的熒光素酶報告基因表達Cp < 0. 05與不處理的相比)，Losartan能有效抑制Ang II誘導(dǎo)報告基因上調(diào)的表達，抑制率為18% (圖6)，表明本發(fā)明所構(gòu)建的穩(wěn)定細胞株模型有望用于篩選抑制Ang II誘導(dǎo)MR-I基因表達上調(diào)的抗心肌肥大藥物。
權(quán)利要求
1.一種抑制Ang II誘導(dǎo)MR-I基因表達上調(diào)的抗心肌肥大藥物篩選模型，其特征是，所述模型系指轉(zhuǎn)染了 MR-I啟動子一報告基因表達質(zhì)粒的穩(wěn)定表達心肌細胞株。
2.如權(quán)利要求1所述的篩選模型，其特征是，所說基因表達質(zhì)粒為MR-I啟動子與含報告基因表達質(zhì)粒載體的連接產(chǎn)物。
3.如權(quán)利要求1所述的篩選模型，其特征是，所說心肌細胞選自大鼠可傳代心肌細胞。
4.構(gòu)建權(quán)利要求1所述篩選模型的方法，其主要步驟包括1)擴增MR-I基因轉(zhuǎn)錄起始位點啟動子區(qū)域片段，通過酶切和連接克隆于報告基因表達質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒；2)重組質(zhì)粒的PCR、酶切和測序鑒定；3)將鑒定過的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠可傳代心肌細胞，經(jīng)加壓篩選，獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞株。
5.權(quán)利要求1所述模型在篩選抗心肌肥大藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是，培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，在培養(yǎng)液中加入待篩選化合物，部分細胞培養(yǎng)液中再加入Ang II，誘導(dǎo)心肌肥大反應(yīng)發(fā)生；清洗細胞，通過測定待篩化合物抑制報告基因表達程度，評估所述化合物抗心肌肥大的效果。
全文摘要
本發(fā)明涉及以MR-1為靶標的抗心肌肥大藥物篩選模型及其構(gòu)建和應(yīng)用，所說模型中，在大鼠心肌細胞中Ang II可誘導(dǎo)MR-1啟動子-報告基因反應(yīng)性表達上調(diào)，進而通過測定待篩化合物抑制報告基因表達的程度來評價化合物抗心肌肥大的活性，本發(fā)明所建立的藥物篩選模型新穎、高效、可靠、簡便，適于高通量藥物篩選，對于尋找心肌肥大防治藥物具有重要意義。
文檔編號C12N15/113GK102174472SQ20111000794
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者何琪揚, 司書毅, 孔維佳, 王以光, 王真, 蔣建東, 陳金晶 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所