專利名稱：一株產(chǎn)原兒茶酸的枯草芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
原兒茶酸廣泛存在于無梗五加、葒草等常用中草藥中，是一種水溶性酚酸成分，原兒茶酸有抗菌作用，體外試驗(yàn)時(shí)對綠膿桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、產(chǎn)堿桿菌及枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑菌作用；具有顯著降低心肌耗氧量，提高心肌耐氧能力，減慢心率等藥理作用，還有明顯抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。臨床用于治療慢性氣管炎。常用生產(chǎn)方法由香草醛經(jīng)堿熔、酸化而得。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，可產(chǎn)生原兒茶酸，為原兒茶酸的獲得提供微生物資源基礎(chǔ)。本發(fā)明產(chǎn)原兒茶酸的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌WF17 (Bacillus subtilis WF17)，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為 2011年3月22日，保藏編號(hào)為CCTCC No =M 2011079 ；本發(fā)明枯草芽孢桿菌WF17為革蘭氏陽性菌，桿狀，細(xì)胞大小為長2. 0 3. 0 μ m，寬0. 7 0. 8 μ m，有鞭毛，有菌膜；在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，顏色為白色(如圖1)。本發(fā)明枯草芽孢桿菌WF17淀粉水解試驗(yàn)呈陽性，明膠液化試驗(yàn)呈陰性，接觸酶試驗(yàn)呈陽性，酯酶試驗(yàn)呈陰性，甲基紅試驗(yàn)呈陽性，V. P試驗(yàn)呈陽性，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)結(jié)果為具有運(yùn)動(dòng)性。本發(fā)明枯草芽孢桿菌WF17 (Bacillus subtilis WF17)通過16S rDNA序列比對分析，與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis strain TCCCl 1002的16S rDNA序列的同源性最高，相似性為99 %，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定枯草芽孢桿菌WF17屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株。本發(fā)明枯草芽孢桿菌WF17可在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上生長，枯草芽孢桿菌WF17的最適生長溫度為37°C，最適合生長環(huán)境的pH值為7. 6，最適鹽濃度為2%,為兼性厭氧菌。本發(fā)明枯草芽孢桿菌WF17能夠產(chǎn)生原兒茶酸，其代謝產(chǎn)物具有較好的抑菌活性。本發(fā)明枯草芽孢桿菌WF 17 (Bacillus subtilis WF 17)屬于芽孢桿菌屬 (Bacillus)，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2011年3月22日，保藏編號(hào)為CCTCC No =M 2011079。


圖1為本發(fā)明枯草芽孢桿菌WF17的菌落形態(tài)照片；圖2為通過枯草芽孢桿菌WF17 和相近菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；圖3為原兒茶酸對照品的HPLC色譜圖，圖4為具體實(shí)施方式
二中組分WF17b的HPLC色譜圖，圖5為具體實(shí)施方式
二中標(biāo)準(zhǔn)加入法后WF17b的HPLC色譜圖。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式產(chǎn)原兒茶酸的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌 WF17 (Bacillus subtilis WF17)，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2011年3月22日，保藏編號(hào)為CCTCC No =M 2011079。本實(shí)施方式枯草芽孢桿菌WF17為革蘭氏陽性菌，桿狀，細(xì)胞大小為長2. 0 3. 0 μ m，寬0. 7 0. 8 μ m，有鞭毛，有菌膜；在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，顏色為白色。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第八版和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對枯草芽孢桿菌 WF17進(jìn)行生理生化鑒定枯草芽孢桿菌WF17淀粉水解試驗(yàn)呈陽性，明膠液化試驗(yàn)呈陰性， 接觸酶試驗(yàn)呈陽性，酯酶試驗(yàn)呈陰性，甲基紅試驗(yàn)呈陽性，V. P試驗(yàn)呈陽性，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)結(jié)果為具有運(yùn)動(dòng)性。本實(shí)施方式枯草芽孢桿菌WF17可在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上生長，枯草芽孢桿菌WF17的最適生長溫度為37°C，最適合生長環(huán)境的pH值為7. 6，最適鹽濃度為 2%，為兼性厭氧菌。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
枯草芽孢桿菌WF17(BacilluS subtilisffF17)由中國黑龍江省帽兒山地區(qū)健康的北五味子植株的果實(shí)中篩選得到。篩選按以下步驟進(jìn)行取健康北五味子植株的果實(shí)，用水沖洗干凈；將清洗干凈的北五味子果實(shí)依下列順序進(jìn)行表面消毒先由75 %酒精漂洗lmin，再由10 %雙氧水漂洗15min，接著由 75%酒精漂洗lmin，最后由無菌水沖洗4次；然后置于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37°C 恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)1 3d，待培養(yǎng)基長出菌落后，挑取少量菌落轉(zhuǎn)到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中進(jìn)行倍比稀釋純化培養(yǎng)，即得到枯草芽孢桿菌WF17。陰性對照為了檢查表面消毒是否徹底，把最后一次沖洗北五味子果實(shí)的無菌水用無菌的涂布棒涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面上，然后將消毒后的北五味子果實(shí)在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上滾動(dòng)一周，以此做為陰性對照，于相同的條件下培養(yǎng)。經(jīng)過多次重復(fù)，陰性對照平板均無任何菌落長出，證明北五味子果實(shí)表面消毒徹底，分離到的菌是北五味子內(nèi)生細(xì)菌-枯草芽孢桿菌WF17，而不是植株表面的附生菌。對篩選得到的枯草芽孢桿菌WF17進(jìn)行分子鑒定，按以下步驟進(jìn)行提取菌株的基因組DNA，采用國際細(xì)菌鑒定通用引物進(jìn)行，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后利用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，之后進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆的菌落，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序公司進(jìn)行測序?？莶菅挎邨U菌WF17的16SrDNA序列長度為1600bp，將測序結(jié)果與GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對，然后用軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖2所示)，以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，該序列與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis strainTCCCl 1002的16S rDNA序列的同源性最高，相似性為99%，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、 生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定枯草芽孢桿菌WF17屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株。
PCR引物購買自上海生工生物技術(shù)有限公司，其他試劑購自于大連寶生物工程有限公司。對本實(shí)施方式枯草芽孢桿菌WF17的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性測定，測定結(jié)果于表1所
7J\ ο表1枯草芽孢桿菌WF17發(fā)酵液對供試菌的抑菌活性測定結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一株產(chǎn)原兒茶酸的枯草芽孢桿菌，其特征在于產(chǎn)原兒茶酸的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌WF17 (Bacillus subtilis WF17)，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2011年3月22日，保藏編號(hào)為CCTCC No =M 2011079。
全文摘要
一株產(chǎn)原兒茶酸的枯草芽孢桿菌，它涉及一株枯草芽孢桿菌。本發(fā)明提供了一株枯草芽孢桿菌，可產(chǎn)生原兒茶酸，為原兒茶酸的獲得提供微生物資源基礎(chǔ)。本發(fā)明產(chǎn)原兒茶酸的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌WF17，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2011年3月22日，保藏編號(hào)為CCTCC NoM 2011079。本發(fā)明枯草芽孢桿菌WF17能夠產(chǎn)生原兒茶酸，其代謝產(chǎn)物具有較好的抑菌活性，該菌株的發(fā)現(xiàn)為原兒茶酸原料的獲得可提供微生物資源基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102206600SQ20111008984
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者劉玉潔, 吳丹, 徐翠, 鄭春英 申請人:黑龍江大學(xué)