專利名稱：改良的雞白介素2蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是改良的雞白介素2蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
1976年Morgan等發(fā)現(xiàn)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有一種刺激胸腺細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，由于這種因子能促進(jìn)和維持τ細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)，稱為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T cell growthfactor, TCGF)，1979 年統(tǒng)一命名為白介素 2 (interleukin 2，IL-2)。白細(xì)胞介素2主要是由T淋巴細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生的一類最有力的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，屬于Thl型細(xì)胞因子，在抗腫瘤、抗毒素、免疫調(diào)節(jié)及感染性疾病的治療中具有重要作用，它能夠有效地提高免疫功能，促進(jìn)τ、B淋巴細(xì)胞的增殖、分化并可增強(qiáng)NK細(xì)胞、單核細(xì)胞等的殺傷活性，也可促進(jìn)其他細(xì)胞因子的分泌以及刺激T細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)。在免疫應(yīng)答系統(tǒng)中起著極其重要的調(diào)節(jié)作用，是一種天然的免疫增強(qiáng)佐劑和治療劑。自1983年人類IL-2基因被首次克隆和測(cè)序以來，目前已有幾十個(gè)物種的IL-2基因被發(fā)現(xiàn)。雞白介素的研究相對(duì)于其它哺乳動(dòng)物來說比較滯后，是由Simdick等1997年首次克隆了雞IL-2 的基因，目前已實(shí)現(xiàn)了雞IL-2基因在大腸桿菌、C0S、CH0-K和人腎成纖維細(xì)胞中成功表達(dá)， 且表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性，為基因工程重組白介素的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用提供了依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供改良的雞白介素2(ChIL_2/A)蛋白。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供所述改良的雞白介素2(ChIL_2/A)蛋白的制備方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是改良的雞白介素2(命名為ChIL-2/A)蛋白，為天然的雞白介素2 (命名為ChIL_2/ N)蛋白的改良蛋白，該蛋白具有ChIL-2/N蛋白的生物活性，其氨基酸序列為序列表中 <400>3所示的序列，由121個(gè)氨基酸殘基組成。優(yōu)選的，上述改良的雞白介素2(ChIL_2/A)蛋白經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有ChIL-2/N蛋白活性的ChIL-2/A蛋白的衍生蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，上述改良的雞白介素2 (ChIL-2/A)蛋白，為了使雞白介素2 (ChIL-2/A) 蛋白或其衍生蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中，可在所述蛋白質(zhì)的N端連接上信號(hào)肽序列。優(yōu)選的，上述改良的雞白介素2(ChIL-2/A)蛋白，為了使雞白介素2 (ChIL_2/A)蛋白或其衍生蛋白質(zhì)便于純化，可在氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表 1所示的標(biāo)簽。表1 標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.改良的雞白介素2蛋白，其特征在于其氨基酸序列為序列表中<400>3所示的序列，由121個(gè)氨基酸殘基組成，該蛋白具有天然的雞白介素2蛋白的生物活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良的雞白介素2蛋白經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加且具有天然的雞白介素2蛋白活性的由ChIL-2/A蛋白的衍生蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的改良的雞白介素2蛋白，其特征在于為了使該改良的雞白介素2蛋白或其衍生蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中，可在所述蛋白質(zhì)的N端連接上信號(hào)肽序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的改良的雞白介素2蛋白，其特征在于為了使該改良的雞白介素2蛋白或其衍生蛋白質(zhì)便于純化，可在氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上標(biāo)簽，所述標(biāo)簽為 Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II 或 c_myc。
5.一種編碼權(quán)利要求1所述改良的雞白介素2蛋白的優(yōu)化基因，其特征在于所述優(yōu)化基因的核苷酸序列為序列表中<400>1所示的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的改良的雞白介素2蛋白的優(yōu)化基因，其特征在于是在嚴(yán)格條件下雜交且編碼改良的雞白介素2蛋白的核酸序列，所述嚴(yán)格條件為在0. 1 X SSPE或 0. IXSSC以及0. S DS的溶液中，在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。
7.含有權(quán)利要求5所述改良的雞白介素2蛋白的優(yōu)化基因的重組表達(dá)載體和重組表達(dá)細(xì)胞。
8.—種權(quán)利要求1所述改良的雞白介素2蛋白的制備方法，其特征在于將所述蛋白的優(yōu)化基因插入到表達(dá)載體中，得到含有該蛋白優(yōu)化基因的重組表達(dá)載體，然后將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，篩選得到含有重組表達(dá)載體的陽性重組細(xì)胞，發(fā)酵培養(yǎng)該重組細(xì)胞，表達(dá)得到所述蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述改良的雞白介素2蛋白的制備方法，其特征在于所述表達(dá)載體為pBV220、pET載體、pQE載體或pPIC9K，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌DH5 α、TBl或 BL21(DE3)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述改良的雞白介素2蛋白的制備方法，其特征在于所述表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)物為異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，誘導(dǎo)濃度為lmmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為3-5小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明提供的改良的雞白介素2(命名為ChIL-2/A)蛋白，為天然的雞白介素2(命名為ChIL-2/N)蛋白的改良蛋白，該ChIL-2/A蛋白具有ChIL-2/N蛋白的生物活性，其氨基酸序列為序列表中3所示的序列，由121個(gè)氨基酸殘基組成；所述改良的ChIL-2/A蛋白與ChIL-2/N蛋白相比，其穩(wěn)定性大大增加，且活性有明顯增強(qiáng)；該改良蛋白在大腸桿菌中以包涵體的形式高效表達(dá)，表達(dá)后重組蛋白占菌體總蛋白的50％以上，復(fù)性回收率達(dá)70％以上，且生產(chǎn)周期短，成本低，為該雞白介素2的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用提供了良好的研究基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102180959SQ201110065038
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者張樹偉, 范文輝, 陳業(yè)金, 馬彥娜 申請(qǐng)人:天津康萊森生物科技集團(tuán)有限公司