專利名稱：大豆鋅指蛋白基因sctf-1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及植物低溫脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，確切地說是大豆鋅指蛋白基因SCTF-I及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
C2H2型鋅指蛋白廣泛的存在于各種植物中，國內(nèi)外有關(guān)植物C^2型鋅指蛋白的研究逐步增多，尤其是對(duì)擬南芥(Arabidopsis thaliana)，矮牽牛(Petunia hybrida Vilm) 以及水稻(Oryza sativa)等植物的研究較多。研究發(fā)現(xiàn)了多種與植物脅迫耐受相關(guān)的植物C^2型鋅指蛋白，例如，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)STZ基因，該基因能夠編碼一種雙鋅指結(jié)構(gòu)的C2H2型鋅指蛋白，轉(zhuǎn)STZ基因的煙草明顯提高了對(duì)冷及高鹽條件的耐受能力(Sakamoto et al. ,2000)；在矮牽牛中獲得的鋅指蛋白基因ZPT2-3，其翻譯產(chǎn)物同樣也含是具有雙鋅指結(jié)構(gòu)的C2H2型鋅指蛋白，轉(zhuǎn)ZPT2-3基因的煙草對(duì)干旱的耐受能力也得到明顯提高。國內(nèi)對(duì)植物C^2型鋅指蛋白研究較多的集中在水稻上，例如RZF71基因，RZF5基因等，這兩個(gè)基因所編碼的鋅指蛋白都能夠提高植物對(duì)滲透脅迫的耐受能力(郭書巧等，2007 ；郭書巧， 2006)。但是國內(nèi)外對(duì)于大豆鋅指蛋白的研究還比較少，分析較為明確的只有SC0F-1，其編碼的鋅指蛋白是典型的雙鋅指結(jié)構(gòu)的C^2型鋅指蛋白，能明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)低溫的耐受能力(Kim et al.，2001)。我們可以依據(jù)C2H2型鋅指蛋白的特性利用基因工程技術(shù)定向的提高植物對(duì)逆境的耐受能力，為穩(wěn)定農(nóng)作物的生長(zhǎng)具有重要價(jià)值和意義。大豆是我國重要的油料作物，低溫情況下對(duì)大豆的出苗率，生長(zhǎng)情況，產(chǎn)量都有非常重要的影響。至今從大豆中鑒定出來的C2H2型鋅指蛋白基因并不多，而研究較為透徹的只有大豆耐冷鋅指蛋白基因SC0F-1。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的大豆基因，大豆C2H2型鋅指蛋白基因SCTF-1。大豆鋅指蛋白基因SCTF-I，其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 1或2所示；堿基序列如序列表SEQ ID NO. 2所示的大豆鋅指蛋白基因SCTF-I，它編碼的蛋白其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 3所示；堿基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示的大豆鋅指蛋白基因SCTF-I，它是采用下述方法獲得的1)、提取大豆品種“吉農(nóng)18”總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板；2)、用人工合成的引物PlCACAAGCATAAGCACAAGC, P2 TGGATCTATGGATCAGTATTGAGG ；3)、采用PCR的方法進(jìn)行cDNA克隆。堿基序列如序列表SEQ ID N0. 2所示的大豆鋅指蛋白基因SCTF-1，它是1)以堿基序列如序列表SEQ ID NO. 1的大豆鋅指蛋白基因SCTF-1為模板；
2)用引物PlGGGTCTAGAATGGCTTTGGAAGCTCTTCA,P2 :TTTGAGCTCGTATTGAGGGATTTCAATCTTGGGT ；3)采用PCR方法擴(kuò)增獲得的。一種植物表達(dá)載體，它是在植物表達(dá)載體中插入了大豆鋅指蛋白基因SCTF-1。本發(fā)明的另一個(gè)目的是大豆鋅指蛋白基因SCTF-1，在培養(yǎng)耐低溫轉(zhuǎn)基因植物新品種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的大豆鋅指蛋白基因SCTF-1，是大豆中新發(fā)現(xiàn)的與低溫相關(guān)的C2H2 型鋅指蛋白基因。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，SCTF-I編碼的蛋白能夠定位到細(xì)胞核中，該基因過量表達(dá)后能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因植物的抗冷性，具有提高植物綜合耐逆性的功能，本發(fā)明的基因來源于大豆，具有適合于大豆等雙子葉植物的優(yōu)化密碼子，其基因工程受體主要適合于雙子葉植物的大豆、煙草、棉花等，此外也適合于水稻、小麥、玉米等單子葉植物。


圖1為倒置熒光顯微鏡下照片，其中a是pBI121-GFP在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)；b是pBI121-GFP-SCTF-l在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)；圖2為轉(zhuǎn)基因植株耐冷性實(shí)驗(yàn)照片，其中a是4°C處理24h后的對(duì)照煙草，b是 4°C處理24h后的轉(zhuǎn)基因煙草；圖3為對(duì)照煙草和轉(zhuǎn)基因煙草-10°C處理后，經(jīng)25°C恢復(fù)培養(yǎng)1 后的照片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1選用大豆品種“吉農(nóng)18”，待幼苗生長(zhǎng)一周后，4°C培養(yǎng)Mh，取葉片，用液氮研磨， 加入含有裂解液的1.5ml的EP管中，震蕩混勻后，使用試劑盒RNAiso Plus提取總RNA，用甲醛變性膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，然后用分光光度計(jì)測(cè)量RNA的濃度；按照美國FERMENTAS 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈；以植物C2H2型鋅指蛋白的保守序列為探針?biāo)阉鞔蠖够蚪M數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過比對(duì)和序列拼接得到一個(gè)全長(zhǎng)為802bp 的大豆C2H2型鋅指蛋白序列，根據(jù)此序列分別設(shè)計(jì)兩邊引物CACAAGCATAAGCACAAGC， TGGATCTATGGATCAGTATTGAGG，采用RT-PCR的方法進(jìn)行cDNA克隆，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s, 54. 5°C復(fù)性40s，72°C延伸40s，32個(gè)循環(huán)，72°C后延伸IOmin ；將 PCR產(chǎn)物克隆至PMD-18T載體上，測(cè)序后獲得具有完整編碼區(qū)的大豆C2H2型鋅指蛋白基因 SCTF-I，其堿基序cDNA如序列表SEQ ID NO. 1。SCTF-I全長(zhǎng)802bp，開放閱讀框在89_787bp處，DNAMAN軟件分析表明SCTF-I共編碼233個(gè)氨基酸，有兩個(gè)典型的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)間由28個(gè)氨基酸隔開。 鋅指結(jié)構(gòu)中有植物鋅指蛋白特有的保守氨基酸序列QALGGH。經(jīng)DNAMAN軟件分析，估算其等電點(diǎn)pi = 8. 33，分子量MW = 24. 9kDa。利用GENEBANK中BLAST搜索大豆基因組數(shù)據(jù)庫， 發(fā)現(xiàn)SCTF-I是一個(gè)新的大豆C2H2型鋅指蛋白基因。實(shí)施例2根據(jù)大豆C2H2型鋅指蛋白基因SCTF-I的cDNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增充整編碼閱讀框的引物，在上游添加)(ba I酶切位點(diǎn)，下游添加Mc I酶切位點(diǎn)，上游引物GGG TCTAGAATGGCTTTGGAAGCTCTTCA，下游引物TTT GAGCTC GTATTGAGGGATTTCAATCTTGGGT，以實(shí)施例1中獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將SCTF-I的cDNA克隆到PMD-18T載體上，進(jìn)一步克降到雙元表達(dá)載體PBI121上；經(jīng)測(cè)序，其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，所表達(dá)的蛋白其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示；將GFP基因鏈接到上面的載體上，構(gòu)建成pBI121-SCTF-l-GFP載體，將pBI121-SCTF-l_GFP通過農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，通過激光共聚焦纖維鏡管擦，發(fā)現(xiàn)PBI121-SCTF-1-GFP基因嵌合產(chǎn)物定位于細(xì)胞核內(nèi)，表明大豆SCTF-I基因是定位于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，見圖1，其中 a是pBI121-GFP在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)，b是pBI121-GFP-SCTF_l在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)。a、b是在倒置熒光顯微鏡下的觀察，通過顯微鏡觀察，圖a可以看出在轉(zhuǎn)入 PBI121-GFP的洋蔥表皮細(xì)胞中整個(gè)細(xì)胞都有綠色熒光，而圖b轉(zhuǎn)入pBI121-GFP-SCTF-l的洋蔥表皮細(xì)胞只有細(xì)胞核能檢測(cè)到綠色熒光，說明SCTF-I編碼的蛋白能夠定位到細(xì)胞核中。實(shí)施例3將表達(dá)載體PBI121-SCTF-1-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌侵染的方法，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入煙草中，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR、RT-PCR、Southern雜交檢測(cè)后，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的 T2代和對(duì)照植株進(jìn)行耐逆性分析；耐冷性轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)SCTF-I基因的煙草和對(duì)照放入4°C培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)30d，之后再恢復(fù)25°C常溫培養(yǎng)12h。再將轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照放入-10°C環(huán)境中低溫脅迫30min，再恢復(fù)25°C常溫培養(yǎng)12h。將轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照放入4°C培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)30d，觀察和記錄生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫M小時(shí)后，轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)狀況正常，而對(duì)照葉片均有不同程度萎縮，打蔫。在低溫脅迫2d后，對(duì)照部分植株開始出現(xiàn)凍斑，葉子開始枯黃，脅迫7d后，對(duì)照植株葉片大量出現(xiàn)凍斑和打卷現(xiàn)象，脅迫30d后，轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)基本正常，而對(duì)照植株的大面積葉片出現(xiàn)枯黃，打蔫，打卷現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因植株基本正常。在恢復(fù)25°C常溫培養(yǎng)1 后，轉(zhuǎn)基因植株恢復(fù)情況要明顯優(yōu)于對(duì)照組。再將轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照放入-io°c環(huán)境中進(jìn)行低溫脅迫 30min，再恢復(fù)25°C常溫培養(yǎng)12h，對(duì)照煙草大部分死亡，而轉(zhuǎn)基因煙草也有一部分凍傷，但是基本都存活下來。見圖2、3所示上述實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明中克隆的大豆C2H2型鋅指蛋白基因SCTF-1，為大豆中新發(fā)現(xiàn)的與低溫相關(guān)的C2H2型鋅指蛋白基因。實(shí)施例3表明，該基因過量表達(dá)后能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因植物的抗冷性，具有提高植物綜合耐逆性的功能。本發(fā)明的基因來源于大豆，具有適合于大豆等雙子葉植物的優(yōu)化密碼子，其基因工程受體主要適合于雙子葉植物的大豆、煙草、棉花等，此外也適合于水稻、小麥、玉米等單子葉植物。
權(quán)利要求
1.大豆鋅指蛋白基因SCTF-I，其堿基序列如序列表SEQID NO. 1。
2.大豆鋅指蛋白基因SCTF-I，其堿基序列如序列表SEQID NO. 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大豆鋅指蛋白基因SCTF-1，其特征在于它編碼的蛋白其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 3所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆鋅指蛋白基因SCTF-1，它是采用下述方法獲得的1)、提取大豆品種“吉農(nóng)18”總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板；2)、用人工合成的引物PlCACAAGCATAAGCACAAGC, P2 TGGATCTATGGATCAGTATTGAGG ；3)、采用PCR的方法進(jìn)行cDNA克隆。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大豆鋅指蛋白基因SCTF-1，它是1)以堿基序列如序列表SEQID NO. 1的大豆鋅指蛋白基因SCTF-I為模板；2)用引物P1GGGTCTAGAATGGCTTTGGAAGCTCTTCA， P2 :TTTGAGCTCGTATTGAGGGATTTCAATCTTGGGT ；3)采用PCR方法擴(kuò)增獲得的。
6.一種植物表達(dá)載體，其特征在于它是在植物表達(dá)載體中插入了大豆鋅指蛋白基因 SCTF-I。
7.大豆鋅指蛋白基因SCTF-1，在培養(yǎng)耐低溫轉(zhuǎn)基因植物新品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了大豆鋅指蛋白基因SCTF-1，是大豆中新發(fā)現(xiàn)的與低溫相關(guān)的C2H2型鋅指蛋白基因。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，SCTF-1編碼的蛋白能夠定位到細(xì)胞核中，該基因過量表達(dá)后能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因植物的抗冷性，具有提高植物綜合耐逆性的功能，本發(fā)明的基因來源于大豆，具有適合于大豆等雙子葉植物的優(yōu)化密碼子，其基因工程受體主要適合于雙子葉植物的大豆、煙草、棉花等，此外也適合于水稻、小麥、玉米等單子葉植物。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102181454SQ20111010328
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者付永平, 宋冰, 張卓, 李勃, 杜鵑, 洪洋, 王丕武, 王丹, 王賀, 王鵬, 馬建 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)