專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及其抗菌蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥領(lǐng)域，特別涉及一種抗植物病原真菌的枯草芽孢桿菌及其抗菌蛋白。
背景技術(shù)：
植物病害一直是農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的重要制約因素之一，據(jù)估計(jì)，全球主要農(nóng)作物的平均損失約占總產(chǎn)量的10 15%，每年直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)千億美元。在植物病害中， 70 80%的病害是病原真菌侵染導(dǎo)致的。植物病原菌不僅直接造成農(nóng)作物產(chǎn)量下降，部分病原真菌在侵染農(nóng)作物過程中，還會(huì)分泌產(chǎn)生多種對(duì)人畜有害的毒素與代謝產(chǎn)物，對(duì)農(nóng)作物的安全性構(gòu)成極大威脅。農(nóng)作物真菌病害的控制往往依賴化學(xué)防治。然而，化學(xué)有機(jī)農(nóng)藥的使用不僅生產(chǎn)成本高，而且會(huì)帶來環(huán)境污染、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留以及各種疾病等問題。微生物農(nóng)藥是指微生物及其代謝產(chǎn)物加工而成的具有殺蟲、殺菌、除草、殺鼠或調(diào)解植物生長活性的物質(zhì)，其具有不危害人畜、無土壤殘留、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，可代替化學(xué)農(nóng)藥用于防治植物病害。此前，已有使用微生物拮抗植物病原真菌的報(bào)道李炳學(xué)等，“以綜合能力為標(biāo)準(zhǔn)篩選草莓灰霉病生防細(xì)菌”，微生物學(xué)雜志，2005年，第25卷第4期公開了平板對(duì)峙法檢測(cè)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Bl、B17、B18 對(duì)草莓灰葡萄孢(Botrytis cinerea) 的抑菌實(shí)驗(yàn)，在牛肉膏蛋白胨與PDA混合培養(yǎng)基上，將枯草芽孢桿菌菌苔接種于距離培養(yǎng)皿邊Icm的正三角形的3個(gè)角上，取灰霉病的孢子點(diǎn)在中心，置21 23°C下培養(yǎng)觀察， 7天后測(cè)量三種菌的平板對(duì)峙抑菌距離分別為6. 6,7. 0和6. 7mm,結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)Bl、B17、B18的抑菌效果不顯著；趙妍等，“枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BlO對(duì)采后草莓果實(shí)病害的抑制效果”，果樹學(xué)報(bào)，2007年，第M卷第3期等公開了平板打孔法檢測(cè)枯草芽孢桿菌BlO及其發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢的抑制實(shí)驗(yàn)，取1 X IO4個(gè)/mL 的灰霉孢子懸浮液0. lmL，涂布于PDA平板上，在平板的中心打直徑為8mm的孔，分別注入 0. ImL枯草芽孢桿菌BlO的活菌液、菌懸液、熱處理液和過濾液，分別在15°C或25°C下培養(yǎng) 7d后測(cè)定抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌BlO的活菌液在25°C下的抑菌活性最高，其抑菌圈為18. 8mm，然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知地，平板打孔法檢測(cè)到的拮抗菌的抑菌圈直徑顯著大于平板對(duì)峙法檢測(cè)到的拮抗菌的抑菌圈直徑，枯草芽孢桿菌BlO的抑菌效果也不顯著。綜上，現(xiàn)有的抗菌微生物的抑菌效果均不顯著，因此，尋找抑菌效果更好的微生物從而得到新的微生物農(nóng)藥是一個(gè)亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的拮抗植物病原真菌的微生物。本發(fā)明提供了一種新的枯草芽孢桿菌菌株(Bacillus subtilis)，命名為Loql8，并將其保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011017。本發(fā)明還提供了一種抗植物病原真菌的蛋白質(zhì)，命名為LP18，它是由上述枯草芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的。前述蛋白質(zhì)是多亞基蛋白，且亞基分子量為4283. 7Da ；由如下14種氨基酸組成 Leu、Glu、Asp、Thr, Ser, Gly、Cys, Val、Met、lie、Tyr, Phe, His、Pro ；不含脂質(zhì)和糖基。前述蛋白質(zhì)在溫度彡140°C和1彡P(guān)H彡13的條件下具有抗菌活性；經(jīng)過堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶處理，和/或紫外照射，和/或有機(jī)溶劑處理后仍具有抗菌活性。該蛋白質(zhì)在pH = 6. 8時(shí)抗菌活性最高，且在5彡pH彡6. 8的抗菌活性為蛋白質(zhì)在pH = 6. 8的抗菌活性的98. 89 100%。前述蛋白質(zhì)是由如下方法制備得到a，取保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011017的枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵，制備得到發(fā)酵液；b，將步驟a得到的發(fā)酵液離心分離純化，即得到目的蛋白。前述植物病原真菌為灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。本發(fā)明還提供了一種制備上述蛋白質(zhì)的方法，其包含如下步驟a，取保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011017的枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵，制備得到發(fā)酵液；b，將步驟a得到的發(fā)酵液分離純化，即得到目的蛋白。本發(fā)明又提供了上述枯草芽孢桿菌菌株或者上述蛋白質(zhì)在制備防治植物病原真菌的農(nóng)藥中的用途。本發(fā)明又提供了一種防治植物病原真菌的農(nóng)藥，該農(nóng)藥的主要成分為上述枯草芽孢桿菌菌株或者上述蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌LoqlS的抑菌效果顯著，其產(chǎn)生的抗菌蛋白的性質(zhì)穩(wěn)定，具有熱穩(wěn)定性、PH穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，可用于制備防治植物病原真菌的農(nóng)藥。


圖1枯草芽孢桿菌LoqlS培養(yǎng)時(shí)間和抗菌活性的關(guān)系圖，橫坐標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間，單位為小時(shí)，縱坐標(biāo)為抑菌圈直徑，單位為毫米圖2枯草芽孢桿菌LoqlS發(fā)酵產(chǎn)物毒力方程3硫酸銨沉淀的枯草芽孢桿菌Loq 18發(fā)酵粗提物上kphadex G_75層析柱的活性峰圖4DEAE Fast Flow離子交換層析圖譜圖5Sephadex G-25脫鹽層析圖譜圖6抗菌蛋白LP18的MALDI-TOF-TOF-MS分析圖譜
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器實(shí)驗(yàn)菌株灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，可致草莓灰霉病，購買于中國農(nóng)業(yè)微生物保藏中心，保藏編號(hào)為ACCC36415 ；小麥赤霉病菌(Gibberella zeae)、禾谷類鐮刀菌 (Fusarium graminearum)、玉米彎抱菌(Curvularia lunata)、7jC禾S禾S癌病菌(Magnaporthe grisea)和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)由本實(shí)驗(yàn)室保存。培養(yǎng)基NA培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基。儀器THZ-98A恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海恒科儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)， Beckman公司；Wizard2. O冷凍干燥機(jī)，天美科學(xué)儀器有限公司；LRH-250S恒溫恒濕培養(yǎng)箱， 廣東省醫(yī)療設(shè)備廠。實(shí)施例一枯草芽孢桿菌的分離鑒定1、菌株分離從四川省成都市龍泉驛區(qū)的農(nóng)田土壤中采集樣品，制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 (NA)，稀釋涂布法與挑單菌落平板劃線法進(jìn)行菌株的純化培養(yǎng)并保存。制備馬鈴薯培養(yǎng)基 (PDA)，采用對(duì)峙法進(jìn)行拮抗菌的篩選，即平板中央接種直徑為6mm指示菌菌絲塊，等距離點(diǎn)接種分離得到的菌株于指示菌菌落前3cm處，恒溫培養(yǎng)3天，測(cè)量并計(jì)算抑菌圈的直徑。獲得一株對(duì)灰葡萄孢、水稻稻瘟病菌、玉米彎孢菌、小麥赤霉病菌和禾谷類鐮刀菌、立枯絲核菌均有較強(qiáng)抑菌活性的菌株，命名為Loql8，其抗菌活性如表1所示表1菌株LoqlS對(duì)供試植物病原菌的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，其特征在于它是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011017的菌株。
2.一種抗植物病原真菌的蛋白質(zhì)，其特征在于它是由權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述的蛋白質(zhì) 是多亞基蛋白，且亞基分子量為似83. 7Da ；由如下 14 種氨基酸組成Leu、Glu、Asp、Thr, Ser, Gly、Cys, Val、Met、lie、Tyr, Phe, His、Pro ；不含脂質(zhì)和糖基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述的蛋白質(zhì) 在溫度彡140°C和1彡pH彡13的條件下具有抗菌活性；經(jīng)過堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶處理，和/或紫外照射，和/或有機(jī)溶劑處理后仍具有抗菌活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述的蛋白質(zhì)在pH= 6. 8時(shí)抗菌活性最高，且在5彡pH彡6. 8的抗菌活性為蛋白質(zhì)在pH = 6. 8的抗菌活性的98. 89 100%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于其由如下方法制備得到a，取保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011017的枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵，制備得到發(fā)酵液； b，將步驟a得到的發(fā)酵液分離純化，即得到目的蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述的植物病原真菌為灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)0
8.一種制備權(quán)利要求2 7任意一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包含如下步驟a，取保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011017的枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵，制備得到發(fā)酵液； b，將步驟a得到的發(fā)酵液分離純化，即得到目的蛋白。
9.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株或者權(quán)利要求2 7任意一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)在制備防治植物病原真菌的農(nóng)藥中的用途。
10.一種防治植物病原真菌的農(nóng)藥，其特征在于所述農(nóng)藥的主要成分為權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株或者權(quán)利要求2 7所述的蛋白質(zhì)。
全文摘要
一種枯草芽孢桿菌及其抗菌蛋白，本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥領(lǐng)域，特別涉及一種抗植物病原真菌的枯草芽孢桿菌及其抗菌蛋白。本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，它是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號(hào)為CCTCC NOM 2011017的菌株。還提供了該枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的抗植物病原真菌的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌的抑菌效果顯著，其產(chǎn)生的抗菌蛋白性質(zhì)非常穩(wěn)定，具有很寬的溫度適應(yīng)范圍、耐酸堿、紫外穩(wěn)定性，以及對(duì)有機(jī)溶劑和蛋白酶耐受等優(yōu)點(diǎn)，能夠適應(yīng)多種自然條件，可用于制備防治植物病原真菌的農(nóng)藥，具有極好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102191194SQ20111006462
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者劉剛, 張宏, 張曉喻, 黃春萍 申請(qǐng)人:四川師范大學(xué)