專利名稱：一株聚羥基脂肪酸酯合成菌及其發(fā)酵培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株聚羥基脂肪酸酯合成菌隆德假單胞菌I^seudomonaslundensis PHA5及及通過培養(yǎng)該菌發(fā)酵合成聚羥基脂肪酸酯的方法。
背景技術(shù)：
聚羥基脂肪酸酯(PHA)是微生物在營養(yǎng)條件不平衡時，產(chǎn)生的貯存能源和碳源的胞內(nèi)物質(zhì)。據(jù)報道，自然界中有許多種能夠合成聚羥基脂肪酸酯(PHA)的微生物。聚羥基脂肪酸酯(PHA)是一類線性飽和聚酯，是一類具有良好的生物可降解性的高分子材料，它不僅具有與化學(xué)合成高分子材料相似的性能，而且還具有一些特殊的優(yōu)良性能①良好的生物相容性；②可塑性；③疏水性；④低透氧性；⑤壓電性；⑥光學(xué)活性等?；诰哿u基脂肪酸酯(PHA)材料的許多優(yōu)良特性，聚羥基脂肪酸酯(PHA)的用途十分廣泛。例如，可被制成各種綠色包裝材料與容器，用于研制仿生人體組織或器官代用品，手術(shù)縫合線，可降解膠印油墨，還可用作電信器件外殼，用于制造食品等。聚羥基脂肪酸酯(PHA)是一類很有應(yīng)用開發(fā)潛力的材料。根據(jù)單體的碳原子數(shù)目，聚羥基脂肪酸酯(PHA)分為三類①短鏈(Short-chain Length, SCL) PHA，由3 5個碳原子組成，其硬度高塑性底，機(jī)械性能和加工性能都比較差； ②中長鏈(medium-chain-length，MCL)PHA，由6 16個碳原子組成，黏性大，難于加工；③ 含短鏈與中長鏈單體混合物的PHA，脆性低，韌性強，具有很好的結(jié)晶性能和熔點加工性能。 目前雖然已有能產(chǎn)生短鏈與中長鏈共聚的PHA的菌株及相應(yīng)的發(fā)酵生產(chǎn)方法，但都需要在培養(yǎng)基中添加多種相關(guān)碳原子數(shù)的碳源或以混合有機(jī)材料作為碳源。但是PHA合成菌在碳源種類和比例不同的條件下，合成的PHA結(jié)構(gòu)也會有所不同，因此，就不易控制發(fā)酵條件以合成預(yù)期的特定結(jié)構(gòu)的PHA，而且，很多利用基因工程改造的菌株存在成本高、菌株特性不穩(wěn)定等問題。因此，以單一碳源為底物合成一種短鏈與中長鏈共聚的PHA具有更高的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一株新發(fā)現(xiàn)的聚羥基脂肪酸酯合成菌隆德假單胞菌 Pseudomonas lundensis PHA5。本發(fā)明提供的聚羥基脂肪酸酯合成菌為隆德假單胞菌I^seudomonashmdensis PHA5，該菌已于2011年3月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢，武漢大學(xué)內(nèi))，保藏編號為 CCTCC NO =M 2011077。本發(fā)明的聚羥基脂肪酸酯合成菌隆德假單胞菌I^seudomonas lundenSiSPHA5分離自天津市西青付村農(nóng)田土。該菌在LB培養(yǎng)基上生長良好。LB培養(yǎng)基組成為蛋白胨， 0. 5%酵母粉，0. 5% NaCl，pH 7. 0 7. 2。菌落呈圓形，半透明，邊緣整齊。其16S rDNA基因的核苷酸序列長度為1408bp。使用BLAST對隆德假單胞菌PHA5菌株的16S rDNA基因和 GenBank中已登錄細(xì)菌進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)該菌株與已報道的隆德假單胞菌I^seudomonassp. c267的16S rDNA基因序列相似性最高。隆德假單胞菌I^seudomonas lundensis PHA5的系統(tǒng)進(jìn)化樹見說明書附圖1。本發(fā)明的另一個目的是公開利用上述隆德假單胞菌I^seudomonas lundensisPHA5 菌株以單一碳源——葡萄糖合成一種新型結(jié)構(gòu)的聚羥基脂肪酸酯的方法。本發(fā)明采取以下技術(shù)方案將菌種接種到5ml LB液體培養(yǎng)基，30°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)M小時后，按照10 %的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵 48-96小時。離心發(fā)酵液，棄上清，收集菌體冷凍干燥。將干燥菌體轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加入氯仿充分?jǐn)嚢?8小時，過濾去掉菌體殘渣，將濾液旋蒸濃縮后，加入40倍體積冷甲醇沉淀PHA 產(chǎn)物，收集沉淀，真空干燥，保存。該聚羥基脂肪酸酯的結(jié)構(gòu)單體包含C4單體，C6單體，C8單體，Cltl單體，C14單體，C16 單體的3-羥基脂肪酸。該菌株以葡萄糖為原料合成的聚羥基脂肪酸酯的水解后的單體結(jié)構(gòu)見說明書附圖2。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的突出優(yōu)點在于該菌株能以葡萄糖為單一碳源合成短鏈與中長鏈共聚的PHA。單一碳源的PHA合成條件避免了發(fā)酵生產(chǎn)過程中對多種碳源種類和比例的要求，使短鏈與中長鏈共聚PHA的合成條件簡單化。其產(chǎn)物PHA的結(jié)構(gòu)單體的碳原子數(shù)從C4到C16共六種，跨度較大，由多種短鏈單體與中長鏈單體組成的PHA具有比短鏈PHA和中長鏈PHA都更加優(yōu)良的機(jī)械和加工性能，具有更加廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是隆德假單胞菌I^seudomonas lundensis PHA5的系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖2是隆德假單胞菌I^seudomonas lundensis PHA5以葡萄糖為原料合成的聚羥基脂肪酸酯水解后的單體結(jié)構(gòu)。下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
具體實施例方式在下面的實施例中，所用菌種均為隆德假單胞菌I^seudomonas lundensisPHA5。實施例中所用的不同培養(yǎng)基配方如下(1)篩選培養(yǎng)基牛肉粉lg，蛋白胨lg，NaCl 0. 5g，葡萄糖2g，瓊脂粉1. 5g，蒸餾水IOOml，pH 7.0， 和0. 2ml尼爾紅溶液。該尼爾紅溶液是用25mg尼爾紅染料溶于IOOml 二甲亞砜配制而成的。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基Na2HPO4 · 3H20 9. 58g, ΚΗ2Ρ042· 65g, NH4Cl 0. 535g, MgSO4O. 2g，微量元素 1ml，葡萄糖 15g，蒸餾水 1000ml，pH 7.0。實施例1篩選分離隆德假單胞菌Pseudomonas lundensis PHA5實驗材料篩選自天津市西青付村農(nóng)田土。具體實施步驟如下取剩余活性污泥l(xiāng)g，于99ml生理鹽水中攪拌，靜置，取上清液，用生理鹽水以10倍梯度稀釋，分別稀釋為IO3-IO7,取IO3-IO6涂布于固體篩選培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)48小時，紫外分析儀下觀察，標(biāo)記橘紅色熒光的菌落，挑取該菌落，于固體篩選培養(yǎng)基平板上劃線以純化，30°C培養(yǎng)M小時，挑取呈橘紅色的菌落保存于甘油管。經(jīng) 16S rDNA基因序列分析以及BIOLOG鑒定，確定該菌株為I^seudomonas屬、Iundensis種，并且命名為隆德假單胞菌I3Seudomonas lundensis PHA5。該菌已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2011077。實施例2隆德假單胞菌Pseudomonas lundensis PHA5發(fā)酵合成PHA具體步驟如下首先將菌種接種到5ml LB液體培養(yǎng)基，30°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)M小時后，按照10%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C下?lián)u瓶發(fā)酵48 小時。離心發(fā)酵液，棄上清，收集菌體冷凍干燥。將干燥菌體轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加入氯仿充分?jǐn)嚢?8小時，過濾去掉菌體殘渣，將濾液旋蒸濃縮后，加入40倍體積冷甲醇沉淀PHA產(chǎn)物， 收集沉淀，真空干燥，保存。實施例3隆德假單胞菌I^seudomonas lundensis PHA5發(fā)酵合成PHA具體步驟如下首先將菌種接種到5ml LB液體培養(yǎng)基，30°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)M小時后，按照10%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C下?lián)u瓶發(fā)酵96 小時。離心發(fā)酵液，棄上清，收集菌體冷凍干燥。將干燥菌體轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加入氯仿充分?jǐn)嚢?8小時，過濾去掉菌體殘渣，將濾液旋蒸濃縮后，加入40倍體積冷甲醇沉淀PHA產(chǎn)物， 收集沉淀，真空干燥，保存。實施例4產(chǎn)物PHA的結(jié)構(gòu)單體分析稱取5mg產(chǎn)物PHA，置于水解罐中，加入2ml氯仿，混合溶解后，加入1. 7ml甲醇和 0. 3ml濃硫酸，充氮氣，置于100°C烘箱中水解140min。水解液冷卻后轉(zhuǎn)入IOml離心管中， 加入2ml蒸餾水，充分混勻，靜置一段時間，取下層有機(jī)相保存于EP管中。氣-質(zhì)聯(lián)用檢測該酸水解樣品，以確定單體種類。
權(quán)利要求
1.一株聚羥基脂肪酸酯合成菌隆德假單胞菌I3Seudomonas lundensis PHA5
2.利用隆德假單胞菌I^seudomonaslundensis PHA5發(fā)酵合成聚羥基脂肪酸酯的方法為將菌種接種到5ml LB液體培養(yǎng)基，30°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速ISOrpm，培養(yǎng)M小時后， 按照10%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速180rpm，3(TC下?lián)u瓶發(fā)酵48-96小時。離心發(fā)酵液，棄上清，收集菌體冷凍干燥。將干燥菌體轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加入氯仿充分?jǐn)嚢?8 小時，過濾去掉菌體殘渣，將濾液旋蒸濃縮后，加入40倍體積冷甲醇沉淀PHA產(chǎn)物，收集沉淀，真空干燥，保存。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用隆德假單胞菌I^seudomonas lundensis PHA5發(fā)酵合成聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征在于所用的培養(yǎng)基組分(1)篩選培養(yǎng)基牛肉粉lg，蛋白胨lg，NaCl 0.5g，葡萄糖2g，瓊脂粉1.5g，蒸餾水100ml，pH 7.0，和 0. 2ml尼爾紅溶液；該尼爾紅溶液是用25mg尼爾紅染料溶于IOOml 二甲亞砜配制而成的；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基Na2HPO4 · 3H20 9. 58g, ΚΗ2Ρ042· 65g, NH4Cl 0. 535g, MgSO4O. 2g,微量元素 1ml，葡萄糖 15g，蒸餾水 1000ml, pH 7. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株聚羥基脂肪酸酯合成菌隆德假單胞菌Pseudomonaslundensis PHA5及通過培養(yǎng)該菌發(fā)酵制備聚羥基脂肪酸酯的方法。該菌株能以葡萄糖為單一碳源合成短鏈與中長鏈共聚的PHA。單一碳源的PHA合成條件避免了發(fā)酵生產(chǎn)過程中對多種碳源種類和比例的要求，使短鏈與中長鏈共聚PHA的合成條件簡單化；由多種短鏈單體與中長鏈單體組成的PHA具有比短鏈PHA和中長鏈PHA都更加優(yōu)良的機(jī)械和加工性能，具有更加廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/20GK102206596SQ201110079590
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者劉耀輝, 孫肇直, 宋存江, 李園, 楊小娟, 王淑芳, 石曉宇, 郭文斌 申請人:南開大學(xué)