專利名稱：H5、h7、h9亞型禽流感病毒檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，確切地說是H5、H7、H9亞型禽流感病毒檢測試劑盒
背景技術(shù)：
禽流感(Avian influenza, Al)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一種禽類的急性、烈性傳染病，除了可感染禽類外，還可感染人、豬和馬等多種動物，被OIE列為A類傳染病。禽流感病毒(AIV)屬于A型流感病毒，禽流感病毒(AIV)變異頻繁，血清亞型眾多。 根據(jù)HA抗原性差異分為16個HA亞型?？乖儺愋詮?qiáng)，宿主范圍廣泛，亞型間無交叉保護(hù)性，使得禽流感頻繁暴發(fā)，成為養(yǎng)禽業(yè)的一大毀滅性疾病。高致病性禽流感主要是由H5或H7亞型AIV引起的，潛伏期極短，突然爆發(fā)，多不見任何臨床癥狀而突然死亡，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)100 %，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失， 另外還可感染人，甚至導(dǎo)致死亡。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，截止到2009年5月22日， 全世界共有H5W亞型禽流感病毒感染人似9例，死亡262例；我國共有感染病例38例，死亡25例。目前，我國部分地區(qū)以H9亞型為主的中低致病力禽流感的流行，能造成雞產(chǎn)蛋量下降，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，這一點已引起國內(nèi)各界的廣泛關(guān)注。所以早期快速檢測無疑是預(yù)防、控制禽流感的前提條件，尤其是針對H5、H7和H9亞型的AIV。病毒分離、血清學(xué)試驗至今仍是診斷AI和對AIV進(jìn)行定型普遍采用的方法。但這些方法操作繁瑣復(fù)雜；難以對AI進(jìn)行快速診斷；十分不利于AI的防治。自從美國PE-Cetus公司的人類遺傳研究室Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以來，PCR已經(jīng)成為了分子生物學(xué)領(lǐng)域最基本也是最重要的技術(shù)手段之。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外基因擴(kuò)增技術(shù)，可以在數(shù)小時內(nèi)對某段基因進(jìn)行擴(kuò)大數(shù)百萬倍。該技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感性高。為 AIV早期快速診斷提供了敏感、快速、實用的方法。多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR)技術(shù)其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般 PCR相同。但與多個單項PCR相比，多重PCR具有以下顯著的優(yōu)點高效性，它可在同一 PCR 管內(nèi)同時擴(kuò)增多個靶基因，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進(jìn)行分型；系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于多種病原體的同時檢測，如肝炎病毒、腸道致病性細(xì)菌和無芽孢厭氧菌的同時檢測；經(jīng)濟(jì)簡便性，多個靶基因在同一反應(yīng)管內(nèi)同時擴(kuò)增，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。自從1988年首次報道以來，作為一種臨床和實驗室快速篩選技術(shù)，多重PCR已經(jīng)成功應(yīng)用到很多領(lǐng)域，如基因缺失、突變和多態(tài)性的分析、 RNA檢測和基因組測序分析。各類PCR成功的關(guān)鍵在于設(shè)計出合理的引物，合適的引物是決定PCR擴(kuò)增特異性和敏感性的關(guān)鍵。多重PCR對引物的要求更加嚴(yán)格，以便同時檢測出多種病原微生物。多重PCR的各對引物必須具有相近的退火溫度，使得所有的靶位點可以用相同的 PCR程序在單個的反應(yīng)中得到有效的擴(kuò)增。而其之間不能形成穩(wěn)定二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。同時保證了擴(kuò)增產(chǎn)物的大小能夠通過電泳分開。雖然有很多能幫助設(shè)計引物的軟件，例如“Premier Primer 5.0”、“01io 6”、“Vector N TI Suit”、“DNASiS”和“DNAstar”都帶有引物自動搜索功能，但搜索結(jié)果并不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自動搜索的基礎(chǔ)上，還要各軟件搭配使用。盡管上述軟件能夠?qū)椭O(shè)計引物，但它畢竟是在科技人員大量研究成果的基礎(chǔ)上，設(shè)計出的固定程序。人工分析、實際操作經(jīng)驗是必不可少的?？煽康亩嘀豍CR檢測體系， 還要通過科技人員大量試驗驗證、篩選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用多重RT-PCR可同時檢測H5、H7、H9亞型禽流感病毒的H5、H7、H9亞型禽流感病毒檢測試劑盒。H5、H7、H9亞型禽流感病毒檢測試劑盒，它是由RNA反轉(zhuǎn)錄體系，以及PCR反應(yīng)體系組成，其中引物為P5--15'-CCAATCCAGCCAATGACC-3
P5--25'-TCTATGGCAACCCTTCTT-3
P7--15'-GAGTCAATGGACTTCACC-3
P7--25'-AGGTTCGGTCTGCTCGCT-3
P9--15'-TCTATGGCAACCCTTCTTGT--3
P9--25'-TATAACCCTGACCAACCTCC--3所述的反轉(zhuǎn)錄體系還包括引物P5-1、P7_1和P9-1 ；所述的引物還包括P9 內(nèi)-1:5' -ACAAGCAAAGCATGCTCAGG-3‘P9 內(nèi)-2:5' -ACAAGATAACATCCAAAGTA-3所述的反轉(zhuǎn)錄體系為雙蒸水2. 7 μ L、反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2. 0 μ L、三磷酸脫氧核糖核苷1. 0 μ L、反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑0. 3 μ L、反轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ L及三種亞型上游引物各0. 5 μ L的 IOuL反轉(zhuǎn)錄體系；所述的PCR體系為雙蒸水四.7 μ LU0XPCR緩沖液5. 0 μ L、三磷酸脫氧核糖核苷 4. 0 μ L、DNA 聚合酶 0. 5 μ L 及引物 Ρ5-2、Ρ5-2、Ρ7-1、Ρ7-2、Ρ9-1 和 Ρ9-2 各 0. 8 μ L 的 50 μ L的反應(yīng)體系。本發(fā)明提供的Η5、Η7、Η9亞型禽流感病毒檢測試劑盒，在GenBank中搜索三種亞型 HA基因序列，設(shè)計特異性引物。經(jīng)過大量的試驗和實際檢測，篩選、優(yōu)化出3對引物及其反應(yīng)體系，所擴(kuò)增的cDNA片段大小分別為427、312、和826bp。結(jié)果表明，通過對多重RT-PCR 擴(kuò)增條件的優(yōu)化，制成了同時檢測三種亞型AIV的多重RT-PCR檢測試劑盒，最低檢出量均為10pg。而對雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞新城疫病毒、雞白痢沙門氏菌病原核酸及正常組織不存在交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，對三種亞型檢測敏感性一致?；鶎訉嶒炇揖涂梢栽诙虝r間內(nèi)確診禽流感，定位到亞型，為禽流感的防控爭取了時間，及時采取措施，使禽流感傳播控制在盡可能小的范圍內(nèi)。


圖1為H9亞型AIV RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中，M =DNAMaker DL2000 1 外側(cè)引物擴(kuò)增條帶2:內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增條帶3:水對照；
圖2為三種亞型AIV的多重RT-PCR敏感性實驗擴(kuò)增結(jié)果，其中，M =DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1 為 IOng, 2 : lng, 3 : IOOpg, 4 為 IOpg, 5 為 Ipg
具體實施例方式實施例1禽流感病毒H5、H7和H9亞型標(biāo)準(zhǔn)毒株由哈爾濱獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室保存。雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)H52、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)B87、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)疫苗株、雞新城疫病毒(NDV)Lasota株、雞白痢沙門氏菌(SP) CVCC528，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)教研室保存。用Trizol提取病毒或疑似禽流感的病料(肺臟、淋巴結(jié)、脾臟)1 4g的總RNA， 提取過程中所有的器皿及消耗品均用DEPC水處理。(1)將收集好的尿囊液以4000rpm 4°C離心30min，棄沉淀，上清液移至新的 Eppendorf管中4°C IOOOOrpm超速離心2h，收集沉淀，以原尿囊液1/20體積的PBS (pH7. 4)
重懸毒液。(2)抽取濃縮病毒液250 μ L至滅菌的2. OmLEppendorf管中，加入750 μ L Trizol 裂解液，劇烈振蕩15s，室溫靜置15min。(3)加入200 μ L氯仿，振蕩1 充分混勻，室溫靜置5min，12000rpm離心15min。(4)取上清夜至新的1. 5mL Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫靜置 lOmin，12000rpm 離心 18min。(5)小心棄去上清液，加入75%乙醇(用DEPC水配制)混勻，洗滌沉淀，12000rpm 離心8min。(6)棄去上清液，將Eppendorf管置于超凈工作臺中通風(fēng)干燥沉淀5-lOmin。(7)加入滅菌的DEPC /K 20 μ L溶解沉淀。(8)將核酸分裝成每管5 μ 1，-70°C保存?zhèn)溆茫话聪卤矸磻?yīng)體系表1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系各組成成分Tabl Composition of reaction system for reverse transcription
Ix蒸水
反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液三磷酸脫氧核糖核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑反轉(zhuǎn)錄酶
三種亞型上游引物 RNA模板總計
2.7 μ 2.0 μ 1.0 μ 0.3 pL 0.5 μ 各 0.5 μL 2.0 μ ΙΟ.Ομ
注三種亞型上游引物見表2輕輕混勻，瞬離，按反應(yīng)條件42°C 45min，99°C 5min，4°C 5min結(jié)束，在PCR儀上設(shè)定程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；人工合成表2中引物表2多重RT-PCR弓丨物Tab. 2Multiplex RT-PCR primers
權(quán)利要求
1. H5、H7、H9亞型禽流感病毒檢測試劑盒，它是由RNA反轉(zhuǎn)錄體系，以及PCR反應(yīng)體系組成，其中引物為Ρ5-15'-CCAATCCAGCCAATGACC-3Ρ5-25'-TCTATGGCAACCCTTCTT-3Ρ7-15'-GAGTCAATGGACTTCACC-3‘Ρ7-25'-AGGTTCGGTCTGCTCGCT-3‘Ρ9-15'-TCTATGGCAACCCTTCTTGT-3‘Ρ9-25'-TATAACCCTGACCAACCTCC-3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Η5、Η7、Η9亞型禽流感病毒檢測試劑盒，其特征在于反轉(zhuǎn)錄體系為雙蒸水2. 7 μ L、反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2. 0 μ L、三磷酸脫氧核糖核苷1. 0 μ L、反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑0. 3 μ L、反轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ L及三種亞型上游引物各0. 5 μ L的10 μ L反轉(zhuǎn)錄體系。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Η5、Η7、Η9亞型禽流感病毒檢測試劑盒，其特征在于所述的反轉(zhuǎn)錄體系還包括引物Ρ5-1、Ρ7-1和Ρ9-1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的Η5、Η7、Η9亞型禽流感病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的引物還包括Ρ9 內(nèi)-1 :5' -ACAAGCAAAGCATGCTCAGG-3 ‘ Ρ9 內(nèi)-2 :5' -ACAAGATAACATCCAAAGTA-3。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的Η5、Η7、Η9亞型禽流感病毒檢測試劑盒，其特征在于所述的 PCR體系為雙蒸水29. 7 μ L、10 X PCR緩沖液5. 0 μ L、三磷酸脫氧核糖核苷4. 0 μ L、DNA聚合酶 0. 5μ L 及引物 Ρ5-2、Ρ5-2、Ρ7-1、Ρ7-2、Ρ9-1 和 Ρ9-2 各 0. 8 μ L 的 50 μ L 反應(yīng)體系。
全文摘要
本發(fā)明公開了H5、H7、H9亞型禽流感病毒檢測試劑盒，在GenBank中搜索三種亞型HA基因序列，設(shè)計特異性引物。經(jīng)過大量的試驗和實際檢測，篩選、優(yōu)化出3對引物及其反應(yīng)體系，所擴(kuò)增的cDNA片段大小分別為427、312、和826bp。結(jié)果表明，通過對多重RT-PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化，制成了同時檢測三種亞型AIV的多重RT-PCR檢測試劑盒，最低檢出量均為10pg。而對多種雞傳染病及正常組織不存在交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，對三種亞型檢測敏感性一致?；鶎訉嶒炇揖涂梢栽诙虝r間內(nèi)確診禽流感，定位到亞型，為禽流感的防控爭取了時間，及時采取措施，使禽流感傳播控制在盡可能小的范圍內(nèi)。
文檔編號C12Q1/68GK102260749SQ20111010329
公開日2011年11月30日 申請日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者張文惠, 張旺, 李影, 王鐵峰, 錢愛東 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)