專利名稱：一種磁性復(fù)合微球固定化漆酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種磁性復(fù)合微球固定化漆酶和該固定化漆酶的制備方法。更具體的說是制備一種可快速磁性分離，操作穩(wěn)定性良好的磁性復(fù)合微球固定化漆酶。
背景技術(shù)：
漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在多種生物體內(nèi)。漆酶可以催化空氣中的氧氣直接氧化分解各種酚類染料、取代酚、氯酚、硫酚、雙酚A、芳香胺等，在漆酶介體 (ABTS、HBT等)存在下，漆酶還可以催化降解與木質(zhì)素相關(guān)的二苯基甲烷、N-取代對苯基二胺、有機(jī)磷化合物(農(nóng)藥)及二噁英等。由于具有相當(dāng)廣泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性，漆酶在造紙工業(yè)、廢水處理、生物漂白、芳香化合物轉(zhuǎn)化、生物傳感器構(gòu)建及食品工業(yè)等方面具有重要的使用價值。但由于漆酶是由蛋白質(zhì)組成，其高級結(jié)構(gòu)對所處環(huán)境十分敏感， 在使用過程中易受環(huán)境條件變化影響而導(dǎo)致變性失活，特別是游離酶與反應(yīng)產(chǎn)物混合在一起，反應(yīng)后不能回收，難以實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用。而對酶進(jìn)行固定后制成的固定化酶能克服上述缺點(diǎn)。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時，還存在穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)及可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點(diǎn)。制備固定化酶的關(guān)鍵在于載體的選擇，文獻(xiàn)報導(dǎo)較多的可用于生物酶的固定化載體主要有表面富含功能基團(tuán)的有機(jī)載體和機(jī)械穩(wěn)定性較好的無機(jī)載體等。但這些載體材料普遍存在著合成價格昂貴，加工工藝復(fù)雜，分離效果差等缺點(diǎn)。近年來，隨著磁性分離技術(shù)的日益發(fā)展，磁性粒子用于生物酶的固定化逐漸受到人們的廣泛關(guān)注。然而磁性納米粒子具有高比表面積、高比表面能，以及粒子各向異性的偶極矩作用從而很容易團(tuán)聚，而且裸露的磁性材料耐酸堿性能差，在空氣中容易氧化變質(zhì)，從而導(dǎo)致不能形成穩(wěn)定的分散體系，使其在磁性分離的應(yīng)用中受到了限制。這就要求對于這些磁性材料進(jìn)行改性，通常需要在外面包裹上保護(hù)層，以提高磁性材料的抗氧化能力，得到分散性較好的復(fù)合粒子。二氧化硅具有很好的生物相容性，良好的耐酸堿、耐有機(jī)溶劑及耐高溫特性，對磁性納米粒子的表面修飾可以降低其表面能，提高粒子的抗氧化能力，得到分散性好的納米復(fù)合粒子，同時可用各種硅烷偶聯(lián)劑在其表面引入各種官能基以用于酶等生物大分子的固定化。因此，二氧化硅包覆磁性粒子有無可比擬的優(yōu)勢。近年來，固定化酶技術(shù)的研究得到了蓬勃的發(fā)展，目前用于固定化酶的方法主要有吸附法、交聯(lián)法、共價鍵結(jié)合法、包埋法等。其中，交聯(lián)法和共價鍵結(jié)合法因反應(yīng)條件較為劇烈，酶活力損失較大；包埋法由于底物結(jié)合部位和活性中心受載體封閉因而酶活損失較大；吸附法具有條件溫和、酶活力部位及其空間構(gòu)象不易被破壞的特點(diǎn)，但吸附法中由離子鍵、氫鍵、偶極鍵及疏水鍵固定的酶易受反應(yīng)介質(zhì)的PH、離子強(qiáng)度等的影響而從載體上脫落。而采用金屬螯合載體以配位作用固定化酶則能克服目前常用固定化方法中的一些不足。它利用金屬螯合配體與蛋白質(zhì)表面的供電子氨基酸-組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰醇基等以配位作用固定酶，酶與載體結(jié)合牢固不易脫落，同時避免了交聯(lián)劑的使用對酶分子造成的化學(xué)損傷，更大程度上保持了酶分子的天然構(gòu)象，可以更大限度保留酶活。
因此，在本發(fā)明中，通過在磁性二氧化硅表面螯合一種過渡金屬離子(如Cu2+、 Zn2\ Ni2+或Co2+)制得可固定漆酶的功能化磁性載體，以該載體通過配位作用固定化漆酶， 該固定化漆酶不僅可以在外界磁場作用下實(shí)現(xiàn)快速分離，可回收反復(fù)使用，同時也增強(qiáng)了漆酶的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可快速磁性分離回收，操作穩(wěn)定性良好的磁性復(fù)合微球固定化漆酶。本發(fā)明的又一目的在于提供上述固定化漆酶的制備方法。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種磁性復(fù)合微球固定化漆酶，以表面螯合一種過渡金屬離子(如Cu2+、Zn2\ Ni2+ 或Co2+)的磁性復(fù)合微球?yàn)檩d體，利用金屬螯合配體與蛋白質(zhì)表面供電子氨基酸間的相互作用將漆酶固定在該載體上。一種磁性復(fù)合微球固定化漆酶的制備方法，該方法包括兩個步驟載體制備和漆酶固定。載體制備步驟包括(1)將溶有FeCl2 ·4Η20和FeCl3 ·6Η20混合物的十二烷基磺酸鈉水溶液均勻混合， 在攪拌條件下滴加2-5mol/L NaOH溶液至混合液pH為10-12，所得產(chǎn)物在80-100°C水浴中熟化30-60min后，在50_70°C下烘干，通過研磨得到四氧化三鐵粉末；(2)將四氧化三鐵粉末超聲分散于二次水中，攪拌下加入正硅酸乙酯和甲醇的混合溶液，持續(xù)攪拌15min后滴加濃氨水，繼續(xù)攪拌反應(yīng)4小時，50-70°C下烘干，得到核殼結(jié)構(gòu)磁性二氧化硅粉末；(3)將磁性二氧化硅粉末和Y-氯丙基三甲氧基硅烷溶于甲醇和丙三醇混合溶液中，80°C下攪拌反應(yīng)3小時后，50-70°C下烘干，得到硅烷化的磁性二氧化硅；(4)將1.4g硅烷化的磁性二氧化硅與175mL 0. 5-10mg/L的一種含羰基或氨基的聚合物溶液在50°C下攪拌反應(yīng)3小時，50-70°C下烘干；將0. 5g該烘干粉末與75mL 0. 02-0. 3mol/L含一種過渡金屬離子(如Cu2+、Zn2\ Ni2+或Co2+)的硫酸鹽溶液混合震蕩， 溫度為25-30°C，震蕩時間8-12小時，然后在50-70°C下烘干即得載體成品。漆酶固定步驟包括將經(jīng)載體制備步驟制得的載體成品與溶于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液的游離漆酶5mL充分混合，在pH為2. 5-6. 0、溫度為5_55°C條件下攪拌1_16小時，4°C條件下靜置 8-12小時后，用pH為3. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液多次洗滌，直至洗滌液中沒有蛋白檢出，再經(jīng)低溫真空干燥制得固定化漆酶成品。在上述過程中，載體制備步驟(1)中所述的溶有狗(12*4!120和!^(13*6!120混合物的十二烷基磺酸鈉水溶液的組成為0. 25mol/L的FeCl2 · 4H20、0. 45-0. 5mol/L的 FeCl3 ·6Η20、0. 2-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的十二烷基磺酸鈉；載體制備步驟( 中所述的甲醇、二次水和濃氨水的組成為80-120體積份的甲醇、40-60體積份的二次水、4-6體積份的濃氨水， 四氧化三鐵粉末的濃度為8. 06g/L,正硅酸乙酯的濃度為16. 12-32. 24g/L ；載體制備步驟 (3)中所述的磁性二氧化硅粉末的質(zhì)量為1. 5g，Y-氯丙基三甲氧基硅烷的體積為5-10mL， 甲醇和丙三醇的體積分別為87. 5mL和37. 5mL ；載體制備步驟中所述的一種含羰基或氨基的聚合物為聚丙烯酰胺或聚乙烯亞胺；漆酶固定步驟中，溶于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液的游離漆酶濃度是0. 2-1. 4g/L，游離漆酶和載體成品的混合比例為10-70mg/lg。本發(fā)明的特點(diǎn)是(1)漆酶固定化過程中不使用交聯(lián)劑，避免了交聯(lián)劑對酶分子造成的化學(xué)損傷，酶以配位作用固定在載體上可以更大程度上保持酶分子的天然構(gòu)象，更大限度保留酶活。(2)所制備的固定化漆酶在磁場作用下可從反應(yīng)體系中迅速分離，有利于回收和反復(fù)利用，顯著提高了固定化漆酶的操作穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式
以下以具體實(shí)施例來說明具體實(shí)施方式
。實(shí)施例1一種磁性復(fù)合微球固定化漆酶，制備方法主要包括兩個步驟載體制備(1)取摩爾比為1 2的FeCl2 ·4Η20和FeCl3 ·6Η20的混合粉末溶于50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的十二烷基磺酸鈉溶液中，攪拌下滴加2mol/l的NaOH溶液將pH調(diào)至12左右。 所得產(chǎn)物在80°C水浴中熟化30min后，利用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，50°C下烘干、研磨得四氧化三鐵粉末；(2)取研磨后的Fii3O4 1. 5g超聲分散于60ml 二次水中，同時將6. 4ml四乙氧基硅烷超聲分散于120ml甲醇中，在機(jī)械攪拌下將四乙氧基硅烷的甲醇溶液加入到!^e3O4的懸浮液中，劇烈攪拌15min后加入6ml濃氨水，繼續(xù)在室溫下攪拌反應(yīng)4小時，分別用甲醇、二次水洗滌固體沉淀物至中性，50°C下烘干，得到核殼結(jié)構(gòu)磁性二氧化硅粉末；(3)取1.5g磁性二氧化硅粉末分散于37. 5ml甲醇中，超聲分散20min后加入 37. 5ml甘油，再超聲分散IOmin后放入250ml三口燒瓶中；同時將5mL γ -氯丙基三甲基硅烷分散于50ml甲醇中，混合均勻后亦加入至該三口燒瓶中，與磁性二氧化硅混合均勻， 80°C下攪拌反應(yīng)3小時，分別用甲醇，二次水洗滌固體沉淀6次，50°C下烘干，得到硅烷化的磁性二氧化硅；(4)將1. 4g硅烷化的磁性二氧化硅與175mLang/L的聚丙烯酰胺溶液在50°C下攪拌反應(yīng)3小時，50°C下烘干；取0. 5g該烘干粉末與75mL 0. 2mol/L硫酸銅溶液在30°C下震蕩10小時，50°C下烘干即得載體成品。漆酶固定取0. Ig載體成品與溶于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液的游離漆酶5mL充分混合， 在PH為4. 0、溫度為25°C條件下攪拌1小時，4°C條件下靜置8小時后，用pH為3. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液多次洗滌，直至洗滌液中沒有蛋白檢出，再經(jīng)低溫真空干燥制得固定化漆酶成品。其中游離漆酶和載體成品的混合比例為35mg/lg。實(shí)施例2載體的制備方法如例1，所不同的是聚丙烯酰胺濃度為0. 5mg/L，硫酸銅溶液的濃度為0. lmol/L，振蕩時間為12小時。漆酶固定方法如例1，所不同的是0. Ig載體成品與溶于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液的游離漆酶5mL充分混合后，在pH為3. 0、溫度為5°C條件下攪拌3小時。其中游離漆酶和載體成品的混合比例為20mg/lg。
實(shí)施例3載體制備方法如例1，所不同的是聚丙烯酰胺濃度為5mg/L，硫酸銅溶液的濃度為 0. 05mol/L，振蕩時間為8小時；漆酶固定方法如例1，所不同的是0. Ig載體成品與溶于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液的漆酶5mL充分混合后，在pH為5. 0、溫度為15°C條件下攪拌 5小時。其中游離漆酶和載體成品的混合比例為50mg/lg。
權(quán)利要求
1.一種磁性復(fù)合微球固定化漆酶，其特征在于，以表面螯合一種過渡金屬離子(如 Cu2+、Zn2\ M2+或Co2+)的磁性復(fù)合微球?yàn)檩d體，利用金屬螯合配體與蛋白質(zhì)表面供電子氨基酸間的相互作用將漆酶固定在該載體上。
2.—種權(quán)利要求1所述磁性復(fù)合微球固定化漆酶的制備方法，該方法包括兩個步驟 載體制備和漆酶固定。其中載體制備步驟包括(1)將溶有FeCl2· 4H20和FeCl3 · 6H20混合物的十二烷基磺酸鈉水溶液均勻混合，在攪拌條件下滴加2-5mol/L NaOH溶液至混合液pH為10-12，所得產(chǎn)物在80-100°C水浴中熟化30-60min后，在50_70°C下烘干，通過研磨得到四氧化三鐵粉末；(2)將四氧化三鐵粉末超聲分散于二次水中，攪拌下加入正硅酸乙酯和甲醇的混合溶液，持續(xù)攪拌15min后滴加濃氨水，繼續(xù)攪拌反應(yīng)4小時，50-70°C下烘干，得到核殼結(jié)構(gòu)磁性二氧化硅粉末；(3)將磁性二氧化硅粉末和Y-氯丙基三甲氧基硅烷溶于甲醇和丙三醇混合溶液中， 80°C下攪拌反應(yīng)3小時后，50-70°C下烘干，得到硅烷化的磁性二氧化硅；(4)將1.4g硅烷化的磁性二氧化硅與175mL0. 5_10mg/L的一種含羰基或氨基的聚合物溶液在50°C下攪拌反應(yīng)3小時，50-70°C下烘干；取0. 5g該烘干粉末與75mL 0. 02-0. 3mol/L含一種過渡金屬離子(如Cu2+、Zn2\ Ni2+或Co2+)的硫酸鹽溶液混合震蕩， 溫度為25-30°C，震蕩時間8-12小時，然后在50-70°C下烘干即得載體成品。漆酶固定步驟包括將經(jīng)載體制備步驟制得的載體成品與溶于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液的游離漆酶 5mL充分混合，在pH為2. 5-6. 0、溫度為5_55°C條件下攪拌1-16小時，4°C條件下靜置8_12 小時后，用pH為3. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液多次洗滌，直至洗滌液中沒有蛋白檢出，再經(jīng)低溫真空干燥制得固定化漆酶成品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的方法，其特征在于載體制備步驟(1)中所述的溶有 FeCl2 · 4H20和FeCl3 · 6H20混合物的十二烷基磺酸鈉水溶液的組成為0. 25mol/L的 FeCl2 · 4H20、0. 45-0. 5mol/L 的 FeCl3 · 6H20、0. 2-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的十二烷基磺酸鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的方法，其特征在于載體制備步驟( 中所述的甲醇、二次水和濃氨水的組成為80-120體積份的甲醇、40-60體積份的二次水、4-6體積份的濃氨水，四氧化三鐵粉末的濃度為8. 06g/L，正硅酸乙酯的濃度為16. 12-32. 24g/L0
5.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的方法，其特征在于載體制備步驟(3)中所述的磁性二氧化硅粉末的質(zhì)量為1. 5g，Y-氯丙基三甲氧基硅烷的體積為5-10mL，甲醇和丙三醇的體積分別為 87. 5mL 和 37. 5mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的方法，其特征在于載體制備步驟中所述的一種含羰基或氨基的聚合物為聚丙烯酰胺或聚乙烯亞胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的方法，其特征在于漆酶固定步驟中，溶于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液的游離漆酶濃度為0. 2-1. 4g/L，游離漆酶和載體成品的混合比例為 10-70mg/lg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種磁性復(fù)合微球固定化漆酶及其制備方法，屬于環(huán)境微生物領(lǐng)域。該固定化漆酶是以金屬螯合的磁性復(fù)合微球?yàn)檩d體，通過配位鍵合作用將漆酶固定在該載體上。其制備方法包括兩個步驟載體制備和漆酶固定。載體制備是先利用化學(xué)沉淀法合成磁性四氧化三鐵納米粒子，以該納米粒子為核，利用溶膠-凝膠法制得核殼式磁性二氧化硅，再以γ-氯丙基三甲氧基硅烷為媒介，在磁性二氧化硅表面接枝一種含羰基或氨基的聚合物，然后通過螯合一種過渡金屬離子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+或Co2+)制得可固定漆酶的功能化載體；漆酶固定是將漆酶配位吸附在該載體表面，再經(jīng)洗滌、干燥得到固定化漆酶成品。采用本發(fā)明方法制備得到的固定化漆酶穩(wěn)定性好、活性高，具有快速磁響應(yīng)性能，易從反應(yīng)體系中回收、可反復(fù)多次使用，制備過程簡單，成本低廉。
文檔編號C12N11/14GK102206624SQ201110094749
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者于光認(rèn), 沈珍瑤, 王穎, 賀芙蓉, 陳曉春 申請人:北京師范大學(xué)