專利名稱:干細(xì)胞篩選系統(tǒng)、其制備方法及干細(xì)胞的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于干細(xì)胞篩選技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種干細(xì)胞篩選系統(tǒng)、其制備方法及干細(xì)胞的篩選方法。
背景技術(shù):
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)是來(lái)源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞,廣泛存在于人體結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。間充質(zhì)干細(xì)胞具有高分化性能,在不同的誘導(dǎo)條件下能分化成成熟的間質(zhì)細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。作為進(jìn)行組織工程研究的重要種子細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞在骨及軟骨組織損傷的修復(fù)、肌肉組織退行性疾病、冠心病等疾病的治療方面具有良好的應(yīng)用前景?,F(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了多種間充質(zhì)干細(xì)胞的篩選方法,如密度梯度離心法、全血貼壁法、 流式分選法和免疫磁珠篩選法等,其中,篩選軟骨干細(xì)胞的方法主要有流式分選法、免疫磁珠篩選法和瓊脂糖篩選法。瓊脂糖篩選法主要包括以下步驟將含有一定細(xì)胞量的DEME/ F12培養(yǎng)液與等體積的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖充分混合,使細(xì)胞在瓊脂糖篩選系統(tǒng)中成為單細(xì)胞狀態(tài);瓊脂糖的濃度達(dá)到后,將篩選系統(tǒng)在4°C下靜置IOmin凝固;然后加入DEME/ F12培養(yǎng)液,于溫箱中培養(yǎng)3周 6周;最后在倒置顯微鏡下提取細(xì)胞克隆團(tuán),即可得到軟骨干細(xì)胞。瓊脂糖篩選法不僅操作過(guò)程繁瑣、篩選時(shí)間長(zhǎng),而且需要嚴(yán)格控制篩選條件,即便嚴(yán)格控制篩選條件,由于需要在倒置顯微鏡下提取細(xì)胞克隆團(tuán),在提取過(guò)程中軟骨干細(xì)胞易受污染、純度較低。流式分選法是通過(guò)流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行干細(xì)胞篩選的方法,免疫磁珠篩選法是根據(jù)免疫學(xué)原理,利用包備有抗體的磁珠與干細(xì)胞表面的特殊標(biāo)志特異結(jié)合后,通過(guò)一定強(qiáng)度磁場(chǎng)時(shí)被滯留而分選的方法,流式分選法和免疫磁珠篩選法能夠簡(jiǎn)化篩選步驟,提高篩選效率,但是,由于軟骨干細(xì)胞缺乏特異性的標(biāo)志物,采用流式分選法和免疫磁珠篩選法進(jìn)行篩選得到的干細(xì)胞純度較低;而且流式分選法和免疫磁珠篩選法需要的細(xì)胞量大,不利于篩選組織塊較小的組織。另外,流式分選法和免疫磁珠篩選法需要特定設(shè)備儀器和抗體試劑,篩選成本較高。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此,本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種干細(xì)胞篩選系統(tǒng)、其制備方法及干細(xì)胞的篩選方法,本發(fā)明提供的篩選方法無(wú)需特定儀器設(shè)備和抗體試劑,流程簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便,得到的干細(xì)胞純度高。本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞篩選系統(tǒng),包括固體支持物;涂布在所述固體支持物上的纖維連接蛋白和牛血清白蛋白。本發(fā)明還提供了一種上述技術(shù)方案所述的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)的制備方法,包括以下步驟將纖維連接蛋白與緩沖溶液混合,得到纖維連接蛋白溶液;將所述纖維連接蛋白溶液加入到固體支持物中進(jìn)行孵育,得到涂布有纖維連接蛋白的固體支持物;向所述涂布有纖維連接蛋白的固體支持物中加入牛血清白蛋白,得到干細(xì)胞篩選系統(tǒng)。優(yōu)選的,所述纖維連接蛋白溶液的濃度為5 μ g/mL 20μ g/mL。優(yōu)選的,所述孵育的溫度為0°C 5°C,所述孵育的時(shí)間為IOh以上。本發(fā)明還提供了一種干細(xì)胞的篩選方法,包括以下步驟a)提供軟骨終板細(xì)胞重懸液;b)將所述軟骨終板細(xì)胞重懸液加入到權(quán)利要求1 5任意一項(xiàng)所述的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中進(jìn)行孵育,得到干細(xì)胞。優(yōu)選的,所述步驟b)中,所述軟骨終板細(xì)胞終濃度為200個(gè)細(xì)胞/cm2 600個(gè)細(xì)胞 /cm2。優(yōu)選的,所述步驟b)中,所述孵育的溫度為35°C 38°C,所述孵育的時(shí)間為 5min 30mino優(yōu)選的,所述步驟a)具體包括al)用膠原酶將軟骨終板進(jìn)行消化,離心后得到軟骨終板細(xì)胞團(tuán);a2)用DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)所述軟骨終板細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行重懸,得到軟骨終板細(xì)胞重懸液。優(yōu)選的,還包括對(duì)所述干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。優(yōu)選的,采用含有5wt% 20wt%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)所述干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明將纖維連接蛋白溶液加入到固體支持物上進(jìn)行孵育,得到涂布有纖維連接蛋白的固體支持物;向所述涂布有纖維連接蛋白的固體支持物加入牛血清白蛋白后,得到干細(xì)胞篩選系統(tǒng);將軟骨終板細(xì)胞重懸液加入到所述干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中進(jìn)行孵育,即可篩選、分離得到干細(xì)胞。本發(fā)明提供的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中包括纖維連接蛋白,纖維連接蛋白能夠增加干細(xì)胞貼壁能力,從而將干細(xì)胞與其他細(xì)胞分離。本發(fā)明提供的篩選方法無(wú)需使用大型儀器設(shè)備,無(wú)需進(jìn)行相關(guān)抗體的標(biāo)記,流程簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、成本較低。本發(fā)明提供的篩選方法進(jìn)行干細(xì)胞篩選后,無(wú)需進(jìn)行離心、漂洗等后處理,減少了干細(xì)胞受到污染的可能性。另外,通過(guò)本發(fā)明提供的方法進(jìn)行篩選后得到的未貼壁細(xì)胞懸液還可以繼續(xù)篩選,從而避免細(xì)胞浪費(fèi),適于組織取材少、細(xì)胞需要量大的干細(xì)胞的篩選。實(shí)驗(yàn)表明,采用本發(fā)明提供的篩選方法對(duì)軟骨終板干細(xì)胞進(jìn)行篩選后,將得到的干細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)2周后,干細(xì)胞標(biāo)志物FGFR3的含量由5%上升至40% ;干細(xì)胞標(biāo)志物 ⑶105的含量由5%上升至85% ;干細(xì)胞標(biāo)志物STR0-1的含量由7%上升至95%。
圖1為經(jīng)過(guò)篩選系統(tǒng)篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)2周的細(xì)胞形成的克隆團(tuán);
圖2為經(jīng)過(guò)本篩選系統(tǒng)篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)2周的細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣平行排列生長(zhǎng);圖3為本發(fā)明實(shí)施例軟骨終板細(xì)胞重懸液在篩選前成雜亂樣無(wú)規(guī)則貼壁生長(zhǎng);圖4為篩選前FGFR3的表達(dá)量;圖5為篩選后FGFR3的表達(dá)量圖6為篩選前⑶105的表達(dá)量;圖7為篩選后⑶105的表達(dá)量;圖8為篩選前STR0-1的表達(dá)量;圖9為篩選后STR0-1的表達(dá)量;圖10為篩選前后干細(xì)胞表面標(biāo)記物的百分含量柱狀圖;圖11為本發(fā)明實(shí)施例提供的干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)結(jié)果;圖12為本發(fā)明實(shí)施例提供的干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)結(jié)果;圖13為本發(fā)明實(shí)施例提供的干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)油紅染色結(jié)果;圖14為本發(fā)明實(shí)施例提供的干細(xì)胞的成軟骨誘導(dǎo)結(jié)果;圖15為本發(fā)明實(shí)施例提供的干細(xì)胞的成軟骨誘導(dǎo)后形成的軟骨基質(zhì)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞篩選系統(tǒng),包括固體支持物;涂布在所述固體支持物上的纖維連接蛋白和牛血清白蛋白。本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)的制備方法,包括以下步驟將纖維連接蛋白與緩沖溶液混合,得到纖維連接蛋白溶液;將所述纖維連接蛋白溶液加入到固體支持物中進(jìn)行孵育,得到涂布有纖維連接蛋白的固體支持物;向所述涂布有纖維連接蛋白的固體支持物中加入牛血清白蛋白,得到干細(xì)胞篩選系統(tǒng)。纖維連接蛋白是一種大分子糖蛋白,具有多種生物活性,廣泛存在于動(dòng)物組織和組織液中。本發(fā)明對(duì)所述纖維連接蛋白沒(méi)有特殊限制,可以為從市場(chǎng)上購(gòu)得的人纖維連接蛋白。 首先將纖維連接蛋白與緩沖溶液混合,得到纖維連接蛋白溶液。在本發(fā)明中,所述緩沖溶液優(yōu)選為含有l(wèi)mmol/L氯化鎂和lmmol/L氯化鈣、濃度為lmol/L的磷酸鹽緩沖溶液。所述纖維連接蛋白溶液的濃度優(yōu)選為5 μ g/mL 20 μ g/mL,更優(yōu)選為10 μ g/mL 15μ g/mL。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所要篩選的干細(xì)胞的特點(diǎn)選取合適的纖維連接蛋白溶液濃度,濃度越大,篩選需要的時(shí)間越短,但是篩選得到的干細(xì)胞純度會(huì)受到影響。
得到纖維連接蛋白溶液后,將其過(guò)濾消毒后加入到固體支持物中進(jìn)行孵育。在孵育過(guò)程中,纖維連接蛋白能夠粘附在固體支持物表面。在本發(fā)明中,所述固體支持物可以為玻璃或者塑料材質(zhì)的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等。所述纖維連接蛋白在所述固體支持物表面進(jìn)行孵育的溫度優(yōu)選為0°c 5°C,更優(yōu)選為4°C ;所述孵育的時(shí)間優(yōu)選為IOh以上,更優(yōu)選為 12h 24h。
孵育完成后,除去所述固體支持物中的溶液后,得到涂布有纖維連接蛋白的固體支持物。除掉的溶液中含有纖維連接蛋白,將該溶液回收后可以反復(fù)利用,能夠節(jié)約試劑、 降低成本。向所述涂布有纖維連接蛋白的固體支持物中加入牛血清白蛋白,牛血清白蛋白將纖維連接蛋白的非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷后,即可得到干細(xì)胞篩選系統(tǒng)。本發(fā)明優(yōu)選向所述固體支持物中加入牛血清白蛋白溶液,所述牛血清白蛋白溶液的濃度優(yōu)選為0. 5% 3%。在本發(fā)明提供的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中,纖維連接蛋白涂布于所述固體支持物上,牛血清白蛋白將纖維連接蛋白的非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷,使所述干細(xì)胞篩選系統(tǒng)篩選得到的干細(xì)胞純度更好。本發(fā)明還提供了一種干細(xì)胞的篩選方法,包括以下步驟a)提供軟骨終板細(xì)胞重懸液;b)將所述軟骨終板細(xì)胞重懸液加入到權(quán)利要求1 5任意一項(xiàng)所述的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中進(jìn)行孵育,得到干細(xì)胞。本發(fā)明采用上述技術(shù)方案提供的篩選系統(tǒng)對(duì)軟骨終板細(xì)胞重懸液進(jìn)行篩選,得到干細(xì)胞。按照本發(fā)明,所述軟骨終板細(xì)胞重懸液優(yōu)選按照以下方法制備用膠原酶將軟骨終板進(jìn)行消化,離心后得到軟骨終板細(xì)胞團(tuán);用DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)所述軟骨終板細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行重懸,得到軟骨終板細(xì)胞重懸液。本發(fā)明采用臨床獲取的退變的椎間盤(pán)軟骨終板,首先用0. 01mol/L的PBS清洗, 將其裁剪為碎塊,所述碎塊優(yōu)選為Imm3 ;然后用膠原酶將所述軟骨終板碎塊進(jìn)行消化,將得到的消化液過(guò)濾、離心后得到軟骨終板細(xì)胞團(tuán)。本發(fā)明優(yōu)選以II型膠原酶對(duì)所述軟骨終板進(jìn)行消化,進(jìn)行消化的溫度優(yōu)選為35°C 38°C,時(shí)間優(yōu)選為IOh Mh ;本發(fā)明優(yōu)選以150 目 250目的篩網(wǎng)對(duì)所述消化液進(jìn)行過(guò)濾以減少細(xì)胞粘連;本發(fā)明優(yōu)選以800轉(zhuǎn)/IOmin 1200轉(zhuǎn)/IOmin的轉(zhuǎn)速對(duì)經(jīng)過(guò)過(guò)濾后的消化液進(jìn)行離心,棄去上清液后,得到軟骨終板細(xì)胞團(tuán)。采用DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)所述軟骨終板細(xì)胞進(jìn)行重懸,得到軟骨終板細(xì)胞重懸液。 本發(fā)明優(yōu)選采用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)所述軟骨終板細(xì)胞進(jìn)行重懸。得到軟骨終板細(xì)胞重懸液后,將所述軟骨終板細(xì)胞重懸液加入到上述技術(shù)方案所述的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中進(jìn)行孵育,所述軟骨終板細(xì)胞重懸液中的干細(xì)胞在纖維連接蛋白的作用下貼壁,從而實(shí)現(xiàn)與其他細(xì)胞的分離。按照本發(fā)明,將所述軟骨終板細(xì)胞重懸液加入到所述干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中厚,所述軟骨終板細(xì)胞的終濃度優(yōu)選為200個(gè)細(xì)胞/cm2 600個(gè)細(xì)胞/cm2,更優(yōu)選為250個(gè)細(xì)胞/ cm2 550個(gè)細(xì)胞/cm2,最優(yōu)選為300個(gè)細(xì)胞/cm2 500個(gè)細(xì)胞/cm2。按照本發(fā)明,所述軟骨終板細(xì)胞重懸液在所述干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中進(jìn)行孵育的溫度優(yōu)選為35°C 38°C,更優(yōu)選為37°C ;時(shí)間優(yōu)選為5min 30min,更優(yōu)選為IOmin 25min。 在進(jìn)行孵育的過(guò)程中,根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn)以及所需要的干細(xì)胞純度要求,可以在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況,從而調(diào)整合適的孵育時(shí)間。實(shí)驗(yàn)表明,孵育時(shí)間短,貼壁的干細(xì)胞純度較高,時(shí)間長(zhǎng)時(shí),貼壁的干細(xì)胞純度會(huì)下降。軟骨終板細(xì)胞重懸液在所述篩選系統(tǒng)中進(jìn)行孵育的過(guò)程中,干細(xì)胞在纖維連接蛋
6白的作用下貼壁,從而實(shí)現(xiàn)與其他細(xì)胞的分離。孵育完畢后,除去篩選系統(tǒng)中的液體后,即可得到干細(xì)胞。在本發(fā)明中,除掉的液體為未貼壁細(xì)胞的懸液,可將所述懸液加入到所述干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中再次篩選,減少細(xì)胞浪費(fèi)。得到干細(xì)胞后,本發(fā)明優(yōu)選還包括對(duì)所述干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),即將所述干細(xì)胞置于培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明優(yōu)選采用含有5wt% 20wt%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)所述干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),所述擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為35°C 38°C,更優(yōu)選為37°C。擴(kuò)大培養(yǎng)兩周后,對(duì)得到的干細(xì)胞進(jìn)行鑒定和分析,結(jié)果表明,本發(fā)明提供的篩選方法篩選得到的干細(xì)胞能夠形成克隆團(tuán),且細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣平行排列生長(zhǎng);采用流式分選法對(duì)所述擴(kuò)大培養(yǎng)兩周后的干細(xì)胞進(jìn)行分析,結(jié)果表明,干細(xì)胞標(biāo)志物FGFR3的含量由5%上升至40%;干細(xì)胞標(biāo)志物⑶105的含量由5%上升至85% ;干細(xì)胞標(biāo)志物STR0-1的含量由7%上升至95% ;對(duì)所述擴(kuò)大培養(yǎng)兩周后的干細(xì)胞分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)、成脂誘導(dǎo)和成軟骨誘導(dǎo),結(jié)果表明,所述干細(xì)胞能夠形成鈣結(jié)節(jié),也能夠形成脂滴和軟骨基質(zhì),說(shuō)明本發(fā)明篩選得到了干細(xì)胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明將纖維連接蛋白溶液加入到固體支持物上進(jìn)行孵育,得到涂布有纖維連接蛋白的固體支持物;向所述涂布有纖維連接蛋白的固體支持物加入牛血清白蛋白后,得到干細(xì)胞篩選系統(tǒng);將軟骨終板細(xì)胞重懸液加入到所述干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中進(jìn)行孵育,即可篩選、分離得到干細(xì)胞。本發(fā)明提供的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中包括纖維連接蛋白,纖維連接蛋白能夠增加干細(xì)胞貼壁能力,從而將干細(xì)胞與其他細(xì)胞分離。本發(fā)明提供的篩選方法無(wú)需使用大型儀器設(shè)備,無(wú)需進(jìn)行相關(guān)抗體的標(biāo)記,流程簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、成本較低。本發(fā)明提供的篩選方法進(jìn)行干細(xì)胞篩選后,無(wú)需進(jìn)行離心、漂洗等后處理,減少了干細(xì)胞收到污染的可能性。另外,通過(guò)本發(fā)明提供的方法進(jìn)行篩選后得到的未貼壁細(xì)胞懸液還可以繼續(xù)篩選,從而避免細(xì)胞浪費(fèi),適于組織取材少、細(xì)胞需要量大的干細(xì)胞的篩選。為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明,以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)、其制備方法及干細(xì)胞的篩選方法進(jìn)行詳細(xì)描述。以下各實(shí)施例中所用原料均為從市場(chǎng)上購(gòu)得。實(shí)施例1用含有ImMMgCljn ImMCaCl2的0. 1M/L磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋人纖維連接蛋白, 得到10 μ g/mL的纖維連接蛋白溶液,過(guò)濾消毒后于-20°C保存;篩選前一天,將所述纖維連接蛋白溶液解凍后加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,均勻覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)瓶底,4°C過(guò)夜孵育;篩選當(dāng)天, 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的纖維連接蛋白溶液回收后,加入的牛血清白蛋白(BSA)溶液再次覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)瓶,常溫放置5min,得到干細(xì)胞篩選系統(tǒng)。實(shí)施例2將臨床獲取的退變的椎間盤(pán)軟骨終板用0. 01M/L的PBS清洗3次后剪成Imm3大小的碎塊,用0. 2% II型膠原酶37°C下過(guò)夜進(jìn)行消化;用200目的篩網(wǎng)將得到的消化液過(guò)濾, 1000轉(zhuǎn)/IOmin離心后,棄去上清液,得到軟骨終板細(xì)胞團(tuán);用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將所述軟骨終板細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行重懸,得到軟骨終板細(xì)胞重懸液;將所述軟骨終板細(xì)胞懸液加入到實(shí)施例1制備的篩選系統(tǒng)中,每25cm2培養(yǎng)瓶中放置IO4個(gè)細(xì)胞,于37°C 5% CO2溫箱中孵育IOmin ;回收細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的液體,然后向所述細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,于37°C 5% CO2溫箱中擴(kuò)大培養(yǎng) 2周,得到干細(xì)胞。對(duì)所述擴(kuò)大培養(yǎng)2周后得到的細(xì)胞進(jìn)行顯微觀察,結(jié)果參見(jiàn)圖1、圖2和圖3,圖1 為經(jīng)過(guò)篩選系統(tǒng)篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)2周的細(xì)胞形成的克隆團(tuán),由圖1可知,該細(xì)胞克隆團(tuán)中細(xì)胞形態(tài)比較均一,呈纖維細(xì)胞樣;圖2為經(jīng)過(guò)篩選系統(tǒng)篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)2周的細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣平行排列生長(zhǎng),由圖2可知,該細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣平行排列生長(zhǎng),并呈現(xiàn)漩渦狀,細(xì)胞的形態(tài)大小比較規(guī)則;圖3為軟骨終板細(xì)胞重懸液在篩選前呈雜亂樣無(wú)規(guī)則貼壁生長(zhǎng),由圖3可知,篩選前,軟骨終板細(xì)胞呈雜亂樣無(wú)規(guī)則貼壁生長(zhǎng),貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)多種形態(tài),如纖維細(xì)胞樣、多角形、短棒型等。由圖1、圖2和圖3可知,篩選前,細(xì)胞呈雜亂樣貼壁生長(zhǎng),并且未形成克隆團(tuán);蹄選后的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后形成了克隆團(tuán),并且細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣平行排列生長(zhǎng)。采用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)量,結(jié)果參見(jiàn)圖4、圖5、圖6、 圖7、圖8、圖9和圖10,圖4為篩選前FGFR3的表達(dá)量,其中,曲線41為同型對(duì)照,曲線42 為FGFR3標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù);圖5為篩選后FGFR3的表達(dá)量,其中,曲線51為同型對(duì)照, 曲線52為FGFR標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù);圖6為篩選前⑶105的表達(dá)量,其中,曲線61為同型對(duì)照,曲線62為⑶105標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù);圖7為篩選后⑶105的表達(dá)量,其中, 曲線71為同型對(duì)照,曲線72為CD105標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù);圖8為篩選前STR0-1的表達(dá)量,其中,曲線81為同型對(duì)照,曲線82為STR0-1標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù);圖9為篩選后 STR0-1的表達(dá)量,其中,曲線91為同型對(duì)照,曲線92為STR0-1標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù);圖 10為篩選前后干細(xì)胞表面標(biāo)記物的百分含量柱狀圖,其中,101為篩選前FGFR3的含量,102 為篩選后FGFR3的含量,103為篩選前⑶105的含量,104為篩選后⑶105的含量,105為篩選前STR0-1的含量,106為篩選后STR0-1的含量。由圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9和圖10可知,采用本發(fā)明提供的方法進(jìn)行篩選后,干細(xì)胞表面標(biāo)記物百分含量有明顯提高,說(shuō)明本發(fā)明提供的方法篩選得到了干細(xì)胞。將擴(kuò)大培養(yǎng)兩周后的干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)21天,所述成骨誘導(dǎo)液包括 10 %胎牛血清、10nmol/L地塞米松、IOmmol β -甘油磷酸和0. ImmolL-抗壞血酸-2-磷酸酯;在進(jìn)行誘導(dǎo)過(guò)程中,每周換液2次,3周后進(jìn)行茜素紅染色,結(jié)果參見(jiàn)圖11,圖11為本發(fā)明實(shí)施例提供的干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)結(jié)果,由圖11可見(jiàn)塊狀礦化結(jié)節(jié),該礦化結(jié)節(jié)可被茜素紅染色為紅色結(jié)節(jié)??梢?jiàn),所述擴(kuò)大培養(yǎng)兩周后的干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)21天后形成了紅染的礦化結(jié)節(jié),即該細(xì)胞可成功誘導(dǎo)成骨。將擴(kuò)大培養(yǎng)兩周后的干細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)72h,所述成脂誘導(dǎo)液包括 10 μ g/mL胰島素、1 μ mol地塞米松、500 μ moIIBMX和IOOmol吲哚美辛,然后在維持液中誘導(dǎo)Mh,所述維持液為含有10%胎牛血清和 ομ g/mL胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)液;處理周期循環(huán)3次,最后在維持液中培養(yǎng)至3周,然后在倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況,結(jié)果參見(jiàn)圖12,圖12為本發(fā)明實(shí)施例提供的干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)結(jié)果,其中的球形空泡為干細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)后形成的脂肪滴;對(duì)得到的培養(yǎng)物進(jìn)行油紅0染色,結(jié)果參見(jiàn)圖13,圖13為本發(fā)明實(shí)施例提供的干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)油紅染色結(jié)果,由圖13可知,經(jīng)過(guò)成脂誘導(dǎo)后形成的球形空泡可被染成紅色。由圖12和圖13可知,所述擴(kuò)大培養(yǎng)兩周后的干細(xì)胞經(jīng)過(guò)成脂誘導(dǎo)后, 細(xì)胞內(nèi)有脂滴形成,即該細(xì)胞可成功誘導(dǎo)成脂。
采用micromass法進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo),具體操作如下將干細(xì)胞重懸,得到IO7個(gè)細(xì)胞/mL的干細(xì)胞重懸液;將50 μ L干細(xì)胞重懸液在培養(yǎng)皿中心靜置池,然后加入到成軟骨誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)21天,所述成軟骨誘導(dǎo)液含有l(wèi)Ong/mLTGF-β 3、10_7mol/L地塞米松、50μ g/ mL抗壞血酸、40μ g/mL脯氨酸、100μ g/mL丙酮酸和1 100dilutedITS+Premix的低糖 DMEM ;在誘導(dǎo)過(guò)程中,每周換液兩次,三周后進(jìn)行阿利新藍(lán)染色,結(jié)果參見(jiàn)圖14和圖15,圖 14為本發(fā)明實(shí)施例提供的干細(xì)胞的成軟骨誘導(dǎo)結(jié)果,在成軟骨誘導(dǎo)過(guò)程中,細(xì)胞逐漸聚集呈球形,并脫離培養(yǎng)皿壁,呈漂浮生長(zhǎng),且外觀有光澤,經(jīng)過(guò)阿新藍(lán)染色后可被染成藍(lán)色;圖 15為本發(fā)明實(shí)施例提供的干細(xì)胞的成軟骨誘導(dǎo)后形成的軟骨基質(zhì),其可被阿新藍(lán)染色。由圖14和圖15可知,所述擴(kuò)大培養(yǎng)兩周后的干細(xì)胞在成軟骨誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)21天后,細(xì)胞呈球形離壁漂浮生長(zhǎng)并有軟骨基質(zhì)形成,即該細(xì)胞可成功誘導(dǎo)成軟骨。由圖11、圖12、圖13、圖14和圖15可知,本發(fā)明提供的篩選方法得到的干細(xì)胞經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)后能夠誘導(dǎo)成骨、誘導(dǎo)成脂、誘導(dǎo)成軟骨,說(shuō)明通過(guò)本發(fā)明提供的方法篩選得到了干細(xì)胞。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾,這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種干細(xì)胞篩選系統(tǒng),包括 固體支持物;涂布在所述固體支持物上的纖維連接蛋白和牛血清白蛋白。
2.權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)的制備方法,包括以下步驟 將纖維連接蛋白與緩沖溶液混合,得到纖維連接蛋白溶液;將所述纖維連接蛋白溶液加入到固體支持物中進(jìn)行孵育,得到涂布有纖維連接蛋白的固體支持物;向所述涂布有纖維連接蛋白的固體支持物中加入牛血清白蛋白,得到干細(xì)胞篩選系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于,所述纖維連接蛋白溶液的濃度為 5 μ g/mL 20 μ g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于,所述孵育的溫度為0°C 5°C,所述孵育的時(shí)間為IOh以上。
5.一種干細(xì)胞的篩選方法,包括以下步驟a)提供軟骨終板細(xì)胞重懸液;b)將所述軟骨終板細(xì)胞重懸液加入到權(quán)利要求1 5任意一項(xiàng)所述的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中進(jìn)行孵育,得到干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的篩選方法,其特征在于,所述步驟b)中,所述軟骨終板細(xì)胞終濃度為200個(gè)細(xì)胞/cm2 600個(gè)細(xì)胞/cm2。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的篩選方法,其特征在于,所述步驟b)中,所述孵育的溫度為 35°C 38°C,所述孵育的時(shí)間為5min 30min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的篩選方法,其特征在于,所述步驟a)具體包括 al)用膠原酶將軟骨終板進(jìn)行消化,離心后得到軟骨終板細(xì)胞團(tuán);a2)用DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)所述軟骨終板細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行重懸,得到軟骨終板細(xì)胞重懸液。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的篩選方法,其特征在于,還包括 對(duì)所述干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的篩選方法,其特征在于,采用含有5wt% 20wt%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)所述干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞篩選系統(tǒng),包括固體支持物;涂布在所述固體支持物上的纖維連接蛋白和牛血清白蛋白。本發(fā)明還提供了一種上述技術(shù)方案所述的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)的制備方法。本發(fā)明還提供了一種干細(xì)胞的篩選方法,包括以下步驟a)提供軟骨終板細(xì)胞重懸液;b)將所述軟骨終板細(xì)胞重懸液加入到上述技術(shù)方案所述的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中進(jìn)行孵育,得到干細(xì)胞。本發(fā)明提供的篩選方法無(wú)需使用大型儀器設(shè)備,無(wú)需進(jìn)行相關(guān)抗體的標(biāo)記,流程簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、成本較低。本發(fā)明提供的篩選方法進(jìn)行干細(xì)胞篩選后,無(wú)需進(jìn)行離心、漂洗等后處理,減少了干細(xì)胞受到污染的可能性。
文檔編號(hào)C12M1/00GK102212460SQ201110106899
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者劉蘭濤, 周躍, 李長(zhǎng)青, 熊承杰, 黃博 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院