專利名稱：一株兼性厭氧反硝化細菌及其在水體生物脫氮中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株兼性厭氧反硝化細菌及其在水體生物脫氮中的應(yīng)用，屬于環(huán)境微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，工業(yè)廢水的大量排放以及農(nóng)業(yè)大量施用化肥，導(dǎo)致硝酸鹽、亞硝酸鹽等含氮化合物污染地下水和地表水，氮素污染引起的水環(huán)境問題日益突出在飲用水中，硝酸鹽及其衍生產(chǎn)物因具有致病、致癌作用而影響人類健康，含氮廢水進入水體引發(fā)的水質(zhì)惡化及富營養(yǎng)化問題日益嚴重，因此氮素污染亟待解決。南四湖作為南水北調(diào)東線工程的重要調(diào)蓄湖泊和輸水通道，目前正遭受點源、面源污染和人為的過度開發(fā)，生態(tài)功能退化。根據(jù)2007山東省環(huán)境狀況公報，南四湖水質(zhì)符合地表水V類標準，主要污染物為TN和TP，仍屬輕度富營養(yǎng)化水平。國家對南水北調(diào)東線工程的水質(zhì)要求是2010年輸水干線全線持續(xù)穩(wěn)定達到地表水III類水質(zhì)標準。由此可見， 南四湖的治污任務(wù)嚴峻而緊迫。有關(guān)政府和專家擬采用南四湖周邊大面積濕地。尤其是通過在河流入湖口構(gòu)建人工濕地系統(tǒng)，進一步處理受污染河水，實現(xiàn)削減入湖污染負荷，改善入湖水質(zhì)的目的，但人工濕地的去污效果受多種條件影響，波動較大，要徹底改善南四湖整個區(qū)域的水質(zhì)，仍需進行強化處理。生物反硝化脫氮是利用微生物的作用，在厭氧或缺氧條件下，以硝酸鹽替代氧作電子受體將硝酸鹽逐步還原為氣態(tài)產(chǎn)物脫除，是一種經(jīng)濟有效的脫氮方式。研究表明，通過投加優(yōu)勢菌種進行生物強化，可以獲得更好的去污效果。Naeem U D A等將一株異養(yǎng)硝化菌投加到生物脫氮系統(tǒng)中，氨氮和COD去除率分別提高了 10%和11% ；姚曉麗等將高活性反硝化細菌制劑應(yīng)用于富營養(yǎng)化湖泊的脫氮，TN去除率為34.8% 38.2%，0 ^去除率為 63. 75% 66. 89%，有效改善了湖水水質(zhì)。植物根際作為土壤中微生物代謝活性最高的區(qū)域，存在著大量脫氮功能菌群，從土壤中分離出的細菌，65%以上具有反硝化能力。因此，從南四湖人工濕地主要植物蘆竹的根際土壤中分離篩選出的高效反硝化細菌，可以為今后利用微生物強化治理南四湖氮素污染的工程應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料和菌種來源。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的之一是提供一株兼性厭氧反硝化細菌，該細菌具有高效脫除水中氮素的能力。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培養(yǎng)條件，使該細菌表現(xiàn)出更強的異樣脫氮能力。本發(fā)明的另一個目的是提供新的細菌在水體生物脫氮中的應(yīng)用， 單獨使用該細菌便可有效去除水體中的氮素。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一株兼性厭氧反硝化細菌，該菌株命名為Pseudomonas stutzeri LZ-14，屬于假單胞菌屬的施氏假單胞菌，已于2011年4月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO =M 2011119。其菌學(xué)特征為細胞呈短桿狀，直徑約為2. 0 μ mX 0. 5 μ m ；菌落土黃色，低凸、圓形、邊緣整齊、致密、半透明、光滑、有光澤；最適碳源為乙酸鈉，可利用的碳源和氮源范圍廣泛；適宜在溫度20 35°C的缺氧條件下進行脫氮；以乙酸鈉為碳源、 硝酸鉀為氮源時，最佳C/N為5，最適pH值范圍在7. 0 8. 0之間，此區(qū)間以外難以生長及保持脫氮能力。本發(fā)明的菌株可以用于脫除水體中的氮，其可以有效的脫除水體中的硝酸鹽氮、 亞硝酸鹽氮和總氮，其脫氮條件包括本發(fā)明菌株可利用的碳源和氮源范圍廣泛，CODcr < 200mg/L、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮含量為< 40mg/L，pH 7. 0 8. 0，20 40°C。其最佳脫氮條件為最適碳源為乙酸鈉，最佳氮源為硝酸鉀，CODcr為< 150mg/L，硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮含量為< 30mg/L，該菌株的最佳C/N為5，最適pH值7. 5，最適溫度35°C。具體應(yīng)用時，使用方法為(1)使用前用反硝化培養(yǎng)基活化菌株將保藏培養(yǎng)基斜面上保存的施氏假單胞菌株LZ-14用接種環(huán)刮取1環(huán)菌苔，接種入裝有200mL保藏培養(yǎng)基或反硝化培養(yǎng)基的250mL 錐形瓶中，30°C恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12h，即可獲得菌株。(2)將活化后的菌液接種于待處理的含氮廢水中，投加量為受處理廢水體積的 5%, 20 ~ 35°C，pH值范圍在7. 0 8. 0之間，定時取樣檢測TN、N02__N、N03__N、CODcr等去除情況，直至含氮廢水達到地表水III類水質(zhì)標準要求(COD < 20mg/L, TN < lmg/L)。(3)檢測方法CODcr 重鉻酸鉀法；TN 過硫酸鉀氧化_紫外分光光度法；TP 過硫酸鉀消解_鉬銻抗分光光度法；NO3--N 紫外分光光度法；NO2--N :N-(1-萘基)_ 乙二胺光度法。以上方法均參照中國環(huán)境科學(xué)出版社出版的《水和廢水檢測分析方法》(第四版)。OD值采用UV-2450紫外分光光度計(Shimadzu)，在波長600nm下測定培養(yǎng)液的 OD值。本發(fā)明的菌株是通過篩選偶然得到的一種具有高效脫氮活性的細菌，可以通過兼性厭氧反硝化脫除水體中的亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮。經(jīng)實驗研究表明，該菌株最適碳源為乙酸鈉，可利用的碳源和氮源范圍廣泛；適宜在溫度20 35°C的缺氧條件下進行脫氮；生長繁殖迅速。以乙酸鈉為碳源、硝酸鉀為氮源時，該菌株的最佳C/N為5，最適pH值范圍在 7.0 8.0之間，此區(qū)間以外難以生長及保持脫氮能力。該菌株的脫氮過程主要發(fā)生在菌體生長的第12 36h，并伴隨有一定量亞硝酸鹽的累積，之后24h內(nèi)亞硝酸鹽可被完全降解。 利用該菌生物強化去除水中污染物時，在停留時間為8d時，投加菌液使實際受污染河水中 CODcr 從 33. 9mg/L 降到了 15. 9mg/L,去除率為 53. 1 % ；TN 從 4. 07mg/L 降低到了 0. 98mg/L, 去除率為75. 9%。與未投菌的對照組相比CODtt和TN去除率分別提高了 24. 9%和39. 5%。
本發(fā)明中的反硝化是指微生物將Ν03_-Ν還原成Ν02_-Ν，繼而再還原成Ν20、Ν0或N2 的過程。本發(fā)明中的脫氮是指水體中可溶性氮的去除，可溶性氮是指NH4+、N03--N和NO2--N15本發(fā)明中的碳/氮比，又稱C/N是指碳元素的質(zhì)量與氮元素的質(zhì)量之比。
本發(fā)明的菌株具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明菌株可利用的碳源和氮源范圍廣泛，易于培養(yǎng)。(2)本發(fā)明菌株可用于處理高N02_或高N03_的廢水，并且在脫氮過程中沒有硝酸鹽和亞硝酸鹽的積累。(3)本發(fā)明菌株可同時去除有機廢水中的CODcr。(4)本發(fā)明菌株可適用于較低濃度有機廢水、較高濃度亞硝酸鹽或硝酸鹽廢水的處理，具有更加廣泛的適應(yīng)性，可以適應(yīng)不同的污染負荷。


本發(fā)明提供的菌株命名為Pseudomonas stutzeri LZ-14，屬于假單胞菌屬的施氏假單胞菌，已于2011年4月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO :M2011119o圖1 施氏假單胞菌LZ-14菌體透射電鏡顯微照片(X 20000)。
圖2 施氏假單胞菌LZ-14菌體生長曲線。圖3 施氏假單胞菌LZ-14菌體培養(yǎng)前后體系中TN的去除率。圖4 施氏假單胞菌LZ-14菌體強化新薛河河水對CODcr去除的影響。圖5 施氏假單胞菌LZ-14菌體強化新薛河河水ΤΝ、Ν03__Ν和Ν02__Ν去除效果，其中，A :TN ；B :Ν03:Ν ；C :Ν02:Ν。圖6 施氏假單胞菌LZ-14菌體強化人工配水對CODcr的去除。圖7 施氏假單胞菌LZ-14菌體強化人工配水ΤΝ、Ν03__Ν和Ν02__Ν去除效果，其中， A =TN ；B :Ν03:Ν ；C :Ν02:Ν。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1本發(fā)明菌株的分離鑒定(1)培養(yǎng)基Α、菌株分離、純化、保藏培養(yǎng)基(/L) :CH3C00Na，2g;蛋白胨，15g;酵母膏，3g;葡萄糖，Ig ；NaCl,6g ；KNO3,1. 5g ；pH 控制在 7. 0 7. 2。B、菌株篩選、脫氮培養(yǎng)基(DM denitrifying Medium) (/L) CH3COONa，2g ；KH2PO4, 0. 4g ；MgSO4 · 7Η20，0· 6g ；CaCl2 · 2Η20，0· 07g ；KNO3, Ig ；Tris 緩沖液 12mL ；微量元素 2mL ；pH 控制在7. 0 7. 2。上述培養(yǎng)基如制成固體培養(yǎng)基，則添加瓊脂1.5%。(2)施氏假單胞菌株LZ-14的分離純化稱取IOg蘆竹根際土壤樣品置于250mL三角瓶中，加IOOmL無菌水及幾粒玻璃珠， 搖床振蕩15min使土樣分散均勻。待土樣分散后，靜置5min，吸取ImL 土壤懸液至9mL稀釋液(無菌水)，得到10_2稀釋度懸液，依次按10倍稀釋法稀釋至10_7，由此制得各稀釋度土壤懸液。分別吸取各稀釋度懸液0. ImL至(1)中所述的反硝化細菌分離培養(yǎng)基A用固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)(已放置過夜，無雜菌生長)，用玻璃刮刀將土壤懸液涂布均勻。之后將平板倒置，放入30°C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至長出明顯菌落。挑取分離出來的菌株，在培養(yǎng)基A平板上多次劃線純化，直至顯微鏡下觀察顯示無雜菌為止，此時可認為本發(fā)明的菌株施氏假單胞菌株LZ-14已純化完畢。(3)施氏假單胞菌株LZ-14的菌落形態(tài)特征在培養(yǎng)基A平板上培養(yǎng)3d后，顯微鏡下觀察到菌落土黃色，低凸、圓形、邊緣整齊、致密、半透明、光滑、有光澤。(4)施氏假單胞菌株LZ-14的菌體形態(tài)特征透射電鏡觀察結(jié)果表明菌體呈短桿狀，直徑約為2.0 μ mXO. 5 μ m(如圖1所示)。(5)施氏假單胞菌株LZ-14的生理生化特征最適培養(yǎng)溫度為20 35°C，最適pH值范圍在7. O 8. O之間，缺氧條件下脫氮， 革蘭氏染色陰性。菌株LZ-14具有較為廣泛的碳源譜，可利用碳源種類多樣，還可以很好的利用銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽，氮源利用具有多樣性。主要生理生化特征見表1和表2。表1LZ-14菌株利用不同碳源對NO3--N的去除率
權(quán)利要求
1.一株兼性厭氧反硝化細菌，其特征在于該菌株命名為Pseudomonas stutzeri LZ-14，屬于假單胞菌屬的施氏假單胞菌，已于2011年4月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO =M 2011119。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兼性厭氧反硝化細菌，其特征在于其菌學(xué)特征為細胞呈短桿狀，直徑約為2.0μπιΧ0.5μπι;菌落土黃色，低凸、圓形、邊緣整齊、致密、半透明、光滑、 有光澤；最適碳源為乙酸鈉，可利用的碳源和氮源范圍廣泛；適宜在溫度20 35°C的缺氧條件下進行脫氮；以乙酸鈉為碳源、硝酸鉀為氮源時，最佳C/N為5，最適pH值范圍在7.0 8. 0之間，此區(qū)間以外難以生長及保持脫氮能力。
3.權(quán)利要求1所述的兼性厭氧反硝化細菌在水體生物脫氮中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于具體應(yīng)用時，將培養(yǎng)得到的含有兼性厭氧反硝化細菌的菌液按5%的比例接種于待處理含氮廢水中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株兼性厭氧反硝化細菌，該菌株命名為Pseudomonas stutzeri LZ-14，屬于假單胞菌屬的施氏假單胞菌，已于2011年4月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NOM2011119。該菌株能夠有效脫除水體中的氨氮、硝酸氮、亞硝酸氮及其混合物，降低總氮濃度，還可同時去除有機廢水中的CODCr，適用于較低濃度有機廢水、較高濃度亞硝酸鹽或硝酸鹽廢水的處理，具有更加廣泛的適應(yīng)性。脫氮過程中，不產(chǎn)生硝酸鹽積累，有一定量亞硝酸鹽累積，但隨后24h內(nèi)亞硝酸鹽可被完全降解。使用該菌株處理廢水工藝簡單，脫氮效果穩(wěn)定。利用該菌生物強化去除水中污染物時，在停留時間為8d時，投加LZ-14菌液強化使實際受污染河水中CODCr從33.9mg/L降到了15.9mg/L，去除率為53.1％；TN從4.07mg/L降低到了0.98mg/L，去除率為75.9％。
文檔編號C12N1/20GK102220264SQ201110118549
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者胡文容, 裴海燕, 邵媛媛 申請人:山東大學(xué)