專利名稱：用玉米秸稈纖維作載體制備固定化酵母細(xì)胞并用于餐廚廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域細(xì)胞固定化和液態(tài)發(fā)酵的應(yīng)用技術(shù)，具體涉及到一種經(jīng)纖維素酶修飾后的玉米秸稈作為載體制備固定化細(xì)胞，并用該固定化細(xì)胞發(fā)酵餐廚廢棄物生產(chǎn)燃料乙醇的方法。
背景技術(shù)：
餐廚廢棄物是指家庭、學(xué)校、機(jī)關(guān)、公共食堂以及餐飲行業(yè)的食物廢料和餐飲剩余物，是城市生活垃圾的重要組成部分。我國廚廚廢棄物產(chǎn)生量十分巨大，且隨著城市規(guī)模的迅速擴(kuò)大、城市人口的增多和人民生活水平的提高，餐廚廢棄物的產(chǎn)生量有越來越多的趨勢。盡管餐廚廢棄物的組成、性質(zhì)和產(chǎn)生量因社會經(jīng)濟(jì)條件、地區(qū)差異、居民生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)、季節(jié)變化的不同而有所差異，但從化學(xué)組成上，餐廚廢棄物中含有淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、脂類和無機(jī)鹽。其主要特點(diǎn)有①淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)等有機(jī)物含量較高，開發(fā)利用價值較大，但有可能為各種病源微生物及各種攜帶病源微生物的蠅蟲提供良好的生長繁殖環(huán)境，導(dǎo)致疾病的傳播并產(chǎn)生惡臭；②含水率高，不便收集運(yùn)輸，熱值低，處理不當(dāng)容易產(chǎn)生滲浙液等二次污染物；③脂類和鹽類物質(zhì)含量較其它垃圾高，對資源化產(chǎn)品品質(zhì)影響較大，需要妥善處理。因此，餐廚廢棄物具有典型的“廢物和資源”雙重屬性，如果不能合理利用或處置，則是一種對環(huán)境和人體健康等有巨大潛在危險(xiǎn)的廢物，但是如果能夠合理處置和利用， 它又是一種具有較高使用價值的資源。過去很長時間內(nèi)，由于無序回收和管理缺失，不少餐廚垃圾被作為飼料直接喂養(yǎng)生豬。生豬一旦食用了未經(jīng)處理或處理不當(dāng)?shù)牟蛷N廢棄物，就極易引起疾病，一些病原體、 有毒物質(zhì)將會積蓄在豬的體內(nèi)。除此之外，為了減少豬的發(fā)病率，養(yǎng)殖戶還會加大對病豬的用藥劑量，造成大量抗生素類藥物在豬體內(nèi)的殘留。再者，這種方式很容易將人群中的疫病通過餐廚廢棄物傳染給畜禽，而且還可能通過禽畜體內(nèi)毒素、有害物質(zhì)積累的食物鏈再給人體健康帶來危害，由此造成人畜之間疫病的交叉感染。目前，國內(nèi)許多大城市相繼做出了 “禁止用餐廚廢棄物喂豬”規(guī)定。隨著國際原油價格的不斷攀升，生物質(zhì)能源的研究越來越受到人們的重視.在眾多的生物質(zhì)能源中，燃料酒精由于其生產(chǎn)工藝簡單，可生產(chǎn)乙醇汽油，向環(huán)境凈排放的溫室氣體為零等優(yōu)點(diǎn)，得到了美國、巴西等國家的青睞，，我國也在“十一五”規(guī)劃中提出了大力發(fā)展燃料酒精的目標(biāo)。當(dāng)前我國的酒精生產(chǎn)主要以玉米、稻谷、小麥等糧食作物為原料，從資源有效利用和降低生產(chǎn)成本方面考慮，利用含豐富淀粉及纖維素類的廢棄物作為原料無疑更具有優(yōu)勢。利用餐廚廢棄物進(jìn)行生物燃料的生產(chǎn)，具有資源二次利用和降低成本的雙重優(yōu)勢，并能改變餐廚廢棄物生產(chǎn)畜禽飼料或飼料添加劑的傳統(tǒng)路線，避免餐廚廢棄物再次進(jìn)入食物鏈，從根本上解決地溝油、泔水豬對食品安全的潛在威脅。中國專利 CN101255447A報(bào)道了一種將餐廚垃圾進(jìn)行打漿，蒸汽、微波協(xié)同滅菌處理，接種經(jīng)選育過的酒精高產(chǎn)酵母生產(chǎn)乙醇。但是該發(fā)明沒有添加任何水解酶類，很難將餐廚垃圾中的各種營養(yǎng)物質(zhì)充分利用。中國專利CN101139577A報(bào)道了利用酒槽混合液發(fā)酵產(chǎn)糖化酶及利用此糖化酶發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)乙醇的方法。該法首先將酒槽槽液和固態(tài)酒槽的混合物進(jìn)行高溫滅菌，然后接入黑曲霉搖瓶發(fā)酵，得到的發(fā)酵液為糖化酶液。再向粉碎后的餐廚垃圾中加入適量糖化酶液進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解結(jié)束后，接入酒精酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。然而該發(fā)明采用的糖化酶液是黑曲霉的直接發(fā)酵液，糖化酶液中含有較多的黑曲霉孢子，孢子易對餐廚垃圾水解后的固、液相產(chǎn)生污染，另外，孢子萌發(fā)后會對乙醇發(fā)酵產(chǎn)生不利因素。細(xì)胞固定化技術(shù)，是利用物理或化學(xué)手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域并使其保持活性和可以反復(fù)使用的一種基礎(chǔ)技術(shù)。同傳統(tǒng)的游離細(xì)胞發(fā)酵相比，細(xì)胞固定化可以提高次生物質(zhì)的合成和積累，能長時間保持細(xì)胞活力，可以反復(fù)利用，抗剪切能力強(qiáng)，簡化工藝設(shè)備，成本低，優(yōu)化了工藝流程。固定化酵母細(xì)胞的常用載體是海藻酸鈉和聚乙烯醇。其中海藻酸鈉因具有制備方法簡單、條件溫和、無毒、不被絕大多數(shù)微生物分解、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)成為廣泛使用的載體材料。但海藻酸鈣凝膠在含較多的檸檬酸鹽、EDTA、Ca2+、K+、 Na+溶液中不穩(wěn)定，鈣離子易脫落導(dǎo)致凝膠變軟并逐漸溶解。由于餐廚廢棄物成分復(fù)雜，尤其含有較高濃度的Na+，選用海藻酸鈉不適宜。聚乙烯醇微粒的機(jī)械強(qiáng)度高，但是其聚合物網(wǎng)絡(luò)的形成條件比較劇烈，對微生物細(xì)胞的損害很大，也限制了它的應(yīng)用。近年來，天然生物質(zhì)類纖維材料受到國外研究人員的關(guān)注，天然纖維材料因具有機(jī)械強(qiáng)度高、分批發(fā)酵批次高、無毒、通透性好及纖維組織中的空隙適于細(xì)胞生長繁殖的優(yōu)點(diǎn)，而具有很強(qiáng)的研究價值。國外相繼報(bào)道了利用天然纖維素類物質(zhì)如甘蔗莖、制糖后的甘蔗殘?jiān)茸鳛榻湍讣?xì)胞固定化材料(Chandel AK et al. . Useof Saccharum spontaneum as biomaterial for cell immobilization andmodulated ethanol production by thermotolerant Saccharomyces cerevisiaeVS3. Bioresour Technol 2009;100:2404-2410)。但尚無利用玉米禾吉稈固定化酵母細(xì)胞用于乙醇發(fā)酵的相關(guān)報(bào)道。干玉米秸稈纖維組織中含有大量柄細(xì)胞(死亡細(xì)胞)， 這些柄細(xì)胞在組織中呈現(xiàn)大量“空洞”，造成干秸稈纖維呈多孔狀。微生物細(xì)胞可以嵌入植物纖維空隙，并能在空隙中生長繁殖。此外，細(xì)胞表面與纖維素表面存在的靜電引力使得利用玉米秸稈纖維固定化細(xì)胞成為可能。本發(fā)明以玉米秸稈為載體制備固定化酵母細(xì)胞，再利用復(fù)合酶制劑對餐廚廢棄物中生物質(zhì)廢棄物進(jìn)行酶解。酶解液通過固液分離、調(diào)節(jié)糖度和PH值，然后接入固定化酵母細(xì)胞進(jìn)行厭氧發(fā)酵，最后蒸餾提純得出燃料酒精。本發(fā)明從成本和資源利用的角度來看都顯出了獨(dú)特的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決餐廚廢棄物難以合理、有效的處置以及現(xiàn)有的制備燃料乙醇方法成本高的問題。從而提出一種利用玉米秸稈作為載體制備固定化細(xì)胞，并用該固定化細(xì)胞發(fā)酵餐廚廢棄物生產(chǎn)燃料乙醇的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案利用玉米秸稈纖維作為載體制備固定化酵母細(xì)胞并用于餐廚廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，包括以下步驟(1)將干玉米秸稈去皮、切成小塊，稱取一定量秸稈小塊轉(zhuǎn)入pH = 4. 8,0. 05M磷酸鹽緩沖液中，再加入纖維素酶在40°C條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，纖維素酶用量是5-50FPU/g秸稈，酶解時間為0. 5-6h，反應(yīng)結(jié)束后，用自來水沖洗，直至pH呈中性；
(2)載體干燥將上述制備好的玉米秸稈載體在50°C條件下干燥至恒重，待用；(3)細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)將酵母菌接入裝有YPD培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，30°C，150rpm條件下培養(yǎng)Mh，再在4°C，8000rpm條件下離心得到菌體，最后重懸于生理鹽水制成1 X IO9Cells/ mL酵母細(xì)胞濃縮液，待用；(4)固定化細(xì)胞制備向上述每升細(xì)胞懸浮液中浸入I-IOOOg干燥后載體，30°C、 IOOrpm條件下培養(yǎng)Mh，再過濾、除去游離細(xì)胞，待用；(5)對餐廚廢棄物進(jìn)行分揀，將其中的非生物質(zhì)廢棄物挑選出來進(jìn)行分類回收；(6)經(jīng)過分揀后的餐廚廢棄物按照1 0. 5-2的比例與水混合，然后加入α -淀粉酶和糖化酶酶解，溫度保持在40_80°C，時間為1- ；每克生物質(zhì)廢棄物添加α -淀粉酶 l-50u、糖化酶 l-200u ；(7)分揀后的餐廚廢棄物經(jīng)過酶解后再經(jīng)過離心，得到酶解液，酶解液用于乙醇發(fā)酵，固形物殘?jiān)腿胝託獬刂校?8)檢測酶解液的糖度和ρΗ值，并對這兩個參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整后的糖度為 18-22%，ρΗ 值為 4-7 ；(9)然后酶解液接種工業(yè)酒精酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵，接種量為-10% (w/v)，發(fā)酵溫度30-34°C，最后制得含有8% -11%乙醇發(fā)酵液；(10)乙醇提純，將乙醇發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾提純，獲得燃料乙醇產(chǎn)品。所述的利用玉米秸稈纖維作為載體制備固定化酵母細(xì)胞并用于餐廚廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，所述的糖度調(diào)整選用添加葡萄糖、真空濃縮及膜濃縮方法的其中一種或幾種的結(jié)合。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用的固定化細(xì)胞方法具有操作方便、成本低、發(fā)酵過程中傳質(zhì)效率高及可實(shí)現(xiàn)重復(fù)分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵等特點(diǎn)；此外本發(fā)明采用餐廚廢棄物為原料生產(chǎn)燃料乙醇還具有原料便宜、投資少、成本低等特點(diǎn)，且實(shí)現(xiàn)了餐廚廢棄物的無害化、減量化和資源化。


圖1本發(fā)明的工藝流程示意圖。圖2掃描電鏡下拍攝的經(jīng)纖維素酶修飾后的玉米秸稈纖維(酶解時間4h)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一種利用玉米秸稈纖維作為載體制備固定化酵母細(xì)胞并用于餐廚廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，包括以下步驟(1)將干玉米秸稈去皮、切成小塊，各小塊尺寸約2cmX2cm，稱取秸稈小塊500g轉(zhuǎn)入裝有1. 5L 0. 05M磷酸鹽緩沖液(pH4. 8)的5L發(fā)酵罐中，再加入纖維素酶在40°C條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，纖維素酶用量是50FPU/g秸稈，酶解時間為4h。反應(yīng)結(jié)束后，用自來水沖洗， 直至ρΗ呈中性；圖2B為掃描電鏡所拍攝的經(jīng)纖維素酶修飾后的玉米秸稈纖維圖片。(2)載體干燥將上述制備好的玉米秸稈載體在50°C條件下干燥至恒重，待用；(3)細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)將酵母菌接入裝有2L YPD培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，30°C，150rpm 條件下培養(yǎng)48h。再在4°C，SOOOrpm條件下離心得到菌體，最后重懸于生理鹽水制成酵母細(xì)胞濃縮液(約lX109cellS/mL)，待用；(4)固定化細(xì)胞制備將IOOg干燥后載體浸入0.5L上述細(xì)胞懸浮液中，30°C、 IOOrpm條件下培養(yǎng)Mh，再過濾、除去游離細(xì)胞，待用；(5)對餐廚廢棄物進(jìn)行分揀，將其中的非生物質(zhì)廢棄物挑選出來進(jìn)行分類回收；(6)經(jīng)過分揀后的餐廚廢棄物按照1 0. 5的比例與水混合，然后加入α -淀粉酶和糖化酶酶解，溫度保持在55°c，時間為池；每克生物質(zhì)廢棄物添加α -淀粉酶50u、糖化酶140u ；(7)分揀后的餐廚廢棄物經(jīng)過酶解后再經(jīng)過離心，酶解液用于乙醇發(fā)酵，固形物殘?jiān)腿胝託獬刂校?8)檢測酶解液的糖度和pH值，并對這兩個參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整后的糖度為20%， PH值為4. 5 ；其中糖度調(diào)整采用真空濃縮的方法；(9)然后酶解液接種工業(yè)酒精酵母進(jìn)行重復(fù)分批發(fā)酵，接種量為2% (w/v)，發(fā)酵溫度30°C，最后制得含9.91%乙醇發(fā)酵液。(10)乙醇提純，9. 91%乙醇發(fā)酵液蒸餾提純，獲得工業(yè)乙醇產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種利用玉米秸稈纖維作為載體制備固定化酵母細(xì)胞并用于餐廚廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將干玉米秸稈去皮、切成小塊，稱取一定量秸稈小塊轉(zhuǎn)入PH= 4. 8,0. 05M磷酸鹽緩沖液中，再加入纖維素酶在40°C條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，纖維素酶用量是5-50FPU/g秸稈，酶解時間為0. 5-6h，反應(yīng)結(jié)束后，用自來水沖洗，直至pH呈中性；(2)載體干燥將上述制備好的玉米秸稈載體在50°C條件下干燥至恒重，待用；(3)細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)將酵母菌接入裝有YPD培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，30°C，150rpm條件下培養(yǎng) 24h,再在4°C，8000rpm條件下離心得到菌體，最后重懸于生理鹽水制成1 X 109cells/mL酵母細(xì)胞濃縮液，待用；(4)固定化細(xì)胞制備向上述每升細(xì)胞懸浮液中浸入I-IOOOg干燥后載體，30°C、 IOOrpm條件下培養(yǎng)Mh，再過濾、除去游離細(xì)胞，待用；(5)對餐廚廢棄物進(jìn)行分揀，將其中的非生物質(zhì)廢棄物挑選出來進(jìn)行分類回收；(6)經(jīng)過分揀后的餐廚廢棄物按照1 0.5-2的比例與水混合，然后加入α-淀粉酶和糖化酶酶解，溫度保持在40_80°C，時間為1- ；每克生物質(zhì)廢棄物添加α -淀粉酶1-50U、 糖化酶l-200u ；(7)分揀后的餐廚廢棄物經(jīng)過酶解后再經(jīng)過離心，得到酶解液，酶解液用于乙醇發(fā)酵， 固形物殘?jiān)腿胝託獬刂校?8)檢測酶解液的糖度和pH值，并對這兩個參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整后的糖度為18-22%， PH值為4-7 ；(9)然后酶解液接種工業(yè)酒精酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵，接種量為-10%(w/v)，發(fā)酵溫度 30-34°C，最后制得含有8% -11%乙醇發(fā)酵液；(10)乙醇提純，將乙醇發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾提純，獲得燃料乙醇產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用玉米秸稈纖維作為載體制備固定化酵母細(xì)胞并用于餐廚廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于所述的糖度調(diào)整選用添加葡萄糖、真空濃縮及膜濃縮方法的其中一種或幾種的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用玉米秸稈纖維作為載體制備固定化酵母細(xì)胞并用于餐廚廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，是將玉米秸稈經(jīng)過纖維素酶修飾后作為載體制備固定化酵母細(xì)胞，并通過對餐廚廢棄物中的生物質(zhì)廢棄物進(jìn)行酶解，離心分離，調(diào)節(jié)糖度和pH值，然后接種固定化酵母細(xì)胞進(jìn)行厭氧發(fā)酵，蒸餾提純得出工業(yè)乙醇。本發(fā)明采用的固定化細(xì)胞方法具有操作方便、成本低、發(fā)酵過程中傳質(zhì)效率高及可實(shí)現(xiàn)重復(fù)分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵等特點(diǎn)；此外本發(fā)明采用餐廚廢棄物為原料生產(chǎn)燃料乙醇還具有原料便宜、投資少、成本低等特點(diǎn)，且實(shí)現(xiàn)了餐廚廢棄物的無害化、減量化和資源化。
文檔編號C12P7/08GK102199631SQ20111007017
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者葉建豐, 吳金勇, 姚建銘, 朱微微, 李俊, 楊乃坤, 汪平超, 翟志偉, 胡戰(zhàn)偉, 陳祥松, 顏守保 申請人:安徽科聚環(huán)保新能源有限公司