專利名稱：一株γ-聚谷氨酸合成菌及其發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微生物發(fā)酵的方法合成生物大分子Y-聚谷氨酸，具體涉及到一株地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis CDL-1及其發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
二十世紀(jì)30年代，人們首先在炭疽桿菌的莢膜中發(fā)現(xiàn)了 Y-聚谷氨酸。Y-聚谷氨酸是一種由D-谷氨酸和L-谷氨酸單體通過Y-酰胺鍵縮合而成的多肽分子。通常其相對分子質(zhì)量在10萬到1000萬之間。它的結(jié)構(gòu)式如圖所示y -PGA具有優(yōu)良的生物相容性，是一種可降解的生物高分子材料。它的水溶性極佳；主鏈上含有大量游離的羧基，使Y-PGA具有水溶性聚羧酸的性質(zhì)。交聯(lián)Y-PGA具有強吸水保濕性能，可用于土壤、沙地的蓄水保水劑，化妝品的保濕劑，水果、蔬菜的防凍劑， 食品的增稠劑，以及作為廢水處理所需的生物絮凝劑、重金屬螯合劑，用作分散劑等。對 Y-PGA進行一些功能化修飾，其衍生物能夠在血液循環(huán)中保留較長時間，對靶向給藥和藥物緩釋具有重要意義。Y-聚谷氨酸的分子量與其應(yīng)用密切相關(guān)。一般高分子量的Y-聚谷氨酸可以用作高強吸水材料，但分子量越大其流變性越難控制，也很難被化學(xué)試劑修飾，從而限制了 Y-聚谷氨酸的應(yīng)用。目前關(guān)于Y-聚谷氨酸分子量與發(fā)酵條件的關(guān)系的研究也已經(jīng)廣泛受到了人們的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一株Y-聚谷氨酸合成菌地衣芽胞桿菌本發(fā)明所提供的菌株地衣芽胞桿菌Bacillus lincheniformis CDL-1分離自發(fā)酵食品，在固體平板上表現(xiàn)為菌落呈圓形、邊緣整起濕潤、粘稠、半透明狀。革蘭氏染色呈陽性，通過16S rDNA以及微生物鑒定系統(tǒng)BIOLOG的實驗結(jié)果，確定為地衣芽孢桿菌，命名為地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis CDL-1。將該菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢，武漢大學(xué)內(nèi))，保藏編號為CCTCC NO :2011076，保藏日期為:2011年 3 月 22 日。本發(fā)明的第二個目的是提供利用地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis CDL-1 發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的培養(yǎng)方法。本發(fā)明采取以下技術(shù)方案(1)菌種活化接種地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis CDL-1至LB固體培養(yǎng)基，37°C恒溫培養(yǎng)M小時；
Bacilluslincheniformis CDL-1。
(2)種子培養(yǎng)將固體平板活化的菌種接種至5ml種子培養(yǎng)基中，37 °C， 170-200rpm震蕩培養(yǎng)12小時；(3)搖瓶發(fā)酵以至2%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C， 170-220rpm振蕩培養(yǎng)24-48小時；(4)將發(fā)酵液調(diào)至pH 6. 0，8000rpm，4°C離心20min，取上清用4倍無水乙醇沉淀， 收集沉淀用蒸餾水溶解，透析處理M-48小時，然后經(jīng)冷凍干燥得到發(fā)酵產(chǎn)物。利用地衣芽胞桿菌Bacillus lincheniformis CDL-1發(fā)酵合成Y-聚谷氨酸的方法中各培養(yǎng)基組分如下(I)LB 固體培養(yǎng)基蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂％ 2，ρΗ7· 0-7. 2。(2)種子培養(yǎng)基葡萄糖 50g/L，L-谷氨酸 15g/L，NaCl 0. 5g, KH2P042. 7g/L, Na2HPO4 ‘ 12H20 4. 2g/L，MgSO4 ·7Η20 0. 5g/L，生物素 5 X l(T4g/L，pH 6. 4-7. O0 (3)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 50-75g/L, L-谷氨酸 15-20g/L, NaCl 0. 5g, ΚΗ2Ρ042· 7g/L, Na2HPO4 · 12H20 4. 2g/ L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L,生物素 5X l(T4g/L，pH 6. 4-7. 0。本發(fā)明的突出優(yōu)點在于提供了一株能夠穩(wěn)定合成Y-聚谷氨酸的菌株地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis CDL-1，其發(fā)酵方法簡單易行，條件易于控制；且其發(fā)酵產(chǎn)物純度高，分子量分布窄，能夠較好的應(yīng)用于Y -聚谷氨酸的生產(chǎn)。


圖1是地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis CDL-I的系統(tǒng)進化樹。
具體實施例方式在下面的實施例中所用菌種均為地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis CDL-1,實施例中不同培養(yǎng)基及溶液配方如下(I)LB 固體培養(yǎng)基蛋白胨 10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂％2，pH 7.0-7.2。(2)菌種篩選培養(yǎng)基葡萄糖 50g/L, L-谷氨酸 15g/L，NaCl 0. 5g，KH2P042. 7g/L， Na2HPO4 ‘ 12H20 4. 2g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，生物素 5X l(T4g/L，瓊脂 2%，pH 7.0。(3)種子培養(yǎng)基葡萄糖 50g/L, L-谷氨酸 15g/L，NaCl 0. 5g，ΚΗ2Ρ042· 7g/L， Na2HPO4 · 12H20 4. 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L,生物素 5X l(T4g/L，pH 6. 4-7. 0。(4)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 50-75g/L，L-谷氨酸 15_20g/L，NaCl 0. 5g，KH2P042. 7g/ L, NaHPO4 · 12H20 4. 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L,生物素 5 X 10_4g/L，pH 6. 4-7. 0。以下實例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1、分離鑒定地衣芽孢桿菌Bacilluslincheniformis CDL-I該菌株分離至豆腐乳類發(fā)酵食品。具體實施步驟如下從發(fā)酵食品中取Ig實驗材料接入已滅菌的100ml LB培養(yǎng)液中，磁力攪拌30分鐘，使其分散均勻。于100°C處理15min，然后將三角瓶置于搖床中37°C， 170r/min振蕩培養(yǎng)1 富集菌種。而后用0. 85%的生理鹽水10倍梯度稀釋菌液。將10_2， 10_3兩個梯度分別吸取200 μ L涂布固體平板，置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)Mh。而后觀察黏性的單菌落，挑出在固體平板上多次劃線純化。經(jīng)過革蘭氏染色、16S rDNA基因序列分析以及BIOLOG微生物分類鑒定系統(tǒng)確定該菌株為地衣芽孢桿菌，命名為地衣芽孢桿菌Bacillus IincheniformisCDL-I。實施例2、利用地衣芽孢桿菌Bacilluslincheniformis CDL-1發(fā)酵生產(chǎn)Y -聚谷氨酸以及發(fā)酵產(chǎn)物的理化性質(zhì)檢測1)菌種活化將_80°C保藏的地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis CDL-1接種至LB固體平板上，37°C恒溫靜置培養(yǎng)M小時；(2)種子培養(yǎng)將固體平板活化的菌種轉(zhuǎn)接至5ml種子培養(yǎng)基中，37°C，170rpm振蕩培養(yǎng)12小時；(3)搖瓶發(fā)酵以的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，170rpm振蕩培養(yǎng)24小時；(4) γ -聚谷氨酸產(chǎn)量的測定將發(fā)酵液調(diào)PH至6，8000rpm，4°C離心20分鐘取出菌體，用4倍體積無水乙醇沉淀上清液，6000rpm, 4°C離心20分鐘得到沉淀。用蒸餾水溶解， 透析處理48小時，然后冷凍真空干燥，稱重。(5)采用FT-IR^H-NMR，紫外吸收光譜等確定發(fā)酵產(chǎn)物為Y -聚谷氨酸。(6) γ -聚谷氨酸分子量的測定采用凝膠滲透色譜法測定發(fā)酵產(chǎn)物Y -聚谷氨酸的分子量，結(jié)果表明，通過本培養(yǎng)條件培養(yǎng)地衣芽孢桿菌Bacilluslincheniformis CDL-1， 發(fā)酵得到的Y-聚谷氨酸的分子量為351KD。實施例3、地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis CDL-1發(fā)酵48小時后產(chǎn)物分
子量的測定。搖瓶發(fā)酵，振蕩培養(yǎng)48小時，其它條件與實施例2同。結(jié)果表明，經(jīng)過48小時培養(yǎng)后地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis CDL-I發(fā)酵得到的Y-聚谷氨酸的分子量為 347KD。
權(quán)利要求
1.一株γ-聚谷氨酸合成菌地衣芽胞桿菌Bacillus lincheniformis CDL-1。
2.利用地衣芽胞桿菌Bacilluslincheniformis CDL-1發(fā)酵合成Y-聚谷氨酸的方法為(1)菌種活化接種地衣芽孢桿菌Bacilluslincheniformis CDL-I至LB固體培養(yǎng)基， 37 °C恒溫培養(yǎng)M小時；(2)種子培養(yǎng)將固體平板活化的菌種接種至5ml種子培養(yǎng)基中，37°C，170rpm振蕩培養(yǎng)12小時；(3)搖瓶發(fā)酵以1%至2 %的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，370C，170rpm振蕩培養(yǎng)24-48小時；(4)將發(fā)酵液調(diào)至pH6. 0，8000rpm，4°C離心20min，取上清用4倍無水乙醇沉淀，收集沉淀，用蒸餾水溶解，透析處理48小時，然后經(jīng)冷凍干燥得到發(fā)酵產(chǎn)物Y-聚谷氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用地衣芽胞桿菌Bacilluslincheniformis CDL-I發(fā)酵合成Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于所用的培養(yǎng)基組分⑴種子培養(yǎng)基葡萄糖 50g/L, L-谷氨酸 15g/L，NaCl 0. 5g，KH2P042. 7g/L， Na2HPO4 · 12H20 4. 2g/L，MgSO4 ·7Η20 0. 5g/L，生物素 5X l(T4g/L，pH 6. 4-7. 0 ； (2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 50-75g/L, L-谷氨酸 15-20g/L, NaCl 0. 5g, ΚΗ2Ρ042· 7g/L, Na2HPO4 · 12H20 4. 2g/ L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L,生物素 5X l(T4g/L，pH 6. 4-7. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株γ-聚谷氨酸合成菌地衣芽胞桿菌Bacillus lincheniformisCDL-1及其發(fā)酵方法。本發(fā)明提供的γ-聚谷氨酸合成菌株能夠合成分子量為300-350KD的γ-聚谷氨酸，且分子量分布窄，其流變性容易控制，易被化學(xué)試劑加工修飾，能夠較好的應(yīng)用在不同的領(lǐng)域。本發(fā)明提供的菌株傳代穩(wěn)定，培養(yǎng)方法簡單易行，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/10GK102206597SQ20111007961
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者馮俊, 宋存江, 曹名鋒, 李文炯, 杜陽, 杜驍, 王淑芳, 解慧 申請人:南開大學(xué)