具硝化功能的枯草芽孢桿菌sc228及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌SC228，其保藏名稱為：枯草芽孢桿菌SC228 Bacillus subtilisSC228，保藏號(hào)為：CCTCC NO：M 2016304。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述枯草芽孢桿菌SC228的用途：作為硝化功能菌，去除水體中的氨態(tài)氮。CCTCC NO：M 201630420160602
【專利說(shuō)明】
具硝化功能的枯草芽孢桿菌SC228及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[00011 本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SC228及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是世界水產(chǎn)大國(guó)，同時(shí)也是世界上唯一水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量高于捕撈產(chǎn)量的國(guó)家。 自上世紀(jì)80年代，在改革開放和經(jīng)濟(jì)效益的驅(qū)動(dòng)下，我國(guó)的水產(chǎn)業(yè)取得了舉世矚目的成就， 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在我國(guó)的國(guó)民經(jīng)濟(jì)，特別是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有越來(lái)越重要的地位。2012年中 國(guó)的水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到5907.68萬(wàn)噸，漁業(yè)總產(chǎn)值8706.01億元，占中國(guó)農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的 9.73%。2013年我國(guó)水產(chǎn)品出口克服了國(guó)內(nèi)生產(chǎn)成本增加以及人民幣升值、世界經(jīng)濟(jì)尚未 完全擺脫低迷局面、貿(mào)易壁皇增多等不利因素影響，實(shí)現(xiàn)了出口的較快增長(zhǎng)，水產(chǎn)品出口額 首次突破200億美元，再創(chuàng)歷史新高，連續(xù)12年位居全球首位。
[0003] 集約化生產(chǎn)在提高經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也帶來(lái)新的問(wèn)題，如養(yǎng)殖污水排放量劇增等一 系列環(huán)境問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年，全國(guó)廢水排放量684.8億噸，其中水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)氨氮排放量 2.3萬(wàn)噸，排放化學(xué)需氧量54.8萬(wàn)噸。水產(chǎn)養(yǎng)殖中，投放的餌料只有少部分被魚類吸收，大部 分則直接排放到水體中。由于殘餌和魚類代謝物不能及時(shí)清除而沉積水底，導(dǎo)致水體缺氧、 水質(zhì)惡化。養(yǎng)殖污水中富含N、P等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直接排入水環(huán)境會(huì)造成水體富營(yíng)養(yǎng)化，污染水 體，還會(huì)造成水資源和能源的大量浪費(fèi)。研究表明，飼料中僅有13.9%的氮和25.4%的磷被 水產(chǎn)動(dòng)物利用，其他的氮磷富集在水體中或沉積在底泥中。1999-2000年，水產(chǎn)養(yǎng)殖污染事 件發(fā)生2067起，導(dǎo)致20億美元的經(jīng)濟(jì)損失。水質(zhì)的惡化主要表現(xiàn)在pH值、溶解氧、氨氮、亞硝 酸鹽、磷酸鹽、硫化物以及化學(xué)需氧量(C0D)等指標(biāo)的變化上。其中氨氮、亞硝酸鹽氮是水產(chǎn) 養(yǎng)殖環(huán)境中重要的污染脅迫因子。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)凈化的方法一般采用物理法、化學(xué)法或者生物法，但是 這些方法存在很多弊端。比如在養(yǎng)殖的間歇期，人們也常用干塘和清淤的方法去除池塘沉 積物中的污染物，但這種方法耗時(shí)耗力，成本較高。近年來(lái)，有益微生物因其生長(zhǎng)繁殖快、比 面值大、吸收轉(zhuǎn)化快、適應(yīng)性強(qiáng)以及種類多、分布廣等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用。但是，目前所用微生 態(tài)制劑存在有益菌株種類偏少、有效活菌數(shù)目低、不耐高溫、耐鹽范圍較窄等缺陷，不能完 全滿足生產(chǎn)實(shí)踐中的需要，從而制約了微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)凈化上的應(yīng)用。
[0005] 枯草芽孢桿菌能夠改善有害藍(lán)藻泛溢造成的水質(zhì)渾濁問(wèn)題，水質(zhì)由渾變清，具有 很強(qiáng)的凈化水質(zhì)功能，具有較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)素降解， 使水產(chǎn)類動(dòng)物對(duì)飼料的吸收利用更加充分。
[0006] 枯草芽孢桿菌可以減少對(duì)蝦病害發(fā)生，可以大大提高對(duì)蝦產(chǎn)量，從而提高經(jīng)濟(jì)效 益，生物環(huán)保，刺激水產(chǎn)動(dòng)物免疫器官的發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體免疫力;減少對(duì)蝦病害發(fā)生，明顯提 高對(duì)蝦產(chǎn)量，從而提高經(jīng)濟(jì)效益，凈化水質(zhì)，無(wú)污染，無(wú)殘留。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SC228 及其用途。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌SC228,其保藏名稱為:枯 草芽孢桿菌SC228 Bacillus subtilisSC228,保藏號(hào)為:CCTCC Ν0:Μ 2016304。
[0009] 本發(fā)明還同時(shí)提供了上述枯草芽孢桿菌SC228的用途:作為硝化功能菌。
[0010] 作為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌SC228的用途的改進(jìn):去除水體中的氨態(tài)氮。水體為養(yǎng) 殖水體。
[0011] 該菌株在LB固體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，瓊脂16g/L， 其余為水;PH7.0，121°C滅菌20分鐘)平板上菌落直徑為2.5-3.0mm，菌落表面粗糙褶皺、不 透明，不閃光，擴(kuò)張，邊緣不整齊，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭，菌 株數(shù)量可高達(dá)1 X l〇8cfu/g以上。
[0012] 菌株SC228在好氧條件下，在24h內(nèi)可去除50mg/L氨態(tài)氨及100mg/L亞硝酸態(tài)氮。
[0013] 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌SC228具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
[0014] 1 )、培養(yǎng)方便，生長(zhǎng)速度快；
[0015] 2)、培養(yǎng)發(fā)酵后的活菌菌株數(shù)目高；
[0016] 3)、該菌可有效去除養(yǎng)殖水體中的氨態(tài)氮、亞硝酸態(tài)氮，從而顯著改善水質(zhì)。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0018] 實(shí)施例1、枯草芽孢桿菌SC228的獲得
[0019] 1、菌的分離純化
[0020] 取草魚池水，稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基（蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物 5g/L，瓊脂16g/L，其余為水;pH7.0，121°C滅菌20分鐘)表面連續(xù)劃線培養(yǎng)，選擇那些形態(tài)不 一樣的菌落，重復(fù)幾次后便可形成單獨(dú)孤立的菌落，因而獲得純培養(yǎng)菌株。
[0021] 2、菌株的初篩
[0022]根據(jù)不同含氮化合物的化學(xué)性質(zhì)，用相應(yīng)的顯色劑分別與每株菌利用三種氮源后 產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物(含氮化合物)進(jìn)行顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色的有無(wú)或深淺，定性地鑒定該菌種 是否參與水體氮轉(zhuǎn)化以及在氮循環(huán)中的具體作用。
[0023] 具體如下：
[0024] 1)、亞硝酸鹽氮的定性檢測(cè):培養(yǎng)液用亞硝酸鹽顯色劑點(diǎn)樣，若出現(xiàn)紅色則說(shuō)明培 養(yǎng)液中存在亞硝酸鹽氮，且顏色越深濃度越大。
[0025] 2)、氨氮的定性檢測(cè)：用鈉氏試劑點(diǎn)樣，若出現(xiàn)黃色反應(yīng)，說(shuō)明培養(yǎng)液中存在氨氮， 且顏色越深濃度越大。
[0026] 3)、硝酸鹽氮的定性檢測(cè)：
[0027] (1)對(duì)于含有亞硝酸鹽的培養(yǎng)液檢測(cè)硝酸鹽時(shí)：
[0028] 對(duì)于lmL培養(yǎng)液中殘余的亞硝酸鹽(濃度<150mg/L)，加入lmol/L的鹽酸50yL，混 勻，加入50g/L的氨基磺酸銨溶液50yL，混勻，以消除亞硝酸鹽對(duì)硝酸鹽顯色的影響。將2yL 的該培養(yǎng)液滴入l〇yL的二苯胺溶液中，根據(jù)是否顯示藍(lán)色及藍(lán)色的深淺，初步判斷培養(yǎng)液 中硝酸鹽含量的多少。
[0029] (2)對(duì)于不含有亞硝酸鹽的培養(yǎng)液檢測(cè)硝酸鹽時(shí)：
[0030]對(duì)于lmL的待檢測(cè)培養(yǎng)液，由于已知培養(yǎng)液中不含有亞硝酸鹽，直接將2yL的該培 養(yǎng)液滴入l〇yL的二苯胺溶液中，根據(jù)是否顯示藍(lán)色及藍(lán)色的深淺，初步判斷培養(yǎng)液中硝酸 鹽含量的多少。
[0031] 從中篩選出能夠降氨氮和亞硝酸鹽氮的菌株。
[0032] 測(cè)定方法采用國(guó)家環(huán)?？偩滞扑]方法（國(guó)家環(huán)保局，2002)。
[0033] 3、菌株復(fù)篩
[0034] 經(jīng)初篩的菌株涂布于BTB培養(yǎng)基（檸檬酸鈉5.66g、Na2HP〇4 7.9g、NaN03 0.8415g/ NaN02 0.683g/NH4Cl 0.5296g、KH2P〇4 1.5g、Mg2S〇4,7H20 O.Olg、微量元素溶液2mL、去離 子水1000mL、pH 7.2，121°C滅菌20分鐘)上進(jìn)行復(fù)篩，得到一株硝化效果較好的菌，命名為 SC228〇
[0035] 4、采用甘油保藏法
[0036]在滅菌的菌種管中，加入1.0ml細(xì)菌培養(yǎng)液，0.5ml 50 % (體積濃度）的甘油，混勻 后于-80°C冰箱保存。
[0037] 5、菌種鑒定
[0038] (1)形態(tài)特征
[0039]枯草芽孢桿菌SC228在LB固體培養(yǎng)基（蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/ L，瓊脂16g/L，其余為水;pH7.0，121°C滅菌，20分鐘)平板上菌落直徑為2.5-3.0mm，菌落表 面粗糙褶皺、不透明，不閃光，擴(kuò)張，邊緣不整齊，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)， 常形成皺醭。
[0040] (2)16S rDNA序列分析
[00411對(duì)分離篩選到菌株SC228進(jìn)行進(jìn)一步的16S rDNA序列分析與比對(duì)。引物序列如下： 上游引物（P1) : 5' -AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3 ' 下游引物（P6) : 5' -TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3 '，由生工生物工程(上海)有限公司合成。以篩選得到的 菌株的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（50L)為：10 X Buf f er 5. OyL，上下游引物各 1 · OyL，dNTP 4 · OyL，Taq酶0 · 5yL，模板 1 · OyL，ddH20 37 · 5yL;反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min， 94°(：，變性508,52°(：退火603,72°(：延伸1111丨11308，共30個(gè)循環(huán)。目的片斷按照常規(guī)方法 (Sambrook，et al. ,2001)進(jìn)行克隆和序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與GenBank中所登錄的16S rDNA 序列（登錄號(hào):％_000964.3、％_016047.1和％_001766.1等)進(jìn)行比對(duì)分析，基因同源性達(dá) 到99% 以上。根據(jù)《Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology》（Holt，J.G·， Gibbons，N.E. ,1994)和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英等，2001)，通過(guò)性態(tài)特 征和16S rDNA序列分析，確定菌株SC228為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
[0042] 將該菌株SC228進(jìn)行了保藏，保藏名稱為：枯草芽孢桿菌SC228Bacillus subti 1 isSC228，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué);保藏 日期：2016.6.2,保藏號(hào)：CCTCC NO:M 2016304。
[0043] 實(shí)施例2、
[0044] 按1%(v/v)的比例將菌株SC228接種于LB液體培養(yǎng)基中（蛋白胨10g/L，NaCl 10g/ 1^，酵母浸出物58/1^，其余為水；？!17.0，121°(：滅菌，20分鐘），35°(：培養(yǎng)24小時(shí)后，4°(：、 5000rpm/min離心，取菌沉淀，50°C恒溫干燥6~8小時(shí)，與玉米淀粉按4: l(w:w)混合而制成 干菌粉一枯草芽孢桿菌SC228菌粉，每克菌粉活菌數(shù)為1.0 X 108cfu。
[0045]實(shí)施例3、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SC228對(duì)模擬養(yǎng)殖廢水的凈化作用 [0046] 在6個(gè)1000L錐形瓶中分別裝入500ml模擬廢水，其中C/N為4,氨氮20mg/L，亞硝酸 鹽氮10mg/L，硝酸鹽氮1 Omg/L。向模擬廢水中按照1 X 108cf u/m3的終濃度添加枯草芽孢桿菌 SC228菌粉作為實(shí)驗(yàn)組，以不添加菌粉為對(duì)照組，每組三個(gè)重復(fù)。用納氏試劑光度法測(cè)定氨 氮(NH4+-N)、N-(1-萘基)-乙二胺光度法測(cè)定亞硝酸鹽氮(MV-N)、紫外分光光度法測(cè)定硝 酸鹽氮(N〇3--N)。2處后檢測(cè)到：
[0047] 實(shí)驗(yàn)組：
[0048] 氨氮(NH/-N)的濃度為:0 · 18mg/L，亞硝酸鹽氮(N02--N)的濃度為:5 · 07mg/L，硝酸 鹽氮(N〇3_-N)的濃度為:4.89mg/L。
[0049] 對(duì)照組：
[0050] 氨氮(NH/-N)的濃度為：19 · 29mg/L，亞硝酸鹽氮(N02--N)的濃度為：12 · 72mg/L，硝 酸鹽氮(N〇3--N)的濃度為：10 · 67mg/L。
[0051]因此，枯草芽孢桿菌SC228有明顯降低水中氨氮的效果，改善了水質(zhì)，適合于作為 水質(zhì)凈化劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上應(yīng)用。
[0052] 實(shí)施例4、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SC228對(duì)養(yǎng)殖水體的調(diào)控
[0053]將6個(gè)容量為2000L的PE桶，隨機(jī)分成2組(對(duì)照組和試驗(yàn)組），每組三個(gè)重復(fù)。每桶 注入1400L的浙江省紹興縣孫端鎮(zhèn)大畈河(經(jīng)煒度:3(^037 38^,12(^4(/52^)河水，其中氨 氮含量為〇. 35mg/L，亞硝酸鹽氮含量為0.075mg/L，化學(xué)需氧量COD為27.03mg/L，可溶性總 磷含量為〇. 148mg/L。草魚用2.5 %的食鹽水進(jìn)行浸泡消毒，飼養(yǎng)10d后，選取平均體重約50g 的草魚120尾，隨機(jī)分為兩組，每組設(shè)3個(gè)平行重復(fù)，每個(gè)平行草魚20尾:對(duì)照組在水中不添 加任何菌，處理組向水中按照1 X 108cfu/m3添加枯草芽孢桿菌SC228菌粉，二組均飼喂基礎(chǔ) 日糧。3天后分別檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組的水質(zhì)指標(biāo)變化，具體如表1所示。
[0054]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨氮去除率為95.4%。表明，枯草芽孢桿菌SC228有明顯降低水中氨氮 含量的效果，可改善養(yǎng)殖水質(zhì)，適合于作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的水質(zhì)凈化劑。
[0055]表 1
[0057] 對(duì)比例1、將下述枯草芽孢桿菌（具體如表1所述）替代本發(fā)明的枯草芽孢桿菌 SC228,添加濃度仍為lX108cfu/m3,檢測(cè)時(shí)間仍為24小時(shí);其余等同于實(shí)施例3。所得結(jié)果與 本發(fā)明的對(duì)比如表2所述。
[0058] 表2

[0061]以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還 可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有 變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 枯草芽孢桿菌SC2 28,其特征是，保藏名稱為：枯草芽孢桿菌SC2 28Bacillus subtilisSC228,保藏號(hào)為：CCTCC NO:M 2016304。2. 如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌SC228的用途，其特征是:作為硝化功能菌。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的枯草芽孢桿菌SC228的用途，其特征是:去除水體中的氨態(tài)氮。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌SC228的用途，其特征是:所述水體為養(yǎng)殖水體。
【文檔編號(hào)】C02F103/20GK105969708SQ201610615066
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年8月1日
【發(fā)明人】李衛(wèi)芬, 沈文英, 張小平, 王佰魁, 王冰, 王一冰
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué), 紹興文理學(xué)院