專利名稱：以齊整小核菌為菌種生產(chǎn)高活性纖維素酶的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬微生物制造領域，具體涉及齊整小核菌(6b7er"j'， rW/^'力在生產(chǎn)纖維素酶上的新用途。
背景技術(shù)：
纖維素酶是指能夠水解纖維素^ -1， 4糖苷鍵，使纖維素變成纖 維二糖和葡萄糖的酶。它不是指單一酶，而是指起協(xié)同作用的多組分 的酶系。目前，這種酶系一般認為由三類酶組成 一是內(nèi)切e-葡聚 糖酶(亦稱Cx酶、CMC酶)；二是外切P-葡聚糖酶(亦稱C1酶、 微晶纖維素酶)；三是e-葡萄糖苷酶(亦稱CB酶或纖維二糖酶)。上 述三類酶協(xié)同作用，可以將纖維素降解為簡單糖。
纖維素酶生物技術(shù)行業(yè)起始于上個世紀80年代，最初是應用于 動物飼料生產(chǎn)，隨后是食品行業(yè)，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應用于紡織、洗滌劑、 食品、釀造和制漿造紙工業(yè)等。纖維素酶制劑的應用是利用纖維素酶 的四種性質(zhì)即外切酶從纖維素末端降解纖維素、內(nèi)切酶從鏈中間隨機 降解纖維素、fi-葡萄糖苷酶作用于纖維二糖底物和CBD吸附纖維素底 物的聯(lián)合作用，把纖維素降解成葡萄糖。
纖維素酶廣泛應用于食品、飼料、釀酒、紡織等領域，產(chǎn)纖維素 酶的微生物涵蓋細菌、放線菌和真菌。目前報道用于生產(chǎn)纖維素酶的 微生物菌種較多的是絲狀真菌，其中酶活力較強的菌種為木霉屬(7Wc/ ocfer鵬)、曲霉屬(As"/ ar^z72"51)、青霉屬(尸e/ icj.W"/z )、擔 子菌CBwW0m7cetes)類的褐腐真菌(Brown-rot fiingi)和白腐真菌
(White-rot fUngi),特別是綠色木霉(7^'c力oflkra a Ta'wVe)及其近緣 菌株等較為典型，是目前公認的較好的纖維素酶生產(chǎn)菌，但木霉菌易 產(chǎn)生對人和動物有毒的真菌毒素，用其作為菌株生產(chǎn)的纖維素酶作為 食品和飼料添加劑，需除去這些真菌毒素，從而會大大增加生產(chǎn)成本。
齊整小核菌(6WeTY 0'咖rW/^'j')是植物白絹病的病原菌， 因其在侵染發(fā)病部位表面產(chǎn)生大量白色菌絲體，輻射狀蔓延，形成白 色絹絲狀網(wǎng)膜，故名白絹病。屬于半知菌亞門、絲孢綱、無孢目、小 核菌屬(6Wero"咖)真菌，其有性態(tài)為羅耳阿太菌A/^/^ra//^7，屬 擔子菌亞門，非褶菌目，自然條件下不常發(fā)生有性態(tài)。齊整小核菌的 寄主植物多達200種，如茄果類、瓜類、豆類、魔芋類蔬菜、果樹、 藥材、茶、苜蓿、三葉草及金錢樹、蘭花、君子蘭、蝴蝶蘭、松鼠尾、 冬珊瑚、瓜葉菊等多種花卉。以往國內(nèi)外對于齊整小核菌的研究多側(cè) 重于齊整小核菌的病原菌特性及產(chǎn)胞外多糖上，未見有齊整小核菌用 于生產(chǎn)纖維素酶的報道。
長期以來，缺乏高產(chǎn)菌株一直是制約纖維素酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn) 的瓶頸，因此篩選獲得優(yōu)良的菌株是實現(xiàn)纖維素酶批量生產(chǎn)的關鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種齊整小核菌在纖維素酶生產(chǎn)中的用途， 即以齊整小核菌作為生產(chǎn)菌種進行產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。
本發(fā)明所述齊整小核菌有多種獲得方法，屬于公知成熟技術(shù)，可利用多種微生物分離方法從多種植物白娟病病株或土壤中分離獲得。 由于本發(fā)明首次公開了齊整小核菌能生產(chǎn)纖維素酶的用途，因 此，只要以齊整小核菌為生產(chǎn)菌種發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，均屬于本發(fā)明 的保護范圍。
為了能更好地理解本發(fā)明所述的齊整小核菌用于生產(chǎn)纖維素酶
的新用途，下面用發(fā)明人從金錢樹(Za啦'oc"7ca za啦7/bh'a)白絹 病(Southern Blight)病株上分離到一株齊整小核菌菌株SM，對該 菌株進行了纖維素酶活性測定、纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基配方篩選和 對獲得的纖維素酶粗酶粉的酶活力測定等試驗結(jié)果，說明齊整小核菌 在生產(chǎn)纖維素酶方面的新用途。
1、齊整小核菌SM的分離、鑒定和產(chǎn)纖維酶活性測定 本發(fā)明從海南金錢樹(Za肌'oc^cas za/w'j'/bh'a)白絹病 (Southern Blight)病株上采集菌核(圖l)，在超凈工作臺中經(jīng)滅 菌水洗凈表面后，將菌核移接于羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為唯一碳 源的培養(yǎng)基平板上，待菌落長出后進行剛果紅染色初步測定其纖維素 酶產(chǎn)生能力，然后用DNS法測對其進行纖維素酶活力復篩測定。結(jié)果 表明，從金錢樹白娟病病株獲得的小核菌菌株SM在CMC-Na平板上生 長良好，經(jīng)剛果紅染色可見清晰明亮的透明圈(圖2)，表明其具有 纖維素酶產(chǎn)生能力。經(jīng)DNS法測定，其內(nèi)切e-葡聚糖酶(CMC酶)活 力為8.044U/ml，濾紙酶酶(FPA酶)活力為0.923U/ml，表明其纖 維素酶活性高。從CMC-Na平板上挑取小核菌菌塊移于PDA培養(yǎng)基 平板上進行菌落形態(tài)觀察，菌絲粗壯，生長快速，菌落呈白色放射絮狀白色放射絮狀(圖3)，最后從菌落表面長出棕黃色菌核，菌絲體 在顯微鏡下觀察具有隔膜，白色，無產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，菌核由外層的擬薄壁 組織和內(nèi)層的疏絲組織組成。經(jīng)rDNA-ITS序列測序和序列提交Gene-Bank進行同源性比對分析(序列登錄號為GQ121442)，與Gene-Bank 中的齊整小核菌Jz^e"'a^^/sj7 isolate SR-SC1菌株序列(登記號 EU338381. 1)同源性最高，達99%。因而將從金錢樹白娟病病株上分離 篩選獲得的小核菌菌株鑒定為半知菌亞門、絲孢綱、無孢目、小核菌 屬(5Wer。〃，)、齊整小核菌種(6W，"'，ro2/^.j')，其有性態(tài) 為羅耳阿太菌^Ae/z'" ra訴z'/ ，屬擔子菌亞門。
表1.齊整小核菌SM產(chǎn)纖維素酶能力的DNS法復篩結(jié)果
菌株號CMC酶活力值FPA酶活力值
齊整小核菌SM8.044U/ml0.923U/ml
2、齊整小核菌SM生產(chǎn)高活性纖維素酶的方法 以齊整小核菌作為生產(chǎn)菌種，采用液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌接入
三角瓶液體菌種，進行液體深層發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。
上述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基是將碳源、黃豆粉、(NH4) 2S04、 KH2P04 、
CaCl2、 MgS04'7H20、 MnS04、 FeS04*7H20、 ZnS04'7H20、 CoCl2
和水經(jīng)配制而成，其中按重量百分比計各組分的含量為碳源1.5 2%，黃豆粉1.0 2%， (NH4) 2S04 0.02 0.1%， KH2P04 0.3%， CaCl2 0.050/o， MgS04*7H20 0,05%， MnS04 0.002%o, FeS04'7H20 0.0075%。， ZnS04*7H20 0.002%。， CoCl2 0.003%。，余量為水，起始pH5. 0 6. 0。
所述碳源是由農(nóng)作物秸稈、木材廢料經(jīng)粉碎和高壓噴爆處理而成。
所述生產(chǎn)方法是在發(fā)酵罐中裝入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，裝入量為70%, 液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基pH值為5. 0 6. 0，發(fā)酵溫度為28 30°C，通氣量為 1.0:0.04 1.0: 1.0，發(fā)酵時間為96 120小時；發(fā)酵后發(fā)酵液經(jīng)過 膜過濾、真空濃縮和噴霧干燥即制成纖維素酶粗酶粉。
3、齊整小核菌SM發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶粗酶粉酶活力測定 按照中華人民共和國國家發(fā)展和改革委員會2003年發(fā)布的《中 華人民共和國輕工業(yè)行業(yè)標準.纖維素酶制劑》中所載方法測定CMC 酶活力值、FPA酶活力值，參考上述文獻中的方法測定生成的還原糖 量，計算出卩-葡萄糖苷酶活力值，測定結(jié)果如表2。
表2齊整小核菌SM發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶粗酶粉酶活力測定結(jié)果
纖維素酶樣品CMC酶活力FPA酶活力3 -葡萄糖苷酶活力
粗酶粉10451U/g2000U/g3000U/g
目前國內(nèi)用于纖維素酶生產(chǎn)的菌株多為經(jīng)過誘變選育的突變菌
株，如，里氏木霉誘變菌株的CMC酶活力為20000U/g;長柄木霉誘 變菌株的CMC酶活力為18000U/g;日本曲霉和斜臥青霉的CMC酶 活力均為8000U/g。從上述酶活力測定數(shù)據(jù)可知，齊整小核菌野生型 菌株SM發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶粗酶粉的CMC酶活力達10000 U/g以上， FPA酶活力達2000U/g， 3 -葡萄糖苷酶活力達3000U/g,說明齊整小 核菌SM產(chǎn)生的纖維素酶活力高，可以把纖維素降解為簡單糖。本發(fā)明提供了以齊整小核菌為菌種生產(chǎn)纖維素酶的新用途，通過 實驗驗證齊整小核菌具有產(chǎn)生高活性纖維素的特性，可廣泛應用于纖 維素酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)。


圖1齊整小核菌SM的菌核形態(tài)圖。
圖2齊整小核菌SM在CMC-Na上長出菌落后剛果紅染色呈現(xiàn)的 透明圈圖。
圖3齊整小核菌SM在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明作進一步闡述，但不限制本發(fā)明。 實施例一
齊整小核菌產(chǎn)生的高活性纖維素酶的制備
初級種子培養(yǎng)基(PDA平板)土豆200g洗凈,去皮,切成小塊,煮 沸30min，紗布過濾，定容至lL,再加0.1。/oCMC-Na， 1%葡萄糖，2% 瓊脂，自然pH，滅菌后倒平板。
次級種子培養(yǎng)基土豆200g洗凈,去皮,切成小塊,煮沸30min , 紗布過濾，定容至lL，再加0.1。/oCMC-Na， 1%葡萄糖，自然pH，三 角瓶分裝后(裝量20%)， 12rC滅菌20min。
液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配制稻草粉2%，黃豆粉2%， (NH4)2S04 0.5%， KH2P04 0.3%, CaCl2 0.05%, MgS04*7H20 0.05%， MnS04 0.002%。， FeS04*7H20 0.0075%。， ZnS04'7H20 0.002%。， CoCl2 0.003%。，余量為水。上述稻草粉的預處理粉碎，高壓噴爆。12rC滅菌20min。 以齊整小核菌屬菌株SM為生產(chǎn)菌種，接入初級種子培養(yǎng)基，培 養(yǎng)5天，平板培養(yǎng)基上會長出許多菌核，取若干菌核接入次級種子培 養(yǎng)基，再以30。C，轉(zhuǎn)速150r/min的條件搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)8天，等到三 角瓶內(nèi)長出大量菌核后，將種子液接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐液 體培養(yǎng)基裝入量為70%，培養(yǎng)基pH值為4.0，發(fā)酵溫度為28'C，通 氣量為1:0.5，發(fā)酵時間為110小時。發(fā)酵后發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾除 去菌絲，澄清發(fā)酵液經(jīng)真空濃縮罐濃縮10倍，濃縮液經(jīng)氣流式噴霧 干燥機(進風溫度18(TC)干燥制成纖維素酶粉。
權(quán)利要求
1、以齊整小核菌為菌種生產(chǎn)高活性纖維素酶，其特征在于以齊整小核菌作為生產(chǎn)菌種進行產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。
2、 一種權(quán)利要求1所述的以齊整小核菌為菌種生產(chǎn)高活性纖維 素酶的方法，其特征在于以齊整小核菌作為生產(chǎn)菌種，采用液體產(chǎn) 酶培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌接入三角瓶液體菌種，進行液體深層發(fā)酵生產(chǎn)纖維 素酶；所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基是將碳源、黃豆粉、(NH4)2S04、 KH2P04 、 CaCl2、 MgS04'7H20、 MnS04、 FeS04'7H20、 ZnS04*7H20、 CoCl2和水經(jīng)配制而成，其中按重量百分比計各組分的含量為碳源1.5 2%,黃豆粉1.0 2%,(NH4)2SO40.02 0.1%， KH2P04 0.3%, CaCl2 0.05%， MgSO4'7H2O0.05%， MnS04 0.002%o， FeS04*7H20 0.0075%o， ZnS04*7H20 0.002%。， CoCl2 0.003%o,余量為水。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的以齊整小核菌為菌種生產(chǎn)高活性纖維素酶的方法，其特征在于所述碳源是由農(nóng)作物秸稈、木材廢料經(jīng)粉碎和高壓噴爆處理而成。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以齊整小核菌為菌種生產(chǎn)高活性纖維素酶的方法，其特征在于所述生產(chǎn)方法是在發(fā)酵罐中裝入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，裝入量為70%，液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基pH值為5.0 6.0，發(fā)酵溫 度為28 30。C，通氣量為1.0:0. 04 1.0: 1.0，發(fā)酵時間為96 120 小時；發(fā)酵后發(fā)酵液經(jīng)過膜過濾、真空濃縮和噴霧干燥即制成纖維素 酶粗酶粉。
全文摘要
本發(fā)明屬微生物制造領域，涉及以齊整小核菌為菌種生產(chǎn)高活性纖維素酶的新用途，具體是以齊整小核菌作為生產(chǎn)菌種，將天然纖維素類物質(zhì)經(jīng)粉碎，高壓噴爆處理后作為碳源，再添加氮源和無機鹽配置成液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，然后進行深層液體發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮和噴霧干燥生產(chǎn)纖維素酶。本發(fā)明提供了以齊整小核菌為菌種生產(chǎn)纖維素酶的新用途，通過實驗驗證齊整小核菌具有產(chǎn)生高活性纖維素酶的特性，可廣泛應用于纖維素酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/42GK101580825SQ200910146389
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月17日
發(fā)明者濤 增, 曾會才, 陳漢清 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所