專利名稱：一種用秸稈類木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)乙醇的方法，具體涉及一種用秸稈類木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇的方法，屬于生物質(zhì)化工技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
秸稈類木質(zhì)纖維素資源的主要成分是纖維素、半纖維素和木素。其中，纖維素、半纖維素是可發(fā)酵糖的來源，含量占木質(zhì)纖維的66-75% (纖維質(zhì)原料的絕干重量)。秸稈類木質(zhì)纖維素大量存在于自然界中且能夠不斷再生，但其利用度相當?shù)?，只有極少部分被用作造紙原料、飼料和制備化學品。乙醇俗稱酒精，不僅是一種非常重要的有機化工原料和溶劑，而且因其可再生和對環(huán)境無污染，被認為是可替代石油類不可再生資源的最有發(fā)展前景的液體燃料，我國燃料乙醇的市場規(guī)模正急劇擴大。以秸稈類木質(zhì)纖維素為原料制備乙醇是這類原料能源化利用最為廣泛的課題。乙醇常規(guī)發(fā)酵的方法是半連續(xù)的高糖發(fā)酵，這種常規(guī)發(fā)酵的缺點是糖醇轉(zhuǎn)化率很低，綜合成本過高，使得目前秸稈乙醇很難投入大規(guī)模生產(chǎn)。中國專利200910229716. 8“從秸稈中制備酒精的方法”專利公開了將秸稈與pH值調(diào)至2-4的酸性水溶液按照1份2-3份的質(zhì)量比投入到蒸煮罐中，常壓下加熱至60-90°C 進行蒸煮4-8小時；將蒸煮后的反應物壓榨，得到的溶液中和、調(diào)整濃度15-25%，按常規(guī)發(fā)酵工藝生產(chǎn)乙醇。1噸秸稈可得0.15或0.20噸乙醇。該方法糖醇轉(zhuǎn)化率較低，綜合成本過
尚ο因此，需要一種增加秸稈的糖醇轉(zhuǎn)化率，降低秸稈乙醇的生產(chǎn)成本的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高、資源利用率高的利用秸稈類木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的方法。本發(fā)明提供的一種用秸稈類纖維素原料生產(chǎn)乙醇的方法，包括以下步驟將秸稈類木質(zhì)纖維素原料酶解，制成的秸稈酶解糖液加入釀酒酵母進行低糖發(fā)酵和厭氧發(fā)酵，當發(fā)酵液中的總糖濃度降至0. 8% -1. 2%時開始添加秸稈酶解糖液，維持發(fā)酵液中的總糖濃度在2% -3%。本發(fā)明提供的一種用秸稈類纖維素原料生產(chǎn)乙醇的方法，包括以下步驟1)酵解將秸稈類木質(zhì)纖維素原料酶解，得到秸稈酶解糖液；2)低糖有氧發(fā)酵將制成的秸稈酶解糖液加入釀酒酵母進行低糖發(fā)酵，使其總糖濃度為2-3% ；3)當細胞濃度即光密度達到15-20時，進入第二階段厭氧發(fā)酵；4)當厭氧發(fā)酵液中的總糖濃度降至0. 8% -1. 2%時，開始采用流加的方式添加秸稈酶解糖液，維持發(fā)酵液中的總糖濃度在2% -3%。
本發(fā)明提供的一種用秸稈類纖維素原料生產(chǎn)乙醇的方法，進一步優(yōu)選，包括以下步驟1)酵解將秸稈類木質(zhì)纖維素原料酶解，得到秸稈酶解糖液；2)低糖有氧發(fā)酵將制成的秸稈酶解糖液加入釀酒酵母進行低糖發(fā)酵，使其總糖濃度為2-3%;無菌空氣以通風比為1 0.4-0.8的通風速率流入發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為300-500rpm，維持溶氧濃度為60-80%，溫度控制在30-31°C，好氧培養(yǎng)6_12小時；3)當細胞濃度即光密度達到15-20時，進入第二階段厭氧發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為 100-300rpm，溫度控制在31-33 °C，厭氧發(fā)酵60-70小時；4)當厭氧發(fā)酵液中的總糖濃度降至0. 8% -1. 2%時，開始采用流加的方式添加秸稈酶解糖液，維持發(fā)酵液中的總糖濃度在2% -3%，發(fā)酵55小時后停止流加，當殘?zhí)墙抵?0-0. 2%時停止發(fā)酵。其中，所述秸稈類木質(zhì)纖維素原料選自玉米秸稈、油菜秸稈、高梁秸稈、小麥秸稈、 稻草秸稈或玉米芯中的一種或幾種。上述所述濃度以g/100ml計；所述步驟2)的發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的成分組成秸稈酶解糖液 20-30 %，酵母膏 0. 1-0. 3 %，玉米漿 1-3 %，磷酸二氫鉀 0. 04-0. 06 %，硫酸銨 0. 04-0. 06 %， 磷酸氫二銨0. 1-0. 2%，其余為水，pH 5. 0-6. 0。優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的成分組成秸稈酶解糖液25%，酵母膏0. 2 %，玉米漿2 %，磷酸二氫鉀0. 05 %，硫酸銨0. 05 %，磷酸氫二銨0. 15 %，其余為水， pH5. 0-6. O0所述步驟幻的發(fā)酵培養(yǎng)基還可以由以下質(zhì)量百分比的成分組成秸稈酶解糖液20-30 %，酵母膏0. 1-0. 5 %，蛋白胨0. 01-0. 05 %，玉米漿0. 5-1. 0 %，磷酸二氫鉀 0. 04-0. 06%，硫酸鎂 0. 04-0. 06%，其余為水，ρΗ5· 0-6. 0。所述添加的方式為流加，發(fā)酵55小時后，停止流加直至發(fā)酵結(jié)束。流加的方式可以大大的降低高糖的底物抑制作用，提高糖醇轉(zhuǎn)化率，縮短發(fā)酵周期，降低生產(chǎn)成本。所述步驟4)中添加秸稈酶解糖液的總糖濃度在20-30%。所述秸稈酶解糖液由秸稈酶解后制得，含糖濃度以葡萄糖計為2-8%葡萄糖，在步驟4)加入前需要進行濃縮處理。所述發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的酵母即釀酒酵母為基因工程酵母S. cerevisiaeZU-10，購自浙江大學，普通酵母只能利用葡萄糖發(fā)酵制備乙醇，該菌種不僅可以利用葡萄糖還可以利用木糖發(fā)酵制備乙醇。本發(fā)明所采用的秸稈酶解糖的制備過程為(本人在專利200910259678. 0“一種乙
醇和木糖醇的聯(lián)合發(fā)酵方法”中已經(jīng)敘述過)1)蒸煮將秸稈類木質(zhì)纖維素原料加入濃度為1. 6-2. 2%堿液，在90-120°C下蒸煮0. 5-2小時；或?qū)⒔斩掝惸举|(zhì)纖維素原料加入濃度為0. 1-1. 0%酸液，在120-180°C下蒸煮0. 1-2. 5小時；2)固液分離將蒸煮液固液分離，獲得秸稈黑液和秸稈蒸煮渣；3)秸稈蒸煮渣酶解用纖維素酶、木聚糖酶或纖維二糖酶中的一種或多種，對秸稈蒸煮渣進行酶水解，得酶解液；酶用量為每克酸解渣2-100PFIU纖維素酶，1-50IU纖維二糖酶，10-500PFIU木聚糖酶；酶解過程中控制pH為2. 0-7.0，溫度為20_80°C，酶解時間為10-240小時；4)固液分離酶解液固液分離得到富含葡萄糖和木糖的秸稈酶解糖和富含木質(zhì)素的酶解渣。本發(fā)明利用秸稈類纖維素原料生產(chǎn)乙醇的方法，該方法體現(xiàn)在將秸稈酶解糖以一定的速度流加進入秸稈乙醇發(fā)酵體系中，既有效減少了乙醇發(fā)酵的周期，提高了乙醇濃度， 又解決了高濃度發(fā)酵下的底物抑制作用，提高了糖酒轉(zhuǎn)化率，從而有效提高了秸稈類纖維素原料的綜合利用率。與常規(guī)發(fā)酵方法制備乙醇相比，本發(fā)明大大提高了糖醇轉(zhuǎn)化率，使得用秸稈類木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇的糖醇轉(zhuǎn)化率由原來的不到46%提高到現(xiàn)在的49%以上。與200910229716. 8專利申請中的方法相比，該發(fā)明的糖醇轉(zhuǎn)化率大大的提高了， 從而進一步提高了秸稈類木質(zhì)纖維素原料的綜合利用率，此外在秸稈酶解糖液制備過程中產(chǎn)生的黑液還可以用來制備水泥減水劑，提取香蘭素等，進一步提高秸稈資源的價值。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。如果沒有特別說明，實施例中所述百分含量均為質(zhì)量百分含量，濃度以g/100ml 計。其中釀酒酵母來源購于浙江大學，基因重組酵母S. cerevisiaeZU-10 ；購買廠家只是說明原料的可得性，不用來限制本發(fā)明的范圍。根據(jù)溶氧濃度，好氧培養(yǎng)的溫度也略有差異，同時因為達到即光密度的要求不同， 培養(yǎng)時間也略有差異；因為光密度的不同，轉(zhuǎn)速和溫度也略有差異，因此本發(fā)明設定了一個較小的范圍值，根據(jù)實際操作的不同，可適當?shù)目刂妻D(zhuǎn)速、溫度和時間。實施例11、平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖3% ) 1. 0L,占總重量的20%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，瓊脂2% ；將釀酒酵母菌種接種到該培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)沈小時；2、搖瓶種子培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖3 %，酵母膏0.5%，蛋白胨0. 15%，玉米漿 0.5%，磷酸二氫鉀0. 05%，硫酸鎂0. 06%,pH5. 6,自來水配制；將平板培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到上述搖瓶種子培養(yǎng)基中，500ml三角瓶裝液量 100ml，30°C培養(yǎng)32小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm ；3、種子罐種子培養(yǎng)種子罐種子培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液20% (含葡萄糖5% )，酵母膏0. 5%， 蛋白胨0. 05 %，玉米漿0.8%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0. 06 %，pH5. 5，自來水配制；將搖瓶種子培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到上述種子罐種子培養(yǎng)基中，接種量為 5-10% (v/v)，33°C培養(yǎng)洸小時，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通風比為1 0.4;4、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)
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發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖30% ) 30%，酵母膏0.2%，玉米漿1%，磷酸二氫鉀0. 05%，硫酸銨0. 05%，磷酸氫二銨0. 15%,pH5.8,自來水配制；將搖瓶菌種接種到上述發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為10% (v/v)，35°C培養(yǎng) 72小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。5、發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖25% )30%，酵母膏 0.2%，玉米漿1%，磷酸氫二鉀0. 05%，硫酸銨0. 05%，磷酸氫二銨0. 15%, pH5. 8，自來水配制。將搖瓶種子培養(yǎng)或種子罐中種子培養(yǎng)的菌種接種到上述發(fā)酵罐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為10% (ν/ν)，31-35°C培養(yǎng)70小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。根據(jù)秸稈酶解糖液的體積選擇培養(yǎng)基，將培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到含有秸稈酶解糖液的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，接種量為10% (ν/ν)，根據(jù)該菌株在生長、代謝的不同階段對氧氣及不同碳源需求量的差異，進行有氧、厭氧兩段組合發(fā)酵技術(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)的第一階段為有氧發(fā)酵階段，無菌空氣以通風比為1 0.8的通風速率流入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為300-500rpm，維持溶氧濃度(DO)為60%，溫度控制在30°C，好氧培養(yǎng)8小時；當細胞濃度即光密度(OD)達到16時，進入第二階段厭氧發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度控制在 33°C，當發(fā)酵液中的總糖濃度降至0. 8%時，采用流加的方式添加秸稈酶解糖液，維持發(fā)酵液中的總糖濃度在2%左右，發(fā)酵55小時后停止流加，當殘?zhí)菨舛冉抵?. 2%時發(fā)酵結(jié)束， 乙醇產(chǎn)率達到8. 9%，糖醇轉(zhuǎn)化率達到49. 4%。實施例21、平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖3% ) 1. 0L,占總重量的25%，酵母膏0. 5%，蛋白胨0. 5%，瓊脂2% ；將釀酒酵母菌種接種到該培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)觀小時；2、搖瓶種子培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖3 %，酵母膏0.5%，蛋白胨0. 15%，玉米漿 0.5%，磷酸二氫鉀0. 05%，硫酸鎂0. 06%,pH5. 0,自來水配制；將平板培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到上述搖瓶種子培養(yǎng)基中，500ml三角瓶裝液量 100ml，32°C培養(yǎng)四小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm ；3、種子罐種子培養(yǎng)種子罐種子培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液20% (含葡萄糖5% )，酵母膏0. 5%， 蛋白胨0. 05 %，玉米漿0.8%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0. 06 %，pH5. 5，自來水配制；將搖瓶培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到上述種子罐種子培養(yǎng)基中，接種量為5% (ν/ v)，32°C培養(yǎng)沘小時，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通風比為1 0.3。4、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖25-30%)30%,酵母膏0.2%， 玉米漿1%，磷酸二氫鉀0. 05%，硫酸銨0. 05%，磷酸氫二銨0. 15%,pH5.6,自來水配制；將搖瓶菌種接種到上述發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為20% (v/v)，32°C培養(yǎng) 70小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。5、發(fā)酵罐培養(yǎng)
發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖25-30% )30%，酵母膏 0.2%，玉米漿1%，磷酸氫二鉀0. 05%，硫酸銨0. 05%，磷酸氫二銨0. 15%, pH5. 2，自來水配制；將搖瓶種子培養(yǎng)或種子罐中種子培養(yǎng)的菌種接種到上述發(fā)酵罐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為15% (v/v)，31°C培養(yǎng)70小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。根據(jù)秸稈酶解糖液的體積選擇培養(yǎng)基，將培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到含有秸稈酶解糖液的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，接種量為20% (ν/ν)，根據(jù)該菌株在生長、代謝的不同階段對氧氣及不同碳源需求量的差異，進行有氧、厭氧兩段組合發(fā)酵技術(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)的第一階段為有氧發(fā)酵階段，無菌空氣以通風比為1 0.4的通風速率流入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，維持溶氧濃度(DO)為70%，溫度控制在31°C，好氧培養(yǎng)6小時；當細胞濃度即光密度(OD)達到16時，進入第二階段厭氧發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，溫度控制在33°C， 當發(fā)酵液中的總糖濃度降至1. 0%時，采用流加的方式添加秸稈酶解糖液，維持發(fā)酵液中的總糖濃度在2. 5%左右，發(fā)酵55小時后停止流加，殘?zhí)菨舛冉抵?. 15%時發(fā)酵結(jié)束，乙醇產(chǎn)率達到8.7%，糖醇轉(zhuǎn)化率達到48. 3% ο實施例31、平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖3% ) 1. 0L，酵母膏0. 5%，蛋白胨 0. 5%，瓊脂2%。將釀酒酵母菌種接種到該培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)沈小時；2、搖瓶種子培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖3 %，酵母膏0.5%，蛋白胨0. 15%，玉米漿 0.5%，磷酸二氫鉀0. 05%，硫酸鎂0. 06%, pH5. 3,自來水配制；將平板培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到上述搖瓶種子培養(yǎng)基中，500ml三角瓶裝液量 100ml，31 °C培養(yǎng)30小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm ；3、種子罐種子培養(yǎng)種子罐種子培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液20% (含葡萄糖5% )，酵母膏0. 5%， 蛋白胨0. 05 %，玉米漿0.8%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0. 06 %，pH5. 7，自來水配制；將搖瓶培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到上述種子罐種子培養(yǎng)基中，接種量為5% (ν/ v)，33°C培養(yǎng)30小時，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通風比為1 0.5。4、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖25-30%)30%,酵母膏0.2%， 玉米漿1%，磷酸二氫鉀0. 05%，硫酸銨0. 05%，磷酸氫二銨0. 15%,pH5.8,自來水配制；將搖瓶菌種接種到上述發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為10% (v/v)，33°C培養(yǎng) 72小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。5、發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖25-30% )30%，酵母膏 0.2%，玉米漿1%，磷酸氫二鉀0. 05%，硫酸銨0. 05%，磷酸氫二銨0. 15%, pH5. 8，自來水配制；將搖瓶種子培養(yǎng)或種子罐中種子培養(yǎng)的菌種接種到上述發(fā)酵罐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為10% (ν/ν)，33°C培養(yǎng)74小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。
根據(jù)秸稈酶解糖液的體積選擇培養(yǎng)基，將培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到含有秸稈酶解糖液的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，接種量為20% (ν/ν)，根據(jù)該菌株在生長、代謝的不同階段對氧氣及不同碳源需求量的差異，進行有氧、厭氧兩段組合發(fā)酵技術(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)的第一階段為有氧發(fā)酵階段，無菌空氣以通風比為1 0.6的通風速率流入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，維持溶氧濃度(DO)為65 %，溫度控制在30°C，好氧培養(yǎng)10小時；當細胞濃度即光密度(OD)達到18時，進入第二階段厭氧發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為IOOrpm，溫度控制在 32°C，當發(fā)酵液中的總糖濃度降至1.2%時，采用流加的方式添加秸稈酶解糖液，維持發(fā)酵液中的總糖濃度在3%左右，發(fā)酵55小時后停止流加，當殘?zhí)菨舛冉抵?. 2%時發(fā)酵結(jié)束， 乙醇產(chǎn)率達到9.1%，糖醇轉(zhuǎn)化率達到49. 8 %。實施例41、平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖3% ) 1. 0L，酵母膏0. 5%，蛋白胨 0. 5%，瓊脂2%。將釀酒酵母菌種接種到該培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)沈小時；2、搖瓶種子培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖3 %，酵母膏0.5%，蛋白胨0. 15%，玉米漿 0.5%，磷酸二氫鉀0. 05%，硫酸鎂0. 06%, pH5. 3,自來水配制；將平板培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到上述搖瓶種子培養(yǎng)基中，500ml三角瓶裝液量 100ml，31 °C培養(yǎng)30小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm ；3、種子罐種子培養(yǎng)種子罐種子培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液20% (含葡萄糖5% )，酵母膏0. 5%， 蛋白胨0. 05 %，玉米漿0.8%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0. 06 %，pH5. 7，自來水配制；將搖瓶培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到上述種子罐種子培養(yǎng)基中，接種量為5% (ν/ v)，33°C培養(yǎng)30小時，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通風比為1 0.5。4、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖25-30%)30%,酵母膏0.2%， 玉米漿1%，磷酸二氫鉀0. 05%，硫酸銨0. 05%，磷酸氫二銨0. 15%,pH5.8,自來水配制；將搖瓶菌種接種到上述發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為10% (v/v)，33°C培養(yǎng) 72小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。5、發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖25-30% )30%，酵母膏 0.2%，玉米漿1%，磷酸氫二鉀0. 05%，硫酸銨0. 05%，磷酸氫二銨0. 15%, pH5. 8，自來水配制；將搖瓶種子培養(yǎng)或種子罐中種子培養(yǎng)的菌種接種到上述發(fā)酵罐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為10% (ν/ν)，33°C培養(yǎng)74小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。根據(jù)秸稈酶解糖液的體積選擇培養(yǎng)基，將培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到含有秸稈酶解糖液的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，接種量為20% (ν/ν)，根據(jù)該菌株在生長、代謝的不同階段對氧氣及不同碳源需求量的差異，進行有氧、厭氧兩段組合發(fā)酵技術(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)的第一階段為有氧發(fā)酵階段，無菌空氣以通風比為1 0.6的通風速率流入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，維持溶氧濃度(DO)為80 %，溫度控制在31°C，好氧培養(yǎng)10小時；當細胞濃度即光密度(OD)達到18時，進入第二階段厭氧發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm，溫度控制在 33°C，當發(fā)酵液中的總糖濃度降至1.2%時，采用流加的方式添加秸稈酶解糖液，維持發(fā)酵液中的總糖含量在3%左右，發(fā)酵55小時后停止流加，當殘?zhí)菨舛冉抵?. 時發(fā)酵結(jié)束， 乙醇產(chǎn)率達到8.9%，糖醇轉(zhuǎn)化率達到48. 7 %。實施例51、平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖3% ) 1. 0L,占總重量的25%，酵母膏0. 5%，蛋白胨0. 5%，瓊脂2% ；將釀酒酵母菌種接種到該培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)28小時；2、搖瓶種子培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖3 %，酵母膏0.5%，蛋白胨0. 15%，玉米漿 0.5%，磷酸二氫鉀0. 05%，硫酸鎂0. 06%,pH5. 0,自來水配制；將平板培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到上述搖瓶種子培養(yǎng)基中，500ml三角瓶裝液量 100ml，32°C培養(yǎng)29小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm ；3、種子罐種子培養(yǎng)種子罐種子培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液20% (含葡萄糖5% )，酵母膏0. 5%， 蛋白胨0. 05 %，玉米漿0.8%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0. 06 %，pH5. 5，自來水配制；將搖瓶培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到上述種子罐種子培養(yǎng)基中，接種量為5% (ν/ v)，32°C培養(yǎng)28小時，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通風比為1 0.3。4、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖25-30%)30%,酵母膏0.2%， 玉米漿1%，磷酸二氫鉀0. 05%，硫酸銨0. 05%，磷酸氫二銨0. 15%,pH5.6,自來水配制；將搖瓶菌種接種到上述發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為20% (v/v)，32°C培養(yǎng) 70小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。5、發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為秸稈酶解糖液(含葡萄糖25-30% )30%，酵母膏 0.2%，玉米漿1%，磷酸氫二鉀0. 05%，硫酸銨0. 05%，磷酸氫二銨0. 15%, pH5. 2，自來水配制；將搖瓶種子培養(yǎng)或種子罐中種子培養(yǎng)的菌種接種到上述發(fā)酵罐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為15% (v/v)，31°C培養(yǎng)70小時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。根據(jù)秸稈酶解糖液的體積選擇培養(yǎng)基，將培養(yǎng)的釀酒酵母菌種接種到含有秸稈酶解糖液的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，接種量為20% (ν/ν)，根據(jù)該菌株在生長、代謝的不同階段對氧氣及不同碳源需求量的差異，進行有氧、厭氧兩段組合發(fā)酵技術(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)的第一階段為有氧發(fā)酵階段，無菌空氣以通風比為1 0.4的通風速率流入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，維持溶氧濃度(DO)為75%，溫度控制在30°C，好氧培養(yǎng)6小時；當細胞濃度即光密度(OD)達到16時，進入第二階段厭氧發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為IOOrpm，溫度控制在32°C， 當發(fā)酵液中的總糖濃度降至1. 0%時，采用流加的方式添加秸稈酶解糖液，維持發(fā)酵液中的總糖含量在2. 5%左右，發(fā)酵55小時后停止流加，殘?zhí)菨舛冉抵?. 時發(fā)酵結(jié)束，乙醇產(chǎn)率達到9.0%,糖醇轉(zhuǎn)化率達到49. 2% ο雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種用秸稈類木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，包括以下步驟將秸稈類木質(zhì)纖維素原料酶解，制成的秸稈酶解糖液加入釀酒酵母進行低糖發(fā)酵，當發(fā)酵液中的總糖濃度降至0.8% -1.2%時開始添加秸稈酶解糖液，維持發(fā)酵液中的總糖濃度在 2% -3%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)酵解將秸稈類木質(zhì)纖維素原料酶解，得到秸稈酶解糖液；2)低糖有氧發(fā)酵將制成的秸稈酶解糖液加入釀酒酵母，進行低糖發(fā)酵，使其總糖濃度為2-3% ；3)當細胞濃度即光密度達到15-20時，進入第二階段厭氧發(fā)酵；4)當厭氧發(fā)酵液中的總糖濃度降至0.8-1. 2%時，開始采用流加的方式添加秸稈酶解糖液，維持發(fā)酵液中的總糖濃度在2-3%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)酵解將秸稈類木質(zhì)纖維素原料酶解，得到秸稈酶解糖液；2)低糖有氧發(fā)酵將制成的秸稈酶解糖液加入釀酒酵母進行低糖發(fā)酵，使其總糖濃度為2-3% ；無菌空氣以通風比為1 0.4-0.8的通風速率流入發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為 300-500rpm，維持溶氧濃度為60-80%，溫度控制在30-31°C，好氧培養(yǎng)6-12小時；3)當細胞濃度即光密度達到15-20時，進入第二階段厭氧發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為 100-300rpm，溫度控制在31-33 °C，厭氧發(fā)酵60-70小時；4)當厭氧發(fā)酵液中的總糖濃度降至0.8-1.2%時，開始采用流加的方式添加秸稈酶解糖液，維持發(fā)酵液中的總糖濃度在2% _3%，發(fā)酵55小時后停止流加，當殘?zhí)菨舛冉抵?0-0. 2%時停止發(fā)酵。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述秸稈類木質(zhì)纖維素原料選自玉米秸稈、油菜秸稈、高梁秸稈、小麥秸稈、稻草秸稈或玉米芯中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟幻中的發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的成分組成秸稈酶解糖液20-30%，酵母膏0. 1-0. 3%，玉米漿1-3%，磷酸二氫鉀 0. 04-0. 06%，硫酸銨 0. 04-0. 06%，磷酸氫二銨 0. 1-0. 2%，其余為水，ρΗ5· 0-6. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟幻中的發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的成分組成秸稈酶解糖液25 %，酵母膏0.2%，玉米漿2 %，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸銨0. 05%,磷酸氫二銨0. 15%,其余為水，ρΗ5· 0-6. 0。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟幻中的發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的成分組成秸稈酶解糖液20-30%，酵母膏0. 1-0. 5%，蛋白胨0. 01-0. 05%，玉米漿 0. 5-1.0%,磷酸二氫鉀 0. 04-0. 06%，硫酸鎂 0. 04-0. 06%，其余為水，ρΗ5· 0-6. 0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟4)中添加的秸稈酶解糖液的總糖濃度在20-30%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述秸稈酶解糖液由秸稈酶解后制得，含糖濃度以葡萄糖計為2-8%葡萄糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母為基因工程酵母 S.cerevisiae ZU-IO0
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用秸稈類木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇的方法，包括以下步驟將秸稈類木質(zhì)纖維素原料酶解，制成的秸稈酶解糖液加入釀酒酵母進行低糖發(fā)酵，當發(fā)酵液中的總糖濃度降至0.8-1.2％時開始添加秸稈酶解糖液，維持發(fā)酵液中的總糖濃度在2-3％。本發(fā)明采用低糖發(fā)酵的方法制備，既有效減少了乙醇發(fā)酵的周期，提高了乙醇濃度，又解決了高濃度發(fā)酵下的底物抑制作用，提高了糖酒轉(zhuǎn)化率，從而有效提高了秸稈類纖維素原料的綜合利用率。
文檔編號C12P7/10GK102168113SQ20111004691
公開日2011年8月31日 申請日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日
發(fā)明者馮杰, 吳真, 李榮杰, 汪坤, 陶磊, 黃之文 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司