間充質(zhì)干細胞體外傳代基因組穩(wěn)定性檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測間充質(zhì)干細胞體外傳代基因組穩(wěn)定性的方法，由下述步驟組成：（1）原代分離間充質(zhì)干細胞；（2）對原代分離的間充質(zhì)干細胞進行短期傳代，凍存建庫。定義為供者原代傳代細胞庫；（3）復蘇供者原代傳代細胞，并對其進行長期傳代；（4）提取低代次和高代次臍帶間充質(zhì)干細胞之基因組DNA；（5）采用高通量的生物芯片或測序技術，比較低代次和高代次間充質(zhì)干細胞基因組DNA的差異；（6）基于高通量分析結(jié)果，對供者原代傳代細胞基因組穩(wěn)定性做出評價。本發(fā)明可以排除基因組不穩(wěn)定的間充質(zhì)干細胞，篩選出基因組穩(wěn)定的間充質(zhì)干細胞，增加干細胞臨床應用的安全性。
【專利說明】間充質(zhì)干細胞體外傳代基因組穩(wěn)定性檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測間充質(zhì)干細胞體外傳代基因組穩(wěn)定性的方法。
【背景技術】
[0002]在積累了一定的對干細胞的生物學特征的基礎研究之后，干細胞已經(jīng)逐漸地走向臨床應用研究，成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學的重要方面。除直接進行移植的造血干細胞移植之外，眾多基于細胞的治療方法都需要對干細胞進行體外培養(yǎng)及擴增。雖然間充質(zhì)干細胞來源廣泛，但其體內(nèi)含量較低。為了滿足臨床使用的需要，間充質(zhì)干細胞需要進行體外傳代培養(yǎng)，有時還需要較大規(guī)模的體外培養(yǎng)。
[0003]體外擴增培養(yǎng)對間充質(zhì)干細胞的生物學特性是否會發(fā)生影響，是否會改變間充質(zhì)干細胞的基因表達情況，是否會影響干細胞遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，是否會改變其表觀遺傳學特征，是否會帶來不安全的隱患？這一系列問題都困擾著體外培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞應用于臨床研究，也是要回答干細胞治療安全性所必須面對的問題。
[0004]在眾多安全性問題之中，基因組穩(wěn)定性是最關鍵的、也是最被人們重視的問題。然而，目前還沒有評價間充質(zhì)干細胞體外傳代過程中基因組的穩(wěn)定性的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種有效地評價間充質(zhì)干細胞體外傳代過程中基因組穩(wěn)定性的方法。
[0006]本發(fā)明的技術方案概述如下:
[0007]—種檢測間充質(zhì)干細胞體外傳代過程中基因組穩(wěn)定性的方法，由下述步驟組成:
[0008]( I)原代分離間充質(zhì)干細胞；(2)對原代分離的間充質(zhì)干細胞進行短期傳代，并凍存建庫；(3)對間充質(zhì)干細胞進行長期傳代(4)提取低代次和高代次的間充質(zhì)干細胞之基因組DNA ; (5)采用高通量的生物芯片或測序技術，比較高代次和低代次間充質(zhì)干細胞基因組DNA的差異；(6)基于高通量分析結(jié)果，對低代次的間充質(zhì)干細胞基因組體外傳代穩(wěn)定性做出評價。
[0009]其中，本發(fā)明所述的原代分離的間充質(zhì)干細胞是指從各種組織中分離間充質(zhì)干細胞，例如骨髓、脂肪、臍帶、臍血、胎盤等組織。這些原代分離的細胞可以被定義為PO代細胞。
[0010]本發(fā)明對原代間充質(zhì)干細胞進行短期傳代后，細胞凍存入庫。該細胞庫為低代次間充質(zhì)干細胞庫。需要對低代次間充質(zhì)干細胞庫進行包括微生物、增殖能力、細胞表面分子標記、成骨、成脂、成軟骨分化能力的檢測，確認其滿足間充質(zhì)干細胞的基本要求，且無微生物污染。
[0011]本發(fā)明中凍存低代次間充質(zhì)干細胞時所使用的細胞凍存保護液可以含有或不含有動物血清和/或DMSO。
[0012]本發(fā)明所述的基于高通量分析結(jié)果，對低代次的間充質(zhì)干細胞基因組體外傳代穩(wěn)定性做出評價是指基于高通量分析結(jié)果，排除基因組不穩(wěn)定的間充質(zhì)干細胞，篩選出基因組穩(wěn)定的間充質(zhì)干細胞，增加干細胞臨床應用的安全性。
[0013]本發(fā)明中對間充質(zhì)干細胞進行長期傳代所使用的培養(yǎng)基可以為含有血清的培養(yǎng)基，也可以是無血清培養(yǎng)基。
[0014]由上可以看出，本發(fā)明可以為檢測間充質(zhì)干細胞體外傳代基因組提供一種穩(wěn)定的方法，通過選擇合適的供者來源細胞，為提供基因組穩(wěn)定的細胞治療產(chǎn)品提供了條件。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為對低代次臍帶間充質(zhì)干細胞庫進行微生物、增殖能力、細胞表面分子標記圖；
[0016]圖2為9個臍帶間充質(zhì)干細胞樣本CNVs變化圖；
[0017]圖3為圖3為9個不同供者來源的hUC-MSCs長期傳代過程中發(fā)生的CNVs在染色體上的展示圖。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但 這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0019]實施例1檢測臍帶間充質(zhì)干細胞體外傳代過程中基因組穩(wěn)定性
[0020](I)從臍帶組織中分離臍帶間充質(zhì)干細胞；
[0021](2)待細胞達到90%融合后，按1:3的比例對原代分離的臍帶間充質(zhì)干細胞進行傳代；
[0022](3)在傳代到第3代(P3)時對臍帶間充質(zhì)干細胞進行凍存，建立低代次臍帶間充質(zhì)干細胞庫，凍存過程中采用含有血清且含有DMSO的凍存保護液；
[0023](4)對低代次的臍帶間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)至P30。傳代培養(yǎng)過程中采用含有動物血清的培養(yǎng)基。傳代比例為1:3。
[0024](5)對低代次臍帶間充質(zhì)干細胞庫進行微生物、增殖能力、細胞表面分子標記(圖1)、成骨、成脂、成軟骨分化能力的檢測(圖2);其中，圖1為流式細胞術檢測高代次hUC-MSCs細胞表面分子標記，由圖可見，經(jīng)長期傳代后，hUC-MSCs表達⑶29，⑶73，CD90, CD105, HLA-ABC ;不表達 CDllb, CD19, CD34, CD45, HLA-DR0 ;其中，圖 2 中 A 為高代次hUC-MSCs成骨分化能力檢測(A)、B為高代次hUC-MSCs成脂能力檢測(B)、C為高代次hUC-MSCs軟骨分化能力檢測。由圖2可見，經(jīng)過長期傳代臍帶間充質(zhì)干細胞仍然具有成骨、成脂、成軟骨的分化潛能，能夠在適當?shù)恼T導條件下分化骨、脂肪或軟骨細胞。
[0025](6)分別提取低代次(P3)和高代次(P30)的基因組DNA，采用aCGH (array-basedComparative Genomic Hybridization)的方法檢測低代次和高代次細胞基因組DNA拷貝數(shù)(Copy Number Variations, CNVs)的變化。
[0026](7)在本次檢測的9個臍帶間充質(zhì)干細胞樣本中，有7個發(fā)生了可檢測到的CNVs的變化，有2個未檢測到CNVs變化(表1、圖3)。我們把在P30檢測到10個CNVs以下的樣本定義為基因組穩(wěn)定的樣本，把在P30檢測到50 - 100個CNVs的樣本定義為基因組不穩(wěn)定的樣本，把在P30檢測到100個CNVs以上的樣本定義為基因組極不穩(wěn)定的樣本?；蚪M穩(wěn)定的樣本是適合進行臨床試驗的間充質(zhì)干細胞，而基因組不穩(wěn)定和基因組極不穩(wěn)定的樣本不適合用于臨床研究。其中，圖3為9個不同供者來源的hUC-MSCs長期傳代過程中發(fā)生的CNVs在染色體上的展示圖。其中，紅色三角形表示擴增，綠色三角形表示缺失。橫坐標為樣本編號。
[0027]表1.9個不同供者來源的hUC-MSCs樣本體外長期傳代過程中發(fā)現(xiàn)的CNVs片段數(shù)
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測間充質(zhì)干細胞體外傳代遺傳穩(wěn)定性的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)原代分離間充質(zhì)干細胞；(2)對原代分離的間充質(zhì)干細胞進行短期傳代，并凍存建庫；(3)對間充質(zhì)干細胞進行長期傳代(4)提取低代次和高代次的間充質(zhì)干細胞之基因組DNA ；(5)采用高通量的生物芯片或測序技術，比較高代次和低代次間充質(zhì)干細胞基因組DNA的差異；(6)基于高通量分析結(jié)果，對低代次的間充質(zhì)干細胞基因組體外傳代穩(wěn)定性做出評價。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中短期傳代為進行2-5次傳代，傳代比例為1:3-1:10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中將低代次細胞進行凍存，定義為低代次細胞庫，待體外傳代基因組穩(wěn)定性檢測合格后再用于臨床治療。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3中長期傳代為細胞傳代比例為1:3-1:10,細胞的世代需要達到30個世代之后，定義為高代次的細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高通量檢測技術包括aCGH、SNP芯片或全基因組測 序。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過長期傳代放大體外培養(yǎng)過程中間充質(zhì)干細胞基因組發(fā)生的變化，利用高通量的檢測手段，評價間充質(zhì)干細胞體外傳代過程中基因組穩(wěn)定性，從而篩選出基因組更穩(wěn)定、臨床使用更安全的細胞。
【文檔編號】C12Q1/68GK103789424SQ201410025142
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】王有為, 韓之波 申請人:北京漢氏聯(lián)合生物技術有限公司