專利名稱：一種液體纖維二糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶的制取技術(shù)領(lǐng)域，是一種液體纖維二糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
生物質(zhì)乙醇的研發(fā)是當(dāng)前各國新資源戰(zhàn)略的重點(diǎn)。世界各國，尤其是巴西、美國、 加拿大、德國、瑞典、日本等發(fā)達(dá)國家，都已致力于開發(fā)清潔高效的生物質(zhì)能利用技術(shù)，但目前世界上還沒有一家工業(yè)規(guī)模利用生物質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇的企業(yè)。酶成本過高，纖維素向酵母可利用單糖的轉(zhuǎn)化效率偏低已成為該行業(yè)發(fā)展的瓶頸。纖維素是植物細(xì)胞壁中含量最豐富的多糖，占生物質(zhì)原料干重的50 — 60%，是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生能源。纖維素分子是有許多吡喃型的D-葡萄糖殘基以 β -1，4糖苷鍵相連而成的多糖，是一種高分子化合物，分子內(nèi)部通過氫鍵的締合作用形成纖維素束，使其不易水解；而纖維乙醇的生產(chǎn)需將纖維素水解為葡萄糖以供發(fā)酵之用；因而對其水解酶類的研究備受關(guān)注。纖維素酶是將纖維素水解為葡萄糖的一組酶的總稱，包括1，4-β-D 一葡聚糖水解酶、1，4-β-D 一葡聚糖纖維二糖水解酶和β —葡萄糖苷酶等組分在內(nèi)的起協(xié)同作用的多組分酶系。液體發(fā)酵往往使得所得酶系單一，水解不夠徹底；而固體發(fā)酵雖可得到較為完整的酶系，但相對于大規(guī)模生產(chǎn)，設(shè)備投資、占地面積、環(huán)境污染均較大，且極易染菌。若以液體發(fā)酵生產(chǎn)不同種類酶后混合使用即消除了固體發(fā)酵的弊端又便于擴(kuò)大生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酶活高，成本低，易操作、發(fā)酵周期短、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，無毒無污染的液體纖維二糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采取的技術(shù)方案是液體纖維二糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法包括以下步驟
(1)菌種使用纖維二糖酶生產(chǎn)菌株中的黑曲霉菌株作為生產(chǎn)菌株，于PDA斜面保藏備
用；
(2)菌種培養(yǎng)挑取菌苔旺盛的步驟1斜面保藏備用的菌種放入培養(yǎng)瓶中，在觀 320C的溫度條件下培養(yǎng)1 3天，移入裝有培養(yǎng)基的種子罐中，移入的菌種量為培養(yǎng)基的1% 6%，在觀 32°C溫度、通風(fēng)比0. 1 0. 7v/v條件下培養(yǎng)12 36小時(shí)，制得生產(chǎn)發(fā)酵菌種；
(3)發(fā)酵處理按以下重量百分比的比例制備成混合發(fā)酵漿料， 2 10%的發(fā)酵菌種，
2 8%粉碎粒度0. 8mm以下的玉米芯， 0. 5 1. 5%的玉米漿， 0. 3 1%的營養(yǎng)鹽， 其余為水；將發(fā)酵漿料放入發(fā)酵罐中，通風(fēng)量0. 1 0. 7v/v、攪拌轉(zhuǎn)速100 350rpm進(jìn)行通風(fēng)攪拌發(fā)酵，并在發(fā)酵20 30h后每隔2 6小時(shí)按初始發(fā)酵漿料重量流加重量百分比為 0. 1 3%的玉米漿和重量百分比為0. 1 1. 0%的粉碎粒度0. 8mm以下的玉米芯，溫度控制在沈 34°C，發(fā)酵5 7天，經(jīng)板框過濾濾去發(fā)酵漿液中的殘?jiān)纯芍瞥梢后w纖維二糖酶。其中步驟1中所述黑曲霉菌株，屬于現(xiàn)有技術(shù)，可以從市場上購買得到。其中步驟1中所述培養(yǎng)基中含有2 8%重量百分比濃度的玉米芯、0. 5 1. 0%重量百分比的玉米芯水混合液，其余為水。其中步驟3 中所述營養(yǎng)鹽為(NH4) 2S04 6. Og/L, KH2PO4 4. 0 g/L，CaCl2 0. 2g/L， MgSO4 · 7H20 0. 2 g/L, Fe SO4O. 4mg/L, Zn SO4 · 7H20 2. Omg/L, Cocl2 · 6 H202. Omg/L。其中步驟3中所述殘?jiān)?，可以作為飼料添加劑出售。按照上述方法生產(chǎn)的液體纖維二糖酶，采用高產(chǎn)酶活的黑曲霉誘變株作為生產(chǎn)菌株，以玉米芯作為發(fā)酵基料，能夠保證霉菌生長繁殖快，生產(chǎn)的纖維二糖酶無毒、無害，含有內(nèi)切1-1，4葡萄糖甘酶等。該方法還具有生產(chǎn)工藝簡單，操作實(shí)施方便，原料來源廣泛，生產(chǎn)成本低，無污染等優(yōu)點(diǎn)適宜于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。本方法生產(chǎn)的液體纖維二糖酶既可應(yīng)用于食品、能源、飼料以及環(huán)保等領(lǐng)域，更可用于生物乙醇，提高生物質(zhì)原料向酵母可利用單糖的轉(zhuǎn)化效率，從而提高生物質(zhì)原料獲得燃料乙醇的效率，有效解決規(guī)模化生產(chǎn)對酶量的需求，同時(shí)也有效提高了秸稈資源的綜合利用水平。而且利用玉米芯作為低糖培養(yǎng)基，發(fā)酵得到酶制劑后分離出的固體殘?jiān)幸欢康睦w維二糖酶和菌體蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)，用作飼料添加劑效益明顯。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明生產(chǎn)液體纖維二糖酶的方法，采用高活力黑曲霉菌株作為生產(chǎn)菌株，在低糖培養(yǎng)基上進(jìn)行液體深層通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)纖維二糖酶制劑，能使酶合成不受阻遏而且生長迅速，酶活與成本比值高，技術(shù)易掌握、發(fā)酵周期短、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，無毒無污染。所牛產(chǎn)的纖維二糖酶1酶制劑后分離出的固體殘?jiān)幸欢康睦w維二糖酶和菌體蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)， 可用作飼料添加劑，能有效地提高農(nóng)作物資源的綜合利用水平，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明。實(shí)施例1
下面以50L發(fā)酵罐為例對本發(fā)明做以詳細(xì)的說明
首先從纖維二糖酶生產(chǎn)菌株中挑選出高活力黑曲霉菌株作為生產(chǎn)菌株于PDA斜面菌苔上保存?zhèn)溆?；再挑取菌苔旺盛的斜面菌種放入培養(yǎng)瓶中，在30°C的溫度條件下培養(yǎng)1 3 天，然后在種子罐中加入培養(yǎng)基，再將培養(yǎng)瓶菌種按培養(yǎng)基1 5%的重量百分比接入種子罐中，在洸 32°C、通風(fēng)比0. 1 0. 8v/v條件下培養(yǎng)30 36h，其中培養(yǎng)基為0. 5 4%重量百分比濃度的玉米芯、0. 5 2. 0%麩皮水混合液，制得生產(chǎn)菌種；按重量百分比2 10% 的生產(chǎn)菌種、2 8%粉碎粒度0. 8mm以下的玉米芯、0. 5 1. 5%玉米漿、0. 3 1%營養(yǎng)鹽、 75 95%的水混合成發(fā)酵漿料，將發(fā)酵漿料放入50L發(fā)酵罐中按通風(fēng)量0. 1 0. 8v/v、攪拌轉(zhuǎn)速100 350rpm進(jìn)行通風(fēng)攪拌發(fā)酵，并在發(fā)酵16 觀后每隔2 6小時(shí)按初始發(fā)酵漿料重量流加0. 1 3%的玉米漿和0. 1 1. 0%的玉米芯，溫度控制在洸 ;34°C，發(fā)酵3 5天，100目濾布手工過濾濾去發(fā)酵漿液中的殘?jiān)纯芍瞥梢后w的纖維二糖酶。其中所述黑曲霉菌株，屬于現(xiàn)有技術(shù)，可以從市場上購買得到。實(shí)施例2
下面再以5m3發(fā)酵罐為例對本發(fā)明做以詳細(xì)地說明
首先在纖維二糖酶生產(chǎn)菌株中挑選出黑曲霉誘變株作為生產(chǎn)菌株于PDA斜面菌苔上保存?zhèn)溆?；再挑取菌苔旺盛的斜面菌種放入培養(yǎng)瓶中，在30°C的溫度條件下培養(yǎng)30 36h， 然后在種子罐中加入培養(yǎng)基，再將培養(yǎng)瓶菌種按培養(yǎng)基2 10%的重量百分比接入種子罐中，在32°C、通風(fēng)比0. 1 0. 8v/v條件下培養(yǎng)20 30h，其中種子罐培養(yǎng)基為1 4%重量百分比濃度的玉米芯、0. 5 2. 0%麩皮水混合液制得生產(chǎn)菌種；按重量百分比2 10%的生產(chǎn)菌種、2 8%粉碎粒度0. 8mm以下的玉米芯、0. 5 2. 0%玉米漿、0. 3 1%營養(yǎng)鹽、75 95%的水混合成發(fā)酵漿料，將發(fā)酵漿料放入5 m3發(fā)酵罐中按通風(fēng)量0. 1 0. 8v/v、攪拌轉(zhuǎn)速100 350rpm進(jìn)行通風(fēng)攪拌發(fā)酵，并在發(fā)酵20 30h后每隔2 6小時(shí)按初始發(fā)酵漿料重量流加0. 1 3%的玉米漿和0. 1 1. 0%的玉米芯，溫度控制在洸 ;34°C，發(fā)酵5 7天，，用板框過濾濾去發(fā)酵漿液中的殘?jiān)纯芍瞥梢后w的纖維二糖酶。實(shí)施例3
下面以50 m3發(fā)酵罐為例對本發(fā)明做以詳細(xì)地說明
首先在纖維二糖酶生產(chǎn)菌株中挑選出黑曲霉誘變株作為生產(chǎn)菌株于PDA斜面菌苔上保存?zhèn)溆?；再挑取菌苔旺盛的斜面菌種放入培養(yǎng)瓶中，在32°C的溫度條件下培養(yǎng)1 3天， 然后在種子罐中加入培養(yǎng)基，再將培養(yǎng)瓶菌種按培養(yǎng)基2 10%的重量百分比接入種子罐中，在25 32°C溫度、通風(fēng)比0. 1 0. 8v/v條件下培養(yǎng)12 M小時(shí)，其中培養(yǎng)基為1 6% 重量百分比濃度的玉米芯、0. 5 2. 0%麩皮水混合液，制得生產(chǎn)菌種；按按重量百分比2 10%的生產(chǎn)菌種、2 8%粉碎粒度0. 8mm以下的玉米芯、0. 5 2. 0%玉米漿、0. 3 1%營養(yǎng)鹽、75 95%的水混合成發(fā)酵漿料，將發(fā)酵漿料放入50 m3發(fā)酵罐中按通風(fēng)量0. 1 0. 8v/ ν、攪拌轉(zhuǎn)速100 350rpm進(jìn)行通風(fēng)攪拌發(fā)酵，并在發(fā)酵20 30h后每隔2 6小時(shí)按初始發(fā)酵漿料重量流加0. 1 3%的玉米漿和0. 1 1. 0%的玉米芯，溫度控制在沈 34°C， 發(fā)酵5 7天，，用板框過濾濾去發(fā)酵漿液中的殘?jiān)纯芍瞥梢后w的纖維二糖酶。
權(quán)利要求
1.一種液體纖維二糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于它包括以下步驟(1)菌種使用纖維二糖酶生產(chǎn)菌株中的黑曲霉菌株作為生產(chǎn)菌株，于PDA斜面保藏備用；(2)菌種培養(yǎng)挑取菌苔旺盛的步驟1斜面保藏備用的菌種放入培養(yǎng)瓶中，在觀 320C的溫度條件下培養(yǎng)1 3天，移入裝有培養(yǎng)基的種子罐中，移入的菌種量為培養(yǎng)基的1% 6%，在觀 32°C溫度、通風(fēng)比0. 1 0. 7v/v條件下培養(yǎng)12 36小時(shí)，制得生產(chǎn)發(fā)酵菌種；(3)發(fā)酵處理按以下重量百分比的比例制備成混合發(fā)酵漿料， 2 10%的發(fā)酵菌種，2 8%粉碎粒度0. 8mm以下的玉米芯， 0. 5 1. 5%的玉米漿， 0. 3 1%的營養(yǎng)鹽， 其余為水；將發(fā)酵漿料放入發(fā)酵罐中，通風(fēng)量0. 1 0. 7v/v、攪拌轉(zhuǎn)速100 350rpm進(jìn)行通風(fēng)攪拌發(fā)酵，并在發(fā)酵20 30h后每隔2 6小時(shí)按初始發(fā)酵漿料重量流加重量百分比為 0. 1 3%的玉米漿和重量百分比為0. 1 1. 0%的粉碎粒度0. 8mm以下的玉米芯，溫度控制在沈 34°C，發(fā)酵5 7天，經(jīng)板框過濾濾去發(fā)酵漿液中的殘?jiān)纯芍瞥梢后w纖維二糖酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中步驟1中所述培養(yǎng)基中含有2 8% 重量百分比濃度的玉米芯、0. 5 1. 0%重量百分比的玉米芯水混合液，其余為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中步驟3中所述營養(yǎng)鹽為(MM)2SO4 6. Og/L, KH2PO4 4. 0 g/L, CaCl2 0. 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 2 g/L, Fe SO4O. 4mg/L, Zn SO4 · 7H20 2. Omg/L, Cocl2 · 6 H202. 0mg/Lo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中步驟3中所述殘?jiān)?，可以作為飼料添加劑出售?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種液體纖維二糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，它是采用黑曲霉誘變株作為生產(chǎn)菌株，在低糖培養(yǎng)基上進(jìn)行液體深層通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)纖維二糖酶制劑，該方法能使酶合成不受阻遏而且生長迅速，其生產(chǎn)的纖維二糖酶無毒、無害，可應(yīng)用于、食品、能源、飼料以及環(huán)保等領(lǐng)域，尤其可用于植物纖維乙醇的大規(guī)模生產(chǎn)，開辟了利用農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)能源的有效途徑。而且該方法具有酶活與成本比值高，技術(shù)易掌握、發(fā)酵周期短、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，無毒無污染等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)發(fā)酵得到酶制劑后分離出的固體殘?jiān)幸欢康睦w維二糖酶和菌體蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)，用作飼料添加劑效益明顯。
文檔編號(hào)C12N9/42GK102174493SQ20111002492
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者徐峰, 王學(xué)品, 王林風(fēng), 趙子高 申請人:南陽天冠生物發(fā)酵有限公司