專利名稱：用于實時pcr的核酸模板制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開描述了一種緩沖液和用于高效實時PCR分析的模板核酸制備的方法。在實施例中，所述緩沖液適合于含有目標(biāo)核酸的細(xì)胞的裂解。
背景技術(shù)：
高吞吐量PCR篩選的實施已經(jīng)使現(xiàn)代生物和醫(yī)學(xué)發(fā)生了革命性變化。診斷、環(huán)境監(jiān)控、驗血和基因型分析僅是由該卓越的分析工具發(fā)揮作用的少數(shù)研究領(lǐng)域。隨著生物信息學(xué)的出現(xiàn)，科學(xué)家現(xiàn)在能夠在記錄時間內(nèi)分析大量的遺傳信息。然而，傳統(tǒng)的PCR分析向高吞吐量格式的轉(zhuǎn)變必然需要PCR過程現(xiàn)代化以盡可能地提高效率，同時保留傳統(tǒng)的分析 PCR的優(yōu)點。這種挑戰(zhàn)在試圖檢測從活生物體例如原核病原體提取的目標(biāo)DNA序列時是尤其明顯的，其中，對提高的吞吐量的需要要求細(xì)胞裂解和PCR擴增在相同的反應(yīng)緩沖液中發(fā)生，而不影響PCR檢測的靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于用于高吞吐量實時PCR分析的來自細(xì)胞的核酸模板的有效制備的新的裂解試劑配方。所述試劑的配方允許快速的細(xì)胞裂解和模板制備，而不需要模板純化和分離。因此，所述試劑顯著地提高了實時PCR分析的吞吐量，同時保留了檢測的靈敏度。因此，本發(fā)明提供了用于使用裂解試劑來制備模板核酸的新的方法，所述裂解試劑在PCR擴增的少至30個循環(huán)內(nèi)允許單分子核酸模板的快速的且靈敏的實時PCR檢測。在一方面，本發(fā)明提出了一種制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法。在裂解試劑中裂解細(xì)胞，所述裂解試劑包含PH為大約6至大約9的緩沖液、濃度為大約0. 125% 至大約2%的兩性離子洗滌劑、濃度為大約0. 3mg/ml至大約2. 5mg/ml的疊氮化物以及蛋白酶。在使所產(chǎn)生的細(xì)胞裂解物在大約孵育大約15分鐘以產(chǎn)生基本上無蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物之后，使所述蛋白酶在大約95°C失活大約10分鐘。所述基本上無蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物在混合物中提供了用于實時PCR擴增反應(yīng)的模板，所述混合物包括一對擴增引物， 能夠退火以在所述細(xì)胞裂解物中獲得目標(biāo)DNA序列；包括可檢測的標(biāo)記的探針以及與目標(biāo) DNA的區(qū)域基本上互補的DNA和RNA核酸序列；擴增聚合酶活性；擴增緩沖液；RNase H活性。在所述目標(biāo)DNA在第一擴增引物和第二擴增引物之間擴增之后，所述探針內(nèi)的RNA序列能夠與所述目標(biāo)DNA中的互補的DNA序列形成RNA:DNA異源雙鏈體。所述RNase H活性可以是熱啟動RNase H活性(即，僅在暴露于非常高的溫度之后才被激活)或熱穩(wěn)定的RNase H活性或者這兩者。在另一方面，本發(fā)明涉及一種制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法。在裂解試劑中裂解細(xì)胞，所述裂解試劑包括PH為大約6至大約9的緩沖液、濃度為大約0. 125%至大約2%的兩性離子洗滌劑、濃度為大約0. 3mg/ml至大約2. 5mg/ml的疊氮化物。在使所產(chǎn)生的細(xì)胞裂解物在大約55°C孵育大約15分鐘之后，所述細(xì)胞裂解物在混合物中提供用于實時PCR擴增反應(yīng)的模板，所述混合物包括一對擴增引物，能夠退火以在所述細(xì)胞裂解物中獲得目標(biāo)DNA序列；包括可檢測的標(biāo)記的探針以及與目標(biāo)DNA的區(qū)域基本上互補的DNA 和RNA核酸序列；擴增聚合酶活性；擴增緩沖液；RNase H活性。在所述目標(biāo)DNA在第一擴增引物和第二擴增引物之間擴增之后，所述探針內(nèi)的RNA序列能夠與所述目標(biāo)DNA中的互補的DNA序列形成RNA: DNA異源雙鏈體。所述細(xì)胞裂解物的加入允許對所述細(xì)胞裂解物中的單個目標(biāo)DNA分子進(jìn)行實時 PCR檢測，所述實時PCR檢測需要少于40個的PCR擴增循環(huán)、少于35個的PCR擴增循環(huán)或少于30個的PCR擴增循環(huán)。在特定實施例中，所述擴增反應(yīng)混合物可以包括逆轉(zhuǎn)錄活性。所述探針可以用熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記可以是FRET對。在另一實施例中，所述基本上無蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物由所述擴增反應(yīng)混合物稀釋 5-15 倍。所述細(xì)胞可以是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞(例如，Listeria)或革蘭氏陰性細(xì)胞(例如，E. coli 或 Salmonella)。所述緩沖液可以是醋酸鹽或磷酸鹽類緩沖液、3-(N_嗎啉代)丙烷磺酸(MOPS)、 N-(2-羥乙基)哌嗪-N' -(2-乙烷磺酸)(HEPES)或2-氨基-2-羥甲基_1，3_丙二醇緩沖液(Tris)。所述兩性離子洗滌劑可以是3-[(3_膽汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸鹽 (CHAPS)。所述蛋白酶可以是蛋白酶K。在另一實施例中，本發(fā)明公開了一種裂解試劑，所述裂解試劑包括pH為大約6至大約8的緩沖液、濃度為大約0. 125%至大約2%的兩性離子洗滌劑和濃度為大約0. 3mg/ml 至大約2. 5mg/ml的疊氮化物，其中，大約5-15倍稀釋的試劑與擴增反應(yīng)混合物一起存在不抑制擴增聚合酶和RNase H酶活性。所述裂解試劑可以含有緩沖液，所述緩沖液具有醋酸鹽或磷酸鹽類緩沖液、 3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸(MOPS)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N' -(2-乙烷磺酸)(HEPES)或 2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇緩沖液(Tris)。所述兩性離子洗滌劑可以是3-[(3_膽汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸鹽 (CHAPS)。在另一實施例中，所述裂解試劑包括pH為大約6至大約8的緩沖液、濃度為大約 0. 125%至大約2%的兩性離子洗滌劑、濃度為大約0. 3mg/ml至大約2. 5mg/ml的疊氮化物以及蛋白酶，其中，在使所述蛋白酶失活之后，大約5-15倍稀釋的試劑與擴增反應(yīng)混合物一起存在不抑制擴增聚合酶和RNase H酶活性。所述緩沖液可以包括醋酸鹽類緩沖液、3-(N_嗎啉代)丙烷磺酸(MOPQ、N-(2_羥乙基)哌嗪-N' -(2-乙烷磺酸)(HEPEQ或2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇緩沖液。所述兩性離子洗滌劑可以是3_[ (3-膽汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸鹽。
前面描述的實施例具有許多優(yōu)點，包括在不需要模板純化和分離的情況下執(zhí)行細(xì)胞裂解和實時PCR的能力。該檢測方法快速、精確、靈敏且適合于高吞吐量應(yīng)用。


圖1是CataCleave探針技術(shù)的示意圖。圖2是PCR擴增產(chǎn)物的實時CataCleave探針檢測的示意圖。圖3A是在不同的裂解試劑(CZ1-7&0. 125 X TZ)的存在下使用CataCleave探針來檢測Mlmonella (沙門氏菌)DNA的實時PCR反應(yīng)的輸出。圖;3B在不同濃度的裂解試劑的存在下使用CataCleave探針來檢測Listeria(李斯特菌)DNA的實時PCR反應(yīng)的輸出。圖4是使用CataCleave探針來檢測使用不同濃度的裂解試劑所獲得的Listeria 細(xì)胞裂解物中的目標(biāo)DNA序列的實時PCR反應(yīng)的輸出。圖5是使用CataCleave探針來檢測使用優(yōu)選裂解溶液的低濃度Listeria細(xì)胞的實時PCR反應(yīng)的輸出。
具體實施例方式除非另外表示，否則這里描述的實施例的實踐使用本領(lǐng)域內(nèi)的傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)。這樣的技術(shù)對技術(shù)人員是公知的，并被文獻(xiàn)充分地解釋。參見例如，Ausubel 等人’ Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, Inc. , NY, N. Y. (1987-2008)，包括全部的附錄；Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)。除非另外定義，否則這里使用的全部的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的意思相同的意思。說明書也提供了對術(shù)語的定義來幫助理解本申請的公開和權(quán)利要求。在定義與在別處定義不一致的情況下，將參照本申請中提出的定義。如這里使用的，術(shù)語“細(xì)胞”可以指原核或真核細(xì)胞。在一個實施例中，術(shù)語“細(xì)胞”可以指微生物，例如細(xì)菌，所述細(xì)菌包括、但不限于革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、耐酸細(xì)菌等。在特定的實施例中，將被測試的“細(xì)胞”可以使用表面的拭子采樣來收集。在其它實施例中，“細(xì)胞”可以指致病生物體。如這里使用的，革蘭氏陽性細(xì)菌包括、但不限于Actinomedurae、Actinomyces israelii (衣氏方文線菌)、Bacillus anthracis (炭疽桿菌)、Bacillus cereus (賭樣芽胞桿菌)、Clostridium botulinum(肉毒桿菌)、Clostridium difficile (艱難梭狀芽胞桿菌)、Clostridium perfringens (產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌)、Clostridium tetani (破傷 ))、Corynebacterium(棒桿菌)、Enterococcus faecalis ( MMjW-M )、Listeria monocytogenes (‘)、Nocardia ( i^-f^ )、Propionibacterium acnes (痤疫丙酸桿菌)、Staphylococcus aureus (金黃色葡萄球菌)、Staphylococcus epiderm(表皮葡萄球菌)、Streptococcus mutans (變形鏈球菌)、Streptococcus pneumoniae (月市炎鏈球菌)等。如這里使用的，革蘭氏陰性細(xì)菌包括、但不限于Afipia fielis、Bacteriodes (類木干胃)、Bartonella bacilliformis ( ff ^^)、Bortadella pertussis ( HH^t専德特氏菌)、Borrelia burgdorferi (包柔氏il旋體菌)、Borrelia recurrentis(回 β 1 ^ll ^ 1 il JiE # )、Brucella ( 1 )、Calymmatobacterium granulomatis (肉芽腫莢膜桿菌)、Campylobacter (彎曲桿菌屬)、Escherichia coli (大腸桿菌)、 Francisella tularensis ( 土拉熱弗朗西絲氏菌)、Gardnerella vaginalis (陰道力口德胃)、Haemophilius aegyptius ( i^R^ikM )、Haemophilius ducreyi ( ft3 W KBfifilff 胃)、Haemophilius influenziae (Bf ifiliJit^ff ^ )、Heliobacter pylori ( ΜΠ^ΨΜΜ )、 Legionella pneumophila (嗜月市性軍團(tuán)病桿菌)、Leptospira interrogans (腎臟鉤端螺方寵體)、Neisseria meningitidia (腦膜炎奈瑟菌)、Porphyromonas gingivalis (牙銀口卜啉單胞菌)、Providencia sturti (斯氏普羅威登斯菌)、Pseudomonas aeruginosa (綠膿假單胞菌)、Salmonella enteridis (腸炎沙門菌)、Salmonella typhi (傷寒沙門氏菌)、 Serratia marcescens (靈禾干胃)>Shigella boydii ( ^^ ; !! ) >Streptobaci 1 Ius moniliformis (念珠狀鏈桿菌)、Streptococcus pyogenes (酉良月農(nóng)鏈球菌)、Treponema pallidum(梅毒螺方寵菌)、Vibrio choIerae (霍舌L弧菌)、Yersinia enterocolitica (小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌)jerSinia pestis (鼠疫耶氏菌)等。如這里使用的，耐酸細(xì)菌包括、但不限于Myobacterium avium(鳥分枝桿菌)、 Myobacterium leprae (麻風(fēng)分支！flif )、Myobacterium tuberculosis (結(jié)核桿菌)等。在其它實施例中，“細(xì)胞”可以指沒有落到其它三類中的其它細(xì)菌，其包括、但不限于Bartonella henselae (漢賽巴爾通體)、Chlamydia psittaci (鸚鵡熱衣原體)、 Chlamydia trachomatis (沙眼衣原體)、Coxiella burnetii (貝納特氏立克次體)、 Mycoplasma pneumoniae (肺炎支原體)^Rickettsia akari (小蛛立克次氏體)^Rickettsia prowazekii (普氏立克次氏體)、Rickettsia rickettsii (立氏立克次氏)、Rickettsia tsutsugamushi (恙蟲熱立克次氏體)、Rickettsia typhi (地方性斑疹傷寒立克次氏體)、 Ureaplasma urealyticum (尿素分角軍尿素原體)、Diplococcus pneumoniae (月市炎雙球菌)、 Ehrlichia chafensis (埃Jl希體)>Enterococcus faecium(球菌)^Meningococci (ISf 膜炎球菌)等。在另一實施例中，術(shù)語“細(xì)胞”可以指真菌，真菌包括、但不限于Aspergilli (曲霉)、Candidae (念珠菌)、Candida albicans (白色念珠菌)、Coccidioidesimmitis (粗球孢子菌)、Cryptococci (隱球菌)和它們的組合。在另一實施例中，術(shù)語“細(xì)胞”可以指寄生微生物，寄生微生物包括、但不限于 Balantidium coli (結(jié)腸小袋蟲)、Cryptosporidium parvum(小球隱孢子蟲)、 Cyclospora cayatanensis (卡曼環(huán)抱子球蟲)、Encephalitozoa (腦炎微胞子蟲)、 Entamoeba histolytica(病疾內(nèi)變形蟲)、Enterocytozoon bieneusi (比氏腸胞蟲)、 Giardia Iamblia(腸蘭伯式鞭毛蟲)、Leishmaniae (熱帶利什曼蟲).Plasmodii (瘧原蟲)、 Toxoplasma gondii (弓形蟲)ΛTrypanosomae (維蟲)、trapezoidal amoeba (梯形變形蟲)寸。在另一實施例中，術(shù)語“細(xì)胞”可以指寄生蟲，寄生蟲包括蠕蟲(例如，腸蟲)，尤其是寄生蠕蟲，寄生蠕蟲包括、但不限于Nematoda (線蟲)(圓蟲，例如鞭蟲、鉤蟲、蟯蟲、蛔蟲、 絲蟲等)、Cestoda (絳蟲)(例如，帶蟲)等。

如這里使用的，“兩性離子洗滌劑”指展現(xiàn)出兩性離子性質(zhì)(例如，不具有凈電荷、電導(dǎo)率和電泳遷移率不足、不結(jié)合離子交換樹脂、破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用)的洗滌劑，該洗滌劑包括、但不限于CHAPS、CHAPSO和甜菜堿衍生物，例如優(yōu)選地為以商品名 Zwittergent (Calbiochem, San Diego, CA)禾口Anzergent (Anatrace, Inc. ；Maumee, OH) 出售的硫代甜菜堿。用于實施本發(fā)明的示例性的兩性離子洗滌劑包括以具有以下化學(xué)名稱的商品名Zwittergent 和Anzergent 出售的兩性離子洗滌劑正十四基-N，N- 二甲基-3-氨基-1-丙磺酸鹽、正辛基-N，N- 二甲基-3-氨基-1-丙磺酸鹽、正癸基-N，N- 二甲基-3-氨基-1-丙磺酸鹽和正十二基-N，N- 二甲基-3-氨基-1-丙磺酸鹽。本發(fā)明的示例性的洗滌劑可以在例如以下商品名下購得分別為Anzergent 3-14,分析級；Anzergent 3-8,分析級；Anzergent 3-10,分析級；Anzergent 3-12,分析級；或者兩性洗滌劑3-8、兩性洗滌劑3-10、兩性洗滌劑3-12和兩性洗滌劑3-14、CHAPS、 CHAPSO、ApolO 禾口 Apol2。在一個實施例中，兩性離子洗滌劑是CHAPS (CAS號75621-03_3 ；獲自于 SIGMA-ALDRICH，產(chǎn)品號C3023-1G)，其是具有以下結(jié)構(gòu)的34(3-膽汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸鹽的縮寫(在第4，372，888號美國專利中更詳細(xì)地進(jìn)行了描述)
權(quán)利要求
1.一種制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，所述方法包括以下步驟在裂解試劑中裂解細(xì)胞，所述裂解試劑包括PH為大約6至大約9的緩沖液、濃度為大約0. 125%至大約2%的兩性離子洗滌劑、濃度為大約0. 3mg/ml至大約2. 5mg/ml的疊氮化物以及蛋白酶，使所產(chǎn)生的細(xì)胞裂解物在大約孵育大約15分鐘，以產(chǎn)生基本上無蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物，使所述蛋白酶在大約95°C失活大約10分鐘，將所述無蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物直接加入到實時PCR擴增反應(yīng)混合物中，所述實時PCR 擴增反應(yīng)混合物包括一對擴增引物，能夠退火以在所述細(xì)胞裂解物中獲得目標(biāo)DNA ；包括能夠檢測的標(biāo)記的探針以及與所述目標(biāo)DNA的區(qū)域基本上互補的DNA和RNA核酸序列；擴增聚合酶活性；擴增緩沖液；RNase H活性，其中，在所述目標(biāo)DNA在第一擴增引物和第二擴增引物之間擴增之后，所述探針內(nèi)的 RNA序列能夠與所述目標(biāo)DNA中的互補的DNA序列形成RNA:DNA異源雙鏈體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述細(xì)胞裂解物的加入允許對所述細(xì)胞裂解物中的單個目標(biāo)DNA分子進(jìn)行實時PCR檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，單個目標(biāo) DNA分子的實時PCR檢測需要少于大約50個的PCR擴增循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述擴增反應(yīng)混合物還包括逆轉(zhuǎn)錄活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述探針用熒光共振能量轉(zhuǎn)移對來標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述無蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物由所述擴增反應(yīng)混合物稀釋5-15倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述細(xì)胞是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞是Listeria。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述緩沖液包括醋酸鹽或磷酸鹽緩沖液、Tris、3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸、N-(2-羥乙基)哌嗪-N' -(2-乙烷磺酸)或者2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述兩性離子洗滌劑是3- [ (3-膽汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述蛋白酶是蛋白酶K。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，擴增活性包括熱穩(wěn)定的擴增活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述RNase H活性包括熱穩(wěn)定的RNase H活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述RNaseH活性是熱啟動RNase H活性。
15.一種制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，所述方法包括以下步驟在裂解試劑中裂解細(xì)胞，所述裂解試劑包括PH為大約6至大約9的緩沖液、濃度為大約0. 125%至大約2%的兩性離子洗滌劑和濃度為大約0. 3mg/ml至大約2. 5mg/ml的疊氮化物，使細(xì)胞裂解物在大約55°C孵育大約15分鐘，將所述細(xì)胞裂解物直接加入到擴增反應(yīng)混合物中，所述擴增反應(yīng)混合物包括一對擴增引物，能夠退火以在所述細(xì)胞裂解物中獲得目標(biāo)DNA;包括能夠檢測的標(biāo)記的探針以及與所述目標(biāo)DNA的區(qū)域基本上互補的DNA和RNA核酸序列；擴增聚合酶活性；擴增緩沖液； RNase H 活性，其中，在所述目標(biāo)DNA在第一擴增引物和第二擴增引物之間擴增之后，所述探針內(nèi)的 RNA序列能夠與所述目標(biāo)DNA中的互補的DNA序列形成RNA:DNA異源雙鏈體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述擴增反應(yīng)混合物還包括逆轉(zhuǎn)錄活性。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述探針用熒光共振能量轉(zhuǎn)移對來標(biāo)記。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述細(xì)胞裂解物由所述擴增反應(yīng)混合物稀釋小于5-15倍。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述細(xì)胞裂解物的加入允許對所述細(xì)胞裂解物中的單個目標(biāo)DNA分子進(jìn)行實時PCR檢測。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，在少于大約50個的PCR擴增循環(huán)中對所述細(xì)胞裂解物中的單個目標(biāo)DNA分子進(jìn)行實時PCR檢測。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞是沙門氏菌細(xì)胞或大腸桿菌細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述緩沖液包括醋酸鹽或磷酸鹽緩沖液、Tris、3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸、N-(2-羥乙基)哌嗪-N' -(2-乙烷磺酸)或者2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇緩沖液。
24.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述兩性離子洗滌劑是3-[(3-膽汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸鹽。
25.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，擴增活性包括熱穩(wěn)定的擴增活性。
26.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述 RNase H活性包括熱穩(wěn)定的RNase H活性。
27.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備用于實時PCR擴增的核酸模板的方法，其中，所述 RNase H活性是主熱啟動RNase H活性。
28.一種裂解試劑，所述裂解試劑具有緩沖液，所述緩沖液的PH為大約6至大約9 ；兩性離子洗滌劑，所述兩性離子洗滌劑的濃度為大約0. 125%至大約2%， 疊氮化物，所述疊氮化物的濃度為大約0. 3mg/ml至大約2. 5mg/ml, 其中，向擴增反應(yīng)混合物直接加入大約兩倍稀釋的所述試劑不抑制擴增聚合酶活性和 RNase H酶活性，所述擴增反應(yīng)混合物包括一對擴增引物，能夠退火以在所述細(xì)胞裂解物中獲得目標(biāo)DNA ；包括能夠檢測的標(biāo)記的探針以及與所述目標(biāo)DNA的區(qū)域基本上互補的DNA 和RNA核酸序列；所述擴增聚合酶活性；擴增緩沖液；RNase H活性。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的裂解試劑，其中，所述緩沖液包括醋酸鹽或磷酸鹽緩沖液、Tris、3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸、N-(2-羥乙基)哌嗪-N' -(2-乙烷磺酸)或者2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇緩沖液。
30.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的裂解試劑，其中，所述兩性離子洗滌劑是3-[(3-膽汁氨丙基)二甲基氨基]-ι-丙磺酸鹽。
31.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的裂解試劑，其中，所述擴增緩沖液還包括逆轉(zhuǎn)錄活性。
32.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的裂解試劑，其中，擴增活性包括熱穩(wěn)定的擴增活性。
33.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的裂解試劑，其中，所述RNaseH活性包括熱穩(wěn)定的RNase H 活性。
34.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的裂解試劑，其中，所述RNaseH活性是熱啟動RNase H活性。
35.一種裂解試劑，所述裂解試劑具有緩沖液，所述緩沖液的PH為大約6至大約9 ；兩性離子洗滌劑，所述兩性離子洗滌劑的濃度為大約0. 125%至大約2%, 疊氮化物，所述疊氮化物的濃度為大約0. 3mg/ml至大約2. 5mg/ml, 蛋白酶，其中，在使所述蛋白酶失活之后，向擴增反應(yīng)混合物直接加入大約兩倍稀釋的所述試劑不抑制擴增聚合酶活性和RNase H酶活性，所述擴增反應(yīng)混合物包括一對擴增引物，能夠退火以在所述細(xì)胞裂解物中獲得目標(biāo)DNA;包括能夠檢測的標(biāo)記的探針以及與所述目標(biāo) DNA的區(qū)域基本上互補的DNA和RNA核酸序列；所述擴增聚合酶活性；擴增緩沖液；RNase H 活性。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的裂解試劑，其中，所述緩沖液包括醋酸鹽或磷酸鹽緩沖液、Tris、3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸、N-(2-羥乙基)哌嗪-N' -(2-乙烷磺酸)或者2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇緩沖液。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的裂解試劑，其中，所述兩性離子洗滌劑是3-[(3-膽汁氨丙基)二甲基氨基]-ι-丙磺酸鹽。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的裂解試劑，其中，所述擴增緩沖液還包括逆轉(zhuǎn)錄活性。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的裂解試劑，其中，擴增活性包括熱穩(wěn)定的擴增活性。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的裂解試劑，其中，所述RNaseH活性包括熱穩(wěn)定的RNase H 活性。
41.根據(jù)權(quán)利要求35所述的裂解試劑，其中，所述RNaseH活性是熱啟動RNase H活性。
全文摘要
本發(fā)明提出了用于高吞吐量實時PCR分析的來自細(xì)胞的核酸模板的有效制備的新的試劑配方。所述試劑允許快速的細(xì)胞裂解和模板制備，而不需要模板純化和分離。因此，所述試劑顯著地提高了實時PCR分析的吞吐量，同時在PCR擴增的少至約35個循環(huán)內(nèi)允許單分子核酸模板的快速的且靈敏的實時Catacleave PCR檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102242189SQ20111006487
公開日2011年11月16日 申請日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
發(fā)明者李俊, 詹森·歐普迪克 申請人:三星泰科威株式會社