專利名稱：一種以微生物發(fā)酵制備三氯蔗糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬三氯蔗糖的制備領(lǐng)域，特別是涉及一種以微生物發(fā)酵制備三氯蔗糖的方
法。 嗎
背景技術(shù)：
目前全球生產(chǎn)三氯蔗糖的是美國強生公司，其規(guī)模達(dá)到千噸左右。由于受專利保護(hù)限制，其他國家都沒有相應(yīng)的大規(guī)模生產(chǎn)。相比，雖然我國研究三氯蔗糖單位較多，發(fā)表文章也不少，而真正實施生產(chǎn)單位較少，以往某單位在生產(chǎn)三氯蔗糖產(chǎn)品過程中，美國強生公司以專利侵權(quán)為由，要求其停產(chǎn)，這不僅限制了我國三氯蔗糖生產(chǎn)工藝的發(fā)展，且在工業(yè)和經(jīng)濟上的滯留所帶來的損失也是無法預(yù)計的。傳統(tǒng)三氯蔗糖生產(chǎn)方法主要有以下三種(1)醚化法利用三苯基氯甲烷與蔗糖中羥基反應(yīng)成醚來保護(hù)三個伯羥基，然后通過脫保護(hù)基、氯化、脫乙?；确磻?yīng)，合成三氯蔗糖?？偸章蕿?4 15%。缺點是步驟較多，原料三苯基氯甲烷價格較貴，生產(chǎn)成本較高； (2)酯化法用原乙酸三甲酯與蔗糖中4. 6位的二個羥基形成一個環(huán)狀化合物，環(huán)狀化合物在水分子攻擊下開環(huán)得到4-乙酰基蔗糖和6-乙?；崽堑幕旌衔?。在有機堿(特丁胺) 作用下，乙酰基發(fā)生遷移，大部分4-乙酰基蔗糖可轉(zhuǎn)化為6-乙?；崽?，再經(jīng)過氯化、乙?；⒚撘阴；炔襟E制得三氯蔗糖。也有報導(dǎo)不經(jīng)過全乙酰化步驟可以減少原料，簡化工藝。本路線是美國強生公司要求停止生產(chǎn)的生產(chǎn)工藝。該工藝的缺點是要求高真空和極低溫度，總收率不高約30 40%，投資大；(3)酶化法先用一種生物方法得到6-乙?；咸烟?，將6-乙?；咸烟桥c蔗糖粉混合溶于緩沖溶液在β -果糖轉(zhuǎn)化酶作用下，可以50%的產(chǎn)率得到6-乙?；崽?，后者再通過氯化、去乙?；炔襟E得到三氯蔗糖，總收率為17% 左右。酶化法反應(yīng)步驟多，發(fā)酶成本高，中間體提純難度高，工業(yè)化生產(chǎn)成本高。因此，到目前為止，關(guān)于利用微生物降解生產(chǎn)三氯蔗糖的工藝，至今還未見相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種以微生物發(fā)酵制備三氯蔗糖的方法，該制備工藝簡單，操作平穩(wěn)，收率高；反應(yīng)均為通用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備，投資少；每步溶劑和附料可以回收，不僅成本降低而且對環(huán)境友好。本發(fā)明的一種以微生物發(fā)酵制備三氯蔗糖的方法，包括(1)在10_15襯％的水蘇糖溶液中加入為溶液的l_5wt%酵母菌(市售)，于32 34°C發(fā)酵5 10h，離心除菌，取上清液經(jīng)硅膠層析分離得甘露三糖；(2)將甘露三糖與吡啶按摩爾比1 5 15混合溶解，滴加氯化亞砜，然后升溫到10(TC，保溫3-15min，冷卻后蒸除溶劑，分離得二氯甘露三糖；其中，甘露三糖與氯化亞砜的摩爾比為1 5-15;(3)將大腸桿菌K12菌株(市售)先進(jìn)行紫外及亞硝酸復(fù)合誘變，然后按1-10%接種量接種到M9培養(yǎng)基，并加入為培養(yǎng)基總體積百分比1 3%的二氯甘露三糖，于37°C 篩選培養(yǎng)24-48h，選取生長良好的菌種，然后接種到液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴大培養(yǎng)，37°C培養(yǎng) 24-48h，得擴大培養(yǎng)后的菌種；(4)將水蘇糖與吡啶按摩爾比1 5 10混合，于-5 0°C滴加氯化亞砜，然后升溫至100 110°C保溫4 6min，冷卻分離得四氯水蘇糖；其中，水蘇糖與氯化亞砜的摩爾比為1 6 8 ；(5)最后在M9發(fā)酵培養(yǎng)基中加入四氯水蘇糖，并按1-10%的接種量接入步驟(3) 所得擴大培養(yǎng)后的菌種，于36 37°C，通氣攪拌5-25分鐘，離心除菌種后超濾除蛋白，濃縮
結(jié)晶得三氯蔗糖。

所述步驟(3)中的M9培養(yǎng)基為磷酸氫二鉀30g/L，磷酸二氫鉀10_50g/L，氯化銨 50g/L，水 IL0所述步驟(3)中的液體培養(yǎng)基為上述的M9培養(yǎng)基+碳源1-5% wt棉子糖或水蘇糖。所述步驟(5)中的四氯水蘇糖的加入量為培養(yǎng)基2 10wt%。所述步驟(5)中的M9發(fā)酵培養(yǎng)基為磷酸氫二鉀30g/L，磷酸二氫鉀10_50g/L，氯化銨50g/L，水1L。本發(fā)明以水蘇糖為起始原料，經(jīng)過一步選擇氯化得到四氯水蘇糖，然后加入誘變后的能選擇性降解半紅糖基部分的微生物進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液直接純化制得三氯蔗糖。本方法所使用的微生物誘導(dǎo)物為二氯甘露三糖，以該化合物為唯一碳源進(jìn)行微生物培養(yǎng)，結(jié)合常規(guī)誘導(dǎo)方法得到高效降解四氯水蘇糖的微生物，同時篩選所用的二氯甘露三糖也可以部分純化產(chǎn)品。有益效果(1)本發(fā)明的制備工藝簡單，操作平穩(wěn)，收率高；反應(yīng)均為通用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備，投資少； 每步溶劑和附料可以回收，不僅成本降低而且對環(huán)境友好；(2)該方法所用的二氯甘露三糖，采用傳統(tǒng)氯化工藝在吡啶溶劑中用氯化亞砜于低溫時選擇性氯化，除去溶劑后不必分離純化可直接利用。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1(1)在Imol水蘇糖水溶液IL中加入60g酵母菌，于32°C發(fā)酵10h，離心除菌，取上清液經(jīng)硅膠層析分離得約0. 7mol甘露三糖；(2)取Imol甘露三糖，加入5mol吡啶混合溶解，滴加5mol mol氯化亞砜，然后升溫到100°C，保溫3min，冷卻后蒸除溶劑，分離得二氯甘露三糖；(3)將大腸桿菌K12菌株先進(jìn)行紫外及亞硝酸復(fù)合誘變，然后按接種量接種到 M9培養(yǎng)基，并加入為培養(yǎng)基總體積比的二氯甘露三糖，于37°C篩選培養(yǎng)24h，選取生長良好的菌種，然后接種到液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴大培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)24h ；(4)取1mol水蘇糖，加入1Omol吡啶混合，于0°C滴加6mol氯化亞砜，然后升溫至 110°c保溫4min，冷卻分離得約0. 7mol四氯水蘇糖；(5)最后在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入為培養(yǎng)基總體積比2%四氯水蘇糖，并按的接種量接入擴大培養(yǎng)后的菌種，于36°C，通氣攪拌25分鐘，離心除菌種后超濾除蛋白，濃縮結(jié)晶得三氯蔗糖。實施例2(1)在1mol水蘇糖水溶液IL中加入IOOg酵母菌，于33°C發(fā)酵6h，離心除菌，取上清液經(jīng)硅膠層析分離得約0. 7mol甘露三糖；(2)取1mol甘露三糖，加入12mol吡啶混合溶解，滴加6mol氯化亞砜，然后升溫到 100°C，保溫lOmin，冷卻后蒸除溶劑，分離得二氯甘露三糖；(3)將大腸桿菌K12菌株先進(jìn)行紫外及亞硝酸復(fù)合誘變，然后6%接種量接種到M9 培養(yǎng)基，并加入為培養(yǎng)基總體積比2%的二氯甘露三糖，于37°C篩選培養(yǎng)36h，選取生長良好的菌種，然后接種到液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴大培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)36h ；(4)取Imol水蘇糖，加入13mol吡啶混合，于0°C滴加7mol氯化亞砜，然后升溫至 100 110°C保溫5min，冷卻分離得約0. 7mol四氯水蘇糖；(5)最后在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入為培養(yǎng)基總體積比5%四氯水蘇糖，并按6%的接種量接入擴大培養(yǎng)后的菌種，于37°C，通氣攪拌10分鐘，離心除菌種后超濾除蛋白，濃縮結(jié)晶得三氯蔗糖。實施例3(1)在1mol水蘇糖水溶液IL中加入150g酵母菌，于34°C發(fā)酵5h，離心除菌，取上清液經(jīng)硅膠層析分離得約0. 6mol甘露三糖；(2)取1mol甘露三糖，加入15mol吡啶混合溶解，滴加15mol氯化亞砜，然后升溫到100°C，保溫15min，冷卻后蒸除溶劑，分離得二氯甘露三糖；(3)將大腸桿菌K12菌株先進(jìn)行紫外及亞硝酸復(fù)合誘變，然后10%接種量接種到 M9培養(yǎng)基，并加入為培養(yǎng)基總體積比3%的二氯甘露三糖，于37°C篩選培養(yǎng)48h，選取生長良好的菌種，然后接種到液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴大培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)48h ；(4)取Imol水蘇糖，加入5mol吡啶混合，于0°C滴加8mol氯化亞砜，然后升溫至 100 110°C保溫4 6min，冷卻分離得約0. 68mol四氯水蘇糖；(5)最后在M9發(fā)酵培養(yǎng)基中加入為培養(yǎng)基總體積比10%四氯水蘇糖，并按10%的接種量接入擴大培養(yǎng)后的菌種，于37°C，通氣攪拌5分鐘，離心除菌種后超濾除蛋白，濃縮
結(jié)晶得三氯蔗糖。
權(quán)利要求
1.一種以微生物發(fā)酵制備三氯蔗糖的方法，包括(1)在10_15wt%的水蘇糖溶液中加入為溶液的l_5wt %酵母菌 (Sac-charomycescerevisiae)，于32 34°C發(fā)酵5 10h，離心除菌，取上清液經(jīng)硅膠層析分離得甘露三糖；(2)將甘露三糖與吡啶按摩爾比1 5 15混合溶解，滴加氯化亞砜，然后升溫到 100°C，保溫3-15min，冷卻后蒸除溶劑，分離得二氯甘露三糖；其中，甘露三糖與氯化亞砜的摩爾比為1 5-15;(3)將大腸桿菌K12菌株(Escherichiacoli K12)先進(jìn)行紫外及亞硝酸復(fù)合誘變，然后按1-10%接種量接種到M9培養(yǎng)基，并加入為培養(yǎng)基總體積百分比1 3%的二氯甘露三糖，于37°C篩選培養(yǎng)M-4 !，選取生長良好的菌種，然后接種到液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴大培養(yǎng)， 37°C培養(yǎng)M-4 !，得擴大培養(yǎng)后的菌種；(4)將水蘇糖與吡啶按摩爾比1 5 10混合，于-5 0°C滴加氯化亞砜，然后升溫至100 110°C保溫4 6min，冷卻分離得四氯水蘇糖；其中，水蘇糖與氯化亞砜的摩爾比為1 6 8 ；(5)最后在M9發(fā)酵培養(yǎng)基中加入四氯水蘇糖，并按1-10%的接種量接入步驟(3)所得擴大培養(yǎng)后的菌種，于36 37°C，通氣攪拌5-25分鐘，離心除菌種后超濾除蛋白，濃縮結(jié)晶得三氯蔗糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以微生物發(fā)酵制備三氯蔗糖的方法，其特征在于所述步驟(3)中的M9培養(yǎng)基為磷酸氫二鉀30g/L，磷酸二氫鉀10-50g/L，氯化銨50g/L，水1L。
3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以微生物發(fā)酵制備三氯蔗糖的方法，其特征在于所述步驟(3)中的液體培養(yǎng)基為M9培養(yǎng)基+碳源1-5% wt棉子糖或水蘇糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以微生物發(fā)酵制備三氯蔗糖的方法，其特征在于所述步驟(5)中的四氯水蘇糖的加入量為培養(yǎng)基3 10wt%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以微生物發(fā)酵制備三氯蔗糖的方法，其特征在于所述步驟(5)中的M9發(fā)酵培養(yǎng)基為磷酸氫二鉀30g/L，磷酸二氫鉀10-50g/L，氯化銨50g/L，水 1L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以微生物發(fā)酵制備三氯蔗糖的方法，包括在水蘇糖中加入酵母菌，發(fā)酵培養(yǎng)后離心分離得甘露三糖；然后加入吡啶和氯化亞砜，經(jīng)加熱冷卻，分離得二氯甘露三糖；以二氯甘露三糖作為唯一碳源進(jìn)行大腸桿菌的篩選培養(yǎng)，篩選出優(yōu)良菌株后再進(jìn)行擴大培養(yǎng)；然后將預(yù)先制備好的四氯水蘇糖加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接入擴大培養(yǎng)的菌株，于36～37℃，通氣攪拌5-25分鐘，離心除菌種后超濾除蛋白，濃縮結(jié)晶得三氯蔗糖。該制備工藝簡單，操作平穩(wěn)，收率高；反應(yīng)均為通用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備，投資少；每步溶劑和附料可以回收，不僅成本降低而且對環(huán)境友好。
文檔編號C12P19/12GK102154409SQ20111006467
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者施立欽, 邱從平 申請人:寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院