專利名稱：酵母展示脂肪酶催化合成辛烯基琥珀酸淀粉酯的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領域，尤其涉及一種酵母展示脂肪酶催化合成辛烯基琥珀酸淀粉酯的方法。
背景技術(shù)：
辛烯基琥珀酸淀粉酯是目前唯一被美國FDA和我國批準作為食品添加劑的淀粉酯，是穩(wěn)定食品乳濁體系最有效的食品添加劑。目前辛烯基琥珀酸淀粉酯都是由辛烯基琥珀酸酐(Octenyl Succinic Anhydride,0SA)與淀粉漿在弱減性條件下經(jīng)酯化反應生成的， 存在的主要問題是酯化反應速度不夠快、反應時間過長，導致副反應產(chǎn)物生成(副反應I) 以及辛烯基琥珀酸淀粉酯發(fā)生水解(副反應II)，從而影響酯化反應效率，并使辛烯基琥珀酸淀粉酯成品中摻雜副反應產(chǎn)物。較于化學法合成辛烯基琥珀酸淀粉酯，生物酶法可以在較短時間內(nèi)獲得高取代度的反應產(chǎn)物。就相同反應體系而言，生物酶法相比化學法顯著提升反應效率和產(chǎn)率，均一度和穩(wěn)定度也有顯著提高。同時，采用生物酶法避免了化學法反應條件苛刻、無特異性、產(chǎn)物復雜、副產(chǎn)物多、分離難、安全性差等弊端。脂肪酶是目前酯化合成中使用最廣泛的酶，但是生產(chǎn)成本高、固定化過程繁雜費時大大局限了其商業(yè)化應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種酵母展示脂肪酶催化合成辛烯基琥珀酸淀粉酯的方法，該方法可提高辛烯基琥珀酸淀粉酯鈉合成的酯化反應效率和產(chǎn)率，降低合成成本。一種酵母展示脂肪酶催化合成辛烯基琥珀酸淀粉酯的方法，包括將谷物淀粉溶于水，吸漲后加入辛烯基琥珀酸酐和酵母展示脂肪酶，在34 36°C 下攪拌反應1 1. 5小時，分離、純化制得辛烯基琥珀酸淀粉酯。以重量份計，反應各原料配比可以如下水100 120份、谷物淀粉32 35份、辛烯基琥珀酸酐1 1. 2份、酵母展示脂肪酶1 2份。優(yōu)選的，所述的分離、純化方法為將反應液PH值調(diào)節(jié)至7.0，經(jīng)沉淀，洗滌，噴霧干燥，得到粉末。優(yōu)選的，所述的攪拌速率為200 300轉(zhuǎn)/分鐘。所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法制備將線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導培養(yǎng)72 144小時后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶。所述的重組質(zhì)粒由原始載體PPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號肽下游的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細胞壁α凝集素基因組成。所述的脂肪酶基因可選用Genbank號為AF229435的序列，畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115為商業(yè)化產(chǎn)品，可從^witrogen公司購得。它的細胞壁α凝集素基因序列的 Genbank 號為]\C8164。載體pPIC9K為商業(yè)化產(chǎn)品(如hvitrogen公司)，它存在MF α 1信號肽序列(Genbank號Μ17301)，同時該載體內(nèi)信號肽序列上游存在AOXl啟動子(Genbank號 Ζ46233)。重組質(zhì)粒線性化處理的目的是為了與胞內(nèi)基因組發(fā)生同源重組，提高表達穩(wěn)定性。優(yōu)選的，所述生物印跡所用配體為油酸，它可以誘導酶結(jié)構(gòu)改變，提高轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明通過將脂肪酶基因和細胞壁α凝集素基因?qū)氘叧嘟湍讣毎鸊S115，畢赤酵母細胞誘導培養(yǎng)后，脂肪酶表達并分泌到胞外，同時利用細胞壁α凝集素將該脂肪酶固定在細胞表面。利用該酵母展現(xiàn)脂肪酶對酯化反應進行催化，不僅提高了操作穩(wěn)定性、耐熱性以及重復性，反應時間也大大縮短，從原來的12小時下降到1 2小時，另外該酵母表面展現(xiàn)脂肪酶生產(chǎn)成本低，催化合成轉(zhuǎn)化效率高。
具體實施例方式實施例1制備酵母展示脂肪酶通過人工合成的方法，合成米根霉(lihizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank 號AF229435)和畢赤酵母GS115的細胞壁α凝集素基因(Genbank號為Μ28164)，同時在脂肪酶基因C端加上連接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，連接后得到核苷酸序列 pro-ROL-linker-α -agglutinin,同時在序列兩端添加EcoR I和Not I酶切位點，其中 pro-ROL為脂肪酶基因，α-agglutinin為細胞壁α凝集素基因。以上述人工合成序列為模板，利用下述引物對，進行PCR擴增，上游引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3，；下游引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3，PCR反應體系為模板DNA為1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下游引物各0. 5 μ 1，10XPCR緩沖液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR運行條件為94°C 3分鐘，；35個循環(huán)(94°C 30秒，60°C 1分鐘，72°C 30秒)， 72 V 10分鐘。用EocR I和Not I同時酶切PCR產(chǎn)物和pPIC9K質(zhì)粒，并在T4DNA連接酶的作用下過夜連接形成PPIC9K-R0L質(zhì)粒，通過電泳檢驗并回收質(zhì)粒。為使目的基因與畢赤酵母 GS115發(fā)生His 4單位點置換重組，用Ml I對pPIC9K-R0L質(zhì)粒進行酶切線性化處理。將酶切線性化處理好的目的基因約15 μ 1加入到事先準備好的畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Q，25yF條件下電擊10ms，并加入約Iml 預冷的山梨醇。將上述混勻的電轉(zhuǎn)產(chǎn)物約400μ 1涂于MD平板上，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，然后將陽性轉(zhuǎn)化子涂于不同濃度的G418平板上，根據(jù)陽性轉(zhuǎn)化子對G418的抗性篩選出Mut表型的多拷貝陽性重組菌株。將多拷貝陽性重組菌株接種在BMGY培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)30h，離心收集細胞；再將細胞置于含有0.5% (體積百分比)甲醇的BMMY培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)144h，離心收集細胞， 用水沖洗后，接種至YGC培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)120h，然后3000g離心分鐘收集菌體，蒸餾水洗滌后再用50mM pH 7. 0磷酸緩沖液洗滌，然后與2倍體積油酸混合，-80°C下預凍后再經(jīng)德國Christ真空冷凍干燥機干燥Mh，用己烷洗滌除去油酸，再進行再真空干燥去除己烷，即得到經(jīng)生物印跡處理的酵母展示脂肪酶。實施例2酵母展示脂肪酶催化合成辛烯基琥珀酸淀粉酯實例1取350g谷物淀粉用水配制成35%淀粉乳(淀粉干基)、于65°C下吸水處理 15min使淀粉乳吸水膨脹，冷卻后加入Ig上述制備的酵母展示脂肪酶，然后分批加入IOg辛烯基琥珀酸酐，置于85-1型磁力攪拌器中攪拌開始反應，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，反應溫度保持在34°C，反應Ih后停止攪拌，調(diào)節(jié)pH值至7. 0，經(jīng)沉淀，洗滌，噴霧干燥，得到粉末。實例2取400g谷物淀粉用水配制成40%淀粉乳(淀粉干基)、于65 °C下吸水處理 15min使淀粉乳吸水膨脹，冷卻后加入2g上述制備的酵母展示脂肪酶，然后分批加入15g辛烯基琥珀酸酐，置于85-1型磁力攪拌器中攪拌開始反應，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，反應溫度保持在36°C，反應1.證后停止攪拌，調(diào)節(jié)pH值至7. 0，經(jīng)沉淀，洗滌，噴霧干燥，得到粉末。實施例3采用傳統(tǒng)化學法合成辛烯基琥珀酸淀粉酯實例1取350g谷物淀粉用水配制成35%淀粉乳(淀粉干基)、于65°C下吸水處理15min使淀粉乳吸水膨脹，然后分批加入IOg辛烯基琥珀酸酐，置于85-1型磁力攪拌器中攪拌開始反應，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，反應溫度保持在34°C，反應Ih后停止攪拌，調(diào)節(jié)pH 值至7. 0，經(jīng)沉淀，洗滌，噴霧干燥，得到粉末。 實施例4測定取代度和含磷量準確稱取2. Og辛烯基琥珀酸淀粉酯置于250mL燒杯中，用IOmL純異丙醇潤濕后， 加入15mL 2. 5mol/L鹽酸的異丙醇溶液，磁力攪拌30分鐘，然后加入50mL 90% (按重量百分比配制)異丙醇溶液，繼續(xù)攪拌10分鐘。將樣品移入布氏漏斗，用90%異丙醇洗滌至無 Cl_(用0. lmol/L硝酸銀檢驗)。再將樣品移入500mL的燒杯中，加蒸餾水至300mL，沸水浴 20分鐘，加2滴酚酞，趁熱用0. lmol/L NaOH滴定至粉紅色。取代度(此)計算公式如下取代度=0. 1624A/ (1_0. 210A)，式中A為每克辛烯基琥珀酸淀粉酯所耗用 0. lmol/L NaOH標準溶液的物質(zhì)的量，mmol。取代反應效率=實際取代度/理論取代度X 100%根據(jù)上述方法對實施例2和實施例3制得的辛烯基琥珀酸淀粉酯樣品進行檢測， 其中實施例2中，實例1產(chǎn)品的取代度和反應效率分別為0. 0198和91. 5%，實例2產(chǎn)品的取代度和反應效率分別為0. 0192和87. 1%。而實施例3產(chǎn)品的取代度和反應效率僅為 0. 0175 和 75%。
權(quán)利要求
1.一種酵母展示脂肪酶催化合成辛烯基琥珀酸淀粉酯的方法，包括將谷物淀粉溶于水，吸漲后加入辛烯基琥珀酸酐和酵母展示脂肪酶，在34 36°C下攪拌反應1 1. 5小時，分離、純化制得辛烯基琥珀酸淀粉酯鈉； 所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法制備將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(PiChiapastoris)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導培養(yǎng)72 144小時后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重組質(zhì)粒由原始載體PPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號肽下游的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細胞壁α凝集素基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于以重量份計，水100 120份、谷物淀粉 32 35份、辛烯基琥珀酸酐1 1. 2份、酵母展示脂肪酶1 2份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的攪拌速率為200 300轉(zhuǎn)/分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述生物印跡中所用配體為油酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母展示脂肪酶催化合成辛烯基琥珀酸淀粉酯的方法，包括將谷物淀粉溶于水，吸漲后加入辛烯基琥珀酸酐和酵母展示脂肪酶，在34～36℃下攪拌反應1～1.5小時，分離、純化制得辛烯基琥珀酸淀粉酯鈉。所述的酵母展示脂肪酶制備方法為將線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導培養(yǎng)72～144小時后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶。本發(fā)明通過將脂肪酶展示在細胞外，利用該酶制劑催化合成辛烯基琥珀酸淀粉酯，不僅提高了轉(zhuǎn)化效率，而且縮短了反應時間，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N15/63GK102212583SQ20111010873
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者何國慶, 古再麗努爾, 周陳偉, 徐娟, 林吉恒, 王睿之, 阮暉 申請人:浙江大學