一種以葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化方法，步驟如下：確定木醋桿菌以葡萄糖酸作唯一碳源需要考慮的發(fā)酵參數(shù)，所述發(fā)酵參數(shù)包括發(fā)酵液pH、氣液比以及接種量；利用Design Expert8.0.6.1軟件根據(jù)Box?Behnken Design確定實驗方案；按照所確定的Box?Behnken Design實驗方案完成各組實驗，得到對應(yīng)的各組細(xì)菌纖維素產(chǎn)量；根據(jù)各組細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量，采用Design Expert8.0.6.1軟件建立響應(yīng)面模型，確定優(yōu)化的發(fā)酵參數(shù)組合。本發(fā)明提高了葡萄糖酸的利用率從而提高葡萄糖利用率，進(jìn)而提高了細(xì)菌纖維素最終產(chǎn)量，對于減少資源浪費、降低發(fā)酵成本有很大意義。
【專利說明】
-種從葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種W葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生 產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌纖維素 (Bacterial Cellulose,簡稱BC)是由W木醋桿菌為代表的少數(shù)微生 物發(fā)酵而成的具有廣闊開發(fā)前景的生物材料，自1886年被發(fā)現(xiàn)W來，學(xué)者對其的研究從未 間斷。細(xì)菌纖維素的諸多特異性使其可用在食品、生物醫(yī)學(xué)材料及造紙等諸多領(lǐng)域。
[0003] 目前，國內(nèi)外對細(xì)菌纖維素研究的重點集中在細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的提高和改性研究 方面，提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的途徑主要包括選育高產(chǎn)菌種、優(yōu)化工藝條件、改進(jìn)發(fā)酵方式與 設(shè)備及探討代謝機理等。
[0004] 在細(xì)菌纖維素的工業(yè)生產(chǎn)中，葡萄糖酸作為副產(chǎn)物會大量的生成。由于來自發(fā)酵 罐中的機械攬拌或氣升罐較高的氣含率（gas hold叩）和比氣液接觸介面化igher gas holdup and specific gas-liquid inte;rface)的良好溶氧條件，使得運種現(xiàn)象在發(fā)酵罐 中尤其明顯。因此，經(jīng)搖瓶實驗或淺盤靜態(tài)培養(yǎng)優(yōu)化的培養(yǎng)基組成或一系列工藝參數(shù)所獲 得的較高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量在中式發(fā)酵罐中會被大打折扣。減少葡萄糖酸的生成，使葡萄糖 更多的流向目的產(chǎn)物細(xì)菌纖維素是提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量及葡萄糖利用率的根本出發(fā)點，運 似乎已經(jīng)成為業(yè)內(nèi)共識。事實上，即便對于變異菌株，葡萄糖酸的大量生成仍然是不可避 免，更不必說當(dāng)其在發(fā)酵罐中培養(yǎng)。
[0005] 目前，產(chǎn)生細(xì)菌纖維素的方法中的發(fā)酵培養(yǎng)基大都是W葡萄糖或者是W葡萄糖和 薦糖為碳源的發(fā)酵前期的優(yōu)化，葡萄糖酸由葡萄糖氧化生成，并作為副產(chǎn)物大量的殘留于 發(fā)酵液中，不僅降低了細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量，而且造成了葡萄糖利用率的降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種W葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的 優(yōu)化方法，通過模擬W葡萄糖酸作為唯一碳源的發(fā)酵情況并對其工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，通過 提高葡萄糖酸利用率來提高葡萄糖利用率，進(jìn)而提高細(xì)菌纖維素最終產(chǎn)量，減少資源浪費、 降低發(fā)酵成本。
[0007] 實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為:一種W葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì) 菌纖維素的優(yōu)化方法，步驟如下：
[000引步驟1，確定木醋桿菌W葡萄糖酸作唯一碳源需要考慮的發(fā)酵參數(shù)，所述發(fā)酵參數(shù) 包括發(fā)酵液pH、氣液比W及接種量；
[0009] 步驟2,利用Design Experts.0.6.1軟件根據(jù)Box-Beh址en Design確定實驗方案； [0010]步驟3,按照步驟2所確定的Box-Behnken Design實驗方案完成各組實驗，得到對 應(yīng)的各組細(xì)菌纖維素產(chǎn)量；
[0011] 步驟4,根據(jù)各組細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量，采用Design Experts.0.6.1軟件建立響應(yīng)面 模型，確定優(yōu)化的發(fā)酵參數(shù)組合。
[0012] 優(yōu)選地，步驟1所述發(fā)酵參數(shù)的范圍如下：發(fā)酵液pH為4.60~6.60,氣液比為 13.30 % ~20.00 %，接種量為8.00 % ~25.00 %。
[0013] 優(yōu)選地，步驟3所述按照步驟2所確定的Box-Behnken Design實驗方案完成各組實 驗，得到對應(yīng)的各組細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，具體如下：
[0014] (3.1)根據(jù)步驟2中的實驗方案，配制所需種子培養(yǎng)液，滅菌冷卻完成接種操作后， 搖床30 °C下恒溫培養(yǎng)3天，搖床轉(zhuǎn)速為16化/min;
[0015] (3.2)根據(jù)步驟2中的實驗方案，配制所需發(fā)酵培養(yǎng)液，分別分裝至各個錐形瓶中， 調(diào)至各所需抑，滅菌冷卻后，按照步驟2實驗方案中數(shù)據(jù)，分別取相應(yīng)體積的接種量于對應(yīng) 發(fā)酵液中，于搖床30°C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì)菌纖維素，搖床轉(zhuǎn)速為16化/min;
[0016] (3.3)對步驟(3.2)中由木醋桿菌發(fā)酵生成的細(xì)菌纖維素膜或團塊取出后，先用自 來水沖洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0H溶液中煮化，然后用4%〇的HAc溶液中和，最后用去離 子水漂洗直至溶液成中性為止，然后將細(xì)菌纖維素膜和團塊置于冷凍干燥下冷凍10小時， 最后置于8(TC烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重得到對應(yīng)的各組細(xì)菌纖維素產(chǎn)量。
[0017] 優(yōu)選地，步驟4所確定優(yōu)化的發(fā)酵參數(shù)組合為：發(fā)酵液pH = 5.65,氣液比= 20.00%，接種量= 16.72%。
[001引優(yōu)選地，步驟（3 . 1)中所述種子培養(yǎng)液為葡萄糖2.0 %、（ N H 4 ) 2 S 0 4 0.6 %、 K出P040. 1 %、MgS040. 04%、蛋白腺0.3%、酵母浸粉0.225%、簇甲基纖維素鋼0.04%。
[0019] 優(yōu)選地，步驟（3.2)中所述發(fā)酵培養(yǎng)液為葡萄糖酸4.5 %、薦糖2.75%、玉米漿 2.0 %、（NH4)2S040.1 %、K出P〇4〇 . 5 %、MgS〇4〇 . 07 %、乳酸巧0.02 %、HAcO . 15 %、巧樣酸 0.06 %、簇甲基纖維素鋼0.04 %。
[0020] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點為：（1)在細(xì)菌纖維素發(fā)酵后期大量的葡萄糖 酸作為碳源被木醋桿菌利用，尋求葡萄糖酸作唯一碳源時的最佳發(fā)酵工藝條件，通過提高 葡萄糖酸利用率來提高葡萄糖利用率，進(jìn)而提高細(xì)菌纖維素最終產(chǎn)量；（2)采用響應(yīng)面優(yōu)化 法，可W確定發(fā)酵液抑、氣液比W及接種量之間對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的交叉影響，繼而確定最 優(yōu)的參數(shù)組合，實現(xiàn)低成本發(fā)酵，減少資源浪費。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明pH、接種量對響應(yīng)值的=維響應(yīng)面影響圖。
[0022] 圖2為本發(fā)明氣液比、接種量對響應(yīng)值的S維響應(yīng)面影響圖。
[0023] 圖3為本發(fā)明實施例10W葡萄糖酸作唯一碳源產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素的SEM圖。
[0024] 圖4為本發(fā)明實施例10W葡萄糖酸作唯一碳源產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素的紅外譜圖。
[0025] 圖5為本發(fā)明實施例10W葡萄糖酸作唯一碳源產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素的XRD圖。
【具體實施方式】
[0026] 本發(fā)明W葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化方法，步驟如下：
[0027] 步驟1，確定木醋桿菌W葡萄糖酸作唯一碳源需要考慮的發(fā)酵參數(shù)，所述發(fā)酵參數(shù) 包括發(fā)酵液pH、氣液比W及接種量;所述發(fā)酵參數(shù)的范圍如下:發(fā)酵液pH為4.60~6.60，氣 液比為13.30 %~20.00 %，接種量為8.00 %~25.00 %。
[00巧]步驟2,利用Desi即Expert8.0.6.1軟件根據(jù)Box-Beh址en Desi即確定實驗方案；
[0029] 步驟3,按照步驟2所確定的Box-Behnken Design實驗方案完成各組實驗，得到對 應(yīng)的各組細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，具體如下：
[0030] (3.1)根據(jù)步驟2中的實驗方案，配制所需種子培養(yǎng)液，滅菌冷卻完成接種操作后， 搖床30°C下恒溫培養(yǎng)3天，搖床轉(zhuǎn)速為16化/min;所述種子培養(yǎng)液為葡萄糖2.0%、（NH4) 2S〇4〇. 6 %、K出P〇4〇. 1 %、MgS〇4〇 . 04 %、蛋白腺0.3 %、酵母浸粉0.225 %、簇甲基纖維素鋼 0.04%。
[0031] (3.2)根據(jù)步驟2中的實驗方案，配制所需發(fā)酵培養(yǎng)液，分別分裝至各個錐形瓶中， 調(diào)至各所需抑，滅菌冷卻后，按照步驟2實驗方案中數(shù)據(jù)，分別取相應(yīng)體積的接種量于對應(yīng) 發(fā)酵液中，于搖床30°C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì)菌纖維素，搖床轉(zhuǎn)速為16化/min;所述發(fā)酵 培養(yǎng)液為葡萄糖酸4.5 %、薦糖2.75 %、玉米漿2.0 %、（NH4)2S040.1 %、KH2P040.5 %、 MgS〇4〇. 07 %、乳酸巧0.02%、HAcO. 15 %、巧樣酸0.06%、簇甲基纖維素鋼0.04%。
[0032] (3.3)對步驟(3.2)中由木醋桿菌發(fā)酵生成的細(xì)菌纖維素膜或團塊取出后，先用自 來水沖洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0H溶液中煮化，然后用4%〇的HAc溶液中和，最后用去離 子水漂洗直至溶液成中性為止，然后將細(xì)菌纖維素膜和團塊置于冷凍干燥下冷凍10小時， 最后置于8(TC烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重得到對應(yīng)的各組細(xì)菌纖維素產(chǎn)量。
[0033] 步驟4,根據(jù)各組細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量，采用Design Experts.0.6.1軟件建立響應(yīng)面 模型，確定優(yōu)化的發(fā)酵參數(shù)組合為:發(fā)酵液抑=5.65，氣液比=20.00%，接種量=16.72%。
[0034] W下結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。
[0035] 本發(fā)明W葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素并采用響應(yīng)面法優(yōu)化其 工藝的方法，具體步驟如下：
[0036] (1)確定木醋桿菌W葡萄糖酸作唯一碳源需要考慮的發(fā)酵參數(shù)：
[0037] 本發(fā)明中，木醋桿菌W葡萄糖酸作唯一碳源考慮到的發(fā)酵參數(shù)為PH、氣液比W及 接種量。
[0038] (2)利用Desi即Expert8.0.6.1軟件根據(jù)Box-Beh址en Desi即確定實驗方案。
[0039] (3)按照B抓實驗方案完成實驗。
[0040] (4)建立響應(yīng)面模型，分析實驗結(jié)果，確定優(yōu)化參數(shù)組合。
[0041] (5)將木醋桿菌W葡萄糖酸作唯一碳源發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素進(jìn)行紅外吸收、 SEM、XRD表征，并與木醋桿菌W葡萄糖作碳源發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比。
[0042] 步驟（1)中所述木醋桿菌為Acetobacter xylinum NUST6.2由本實驗室篩選并保 藏。
[0043] 步驟(2)中所述pH為4.60-6.60,氣液比為13.30 %-20.00 %，接種量為8.00 %- 25.00%。在此范圍內(nèi)，利用Design E邱e;rt軟件進(jìn)行實驗設(shè)計，表1為Box-Behnken設(shè)計實驗 因數(shù)水平設(shè)計表。
[0044] 步驟(4)中所述的建立響應(yīng)面模型，分析實驗結(jié)果，確定優(yōu)化參數(shù)是指，將響應(yīng)值 mBC(g/l)輸入Design Ewed軟件，根據(jù)軟件來分析結(jié)果，輸出響應(yīng)面S維圖并判斷各參數(shù) 對響應(yīng)值的影響情況，最終根據(jù)優(yōu)化結(jié)果得到木醋桿菌W葡萄糖酸為唯一碳源的最佳發(fā)酵 工藝。
[0046]
[0045] 親 IBox-Beh 址 en 巧計親
[0047]
[0048] 本實驗中為了盡量減少由于偶然因素引起的誤差，統(tǒng)一使用250ml的錐形瓶進(jìn)行 發(fā)酵實驗，根據(jù)表1Box-Behnken設(shè)計計算得出具體的實驗數(shù)據(jù)(具體的種子液體積W及發(fā) 酵液體積)如表2所示。
[0049] 親2Rr)X-RAhnkAn^H+且化違胳擲據(jù)親
[(K)加]
[0化1 ]
[0052]步驟(3)具體實施步驟如下：
[005；3] 根據(jù)表格，按照種子培養(yǎng)液：葡萄糖2.0 %、（NH4)2S040.6 %、KH2P040.1 %、 MgS〇4〇. 04 %、蛋白腺0.3 %、酵母浸粉0.225 %、簇甲基纖維素鋼0.04 %，配制100ml種子培 養(yǎng)液，于滅菌鍋中在12rC下滅菌20分鐘后，冷卻后于超凈臺中完成接種操作，放于搖床 (16化/min) 30 °C下恒溫培養(yǎng)3天。
[0化4]根據(jù)表格，按照發(fā)酵培養(yǎng)液：葡萄糖酸4.5 %、薦糖2.75 %、玉米漿2.0 %、（NH4) 2S〇4〇. 1 %、K也P〇4〇. 5 %、MgS〇4〇. 07 %、乳酸鈣0.02%、HAcO. 15 %、巧樣酸0.06 %、簇甲基纖 維素鋼0.04%，配制610ml發(fā)酵培養(yǎng)液液，按照表1中數(shù)據(jù)分別分裝17個250ml錐形瓶中，調(diào) 至各所需抑后，于滅菌鍋中在121°C下滅菌20分鐘。待冷卻后，按照表1中數(shù)據(jù)，分別取相應(yīng) 體積的種子培養(yǎng)液于對應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)液中，于搖床（160r/min)3(rC下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì) 菌纖維素。
[0055] 步驟(4)中，將響應(yīng)值mBC(g/l)輸入Design Ewed軟件中得到表3,響應(yīng)面優(yōu)化結(jié) 果見表4
[00日6] 親!RpVmkpn城選3無娃里
[00日7]
[0化引
[0059] 表中響應(yīng)值通過W下方式得到：
[0060] 將4.巧111111111^516.2發(fā)酵生成的膜或團塊取出后，先用自來水沖洗，再浸泡于 85°C的3%〇的化0H溶液中煮化，此時產(chǎn)物成乳白色半透明，然后用4%〇的HAc溶液中和，最后 用去離子水徹底漂洗直至溶液成中性為止，然后將膜和團塊(保持平整)置于冷凍干燥下冷 凍10小時，最后置于8(TC烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重。纖維素產(chǎn)量表示為：g/L(培養(yǎng) 液)。
[0061 ] 表4B抓響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析 [0062；
[0063；
[0064]由表4知，C、C2的P值<0.05,說明C(接種量)對模型顯著，模型P值為0.0002<0.05， 表明該擬合模型差異顯著，可接受;失擬項P值〉0.05,失擬項不顯著，說明模型在整個回歸 區(qū)域的擬合度很好，接近真實的響應(yīng)面曲線情況，模型建立合理;R2 = 0.8936,矯正系數(shù)Adj R2 = 0.8297，表明預(yù)測值與實際值之間有較高的相關(guān)性，能解釋82.97 %的響應(yīng)值變化，精 密度Adeq Precision = 10.243M，故可W用此模型對細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量進(jìn)行預(yù)測。
[0065] 經(jīng)過回歸擬合之后，得到相應(yīng)的擬合方程來表示實驗參數(shù)對響應(yīng)值的影響。該二 次方程模型為mBC(g/l)二 + 19.15-0.54*A+0.63地+1.89*C+0.78*A*C-0.74地*C-7.49*c2， 式中A為抑，B為氣液比，C為接種量。
[0066] 根據(jù)上述方程繪出響應(yīng)面分析圖，研究抑、氣液比、接種量對響應(yīng)值mBC(g/l)的影 響，響應(yīng)面見圖1、2。
[0067] 通過軟件計算得，PH = 5.65,氣液比= 20.00%，接種量=16.72%，mBC(g/l)的理 論最大值為20.9384。
[006引實施例1
[0069] 步驟1種子培養(yǎng)液的配制：根據(jù)葡萄糖2.0%、（NH4)2S040.6%、KH2P040.1 %、 MgS〇4〇. 04 %、蛋白腺0.3 %、酵母浸粉0.225 %、簇甲基纖維素鋼0.04 %，配制100ml種子培 養(yǎng)液。
[0070] 步驟巧中子培養(yǎng)液的接種與搖床培養(yǎng):首先將步驟1中已配好的種子液于滅菌鍋中 在12TC下滅菌20min，滅菌結(jié)束待其冷卻后于超凈臺中完成接種（本實驗所用菌種為 A.xylinum NUST 6.2)操作，最后于搖床(16〇1'/111；[]1)30°[下培養(yǎng)3天。
[0071] 步驟3發(fā)酵培養(yǎng)液的配制及發(fā)酵:按照發(fā)酵培養(yǎng)液:葡萄糖酸4.5 %、薦糖2.75%、 玉米漿2.0%、（NH4)2S040.1 %、K出P〇4〇. 5%、MgS〇4〇. 07%、乳酸巧0.02%、HAcO. 15%、巧樣 酸0.06%、簇甲基纖維素鋼0.04%，配審化10ml發(fā)酵液，用量筒配合移液槍(槍頭已滅菌)量 取35.73ml發(fā)酵液于1號250ml錐形瓶中，用抑電極將發(fā)酵液抑調(diào)至5.60，同樣于滅菌鍋中在 12rC下滅菌20min，滅菌結(jié)束待其冷卻后，用移液槍(槍頭已滅菌)在超凈臺中量取5.90ml 種子液加入1號250ml錐形瓶中，于搖床(160;r/min)30°C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì)菌纖維素。
[0072] 步驟4產(chǎn)物的提純與稱量:將4.巧1111皿抓516.2發(fā)酵生成的膜或團塊取出后，先 用自來水沖洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此時產(chǎn)物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去離子水徹底漂洗直至溶液成中性為止，然后將膜和團塊(保持 平整)置于冷凍干燥下冷凍10小時，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重。纖維素 產(chǎn)量表示為:g/L(培養(yǎng)液）。
[0073] 實施例2
[0074] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的配制:不需要重復(fù)。
[0075] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的接種與搖床培養(yǎng):不需要重復(fù)。
[0076] 步驟3發(fā)酵培養(yǎng)液的配制及發(fā)酵：用量筒配合移液槍(槍頭已滅菌)從剩余的發(fā)酵 液量取28.54ml發(fā)酵液于3號250ml錐形瓶中，用抑電極將發(fā)酵液抑調(diào)至6.60，同樣于滅菌鍋 中在12TC下滅菌20min，滅菌結(jié)束待其冷卻后，用移液槍（槍頭已滅菌）在超凈臺中量取 4.71ml種子液加入3號250ml錐形瓶中，于搖床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì)菌 纖維素。
[0077] 步驟4產(chǎn)物的提純與稱量:將4.巧1111皿抓516.2發(fā)酵生成的膜或團塊取出后，先 用自來水沖洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此時產(chǎn)物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去離子水徹底漂洗直至溶液成中性為止，然后將膜和團塊(保持 平整)置于冷凍干燥下冷凍10小時，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重。纖維素 產(chǎn)量表示為:g/L(培養(yǎng)液）。
[007引實施例3
[0079] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的配制:不需要重復(fù)。
[0080] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的接種與搖床培養(yǎng):不需要重復(fù)。
[0081] 步驟3發(fā)酵培養(yǎng)液的配制及發(fā)酵：用量筒配合移液槍(槍頭已滅菌)剩余的發(fā)酵液 量取38.54ml發(fā)酵液于5號250ml錐形瓶中，用pH電極將發(fā)酵液P的周至4.60，同樣于滅菌鍋中 在12TC下滅菌20min，滅菌結(jié)束待其冷卻后，用移液槍（槍頭已滅菌）在超凈臺中量取 3.08ml種子液加入5號250ml錐形瓶中，于搖床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì)菌 纖維素。
[0082] 步驟4產(chǎn)物的提純與稱量:將4.巧1111皿抓516.2發(fā)酵生成的膜或團塊取出后，先 用自來水沖洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此時產(chǎn)物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去離子水徹底漂洗直至溶液成中性為止，然后將膜和團塊(保持 平整)置于冷凍干燥下冷凍10小時，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重。纖維素 產(chǎn)量表示為:g/L(培養(yǎng)液）。
[0083] 實施例4
[0084] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的配制:不需要重復(fù)。
[0085] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的接種與搖床培養(yǎng):不需要重復(fù)。
[0086] 步驟3發(fā)酵培養(yǎng)液的配制及發(fā)酵：用量筒配合移液槍(槍頭已滅菌)剩余的發(fā)酵液 量取42.92ml發(fā)酵液于7號250ml錐形瓶中，用pH電極將發(fā)酵液P的周至6.60，同樣于滅菌鍋中 在12TC下滅菌20min，滅菌結(jié)束待其冷卻后，用移液槍（槍頭已滅菌）在超凈臺中量取 7.08ml種子液加入7號250ml錐形瓶中，于搖床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì)菌 纖維素。
[0087] 步驟4產(chǎn)物的提純與稱量:將4.巧1111皿抓516.2發(fā)酵生成的膜或團塊取出后，先 用自來水沖洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此時產(chǎn)物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去離子水徹底漂洗直至溶液成中性為止，然后將膜和團塊(保持 平整)置于冷凍干燥下冷凍10小時，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重。纖維素 產(chǎn)量表示為:g/L(培養(yǎng)液）。
[0088] 實施例5
[0089] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的配制:不需要重復(fù)。
[0090] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的接種與搖床培養(yǎng):不需要重復(fù)。
[0091] 步驟3發(fā)酵培養(yǎng)液的配制及發(fā)酵：用量筒配合移液槍(槍頭已滅菌)剩余的發(fā)酵液 量取26.60ml發(fā)酵液于9號250ml錐形瓶中，用pH電極將發(fā)酵液P的周至5.60，同樣于滅菌鍋中 在12TC下滅菌20min，滅菌結(jié)束待其冷卻后，用移液槍（槍頭已滅菌）在超凈臺中量取 6.65ml種子液加入9號250ml錐形瓶中，于搖床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì)菌 纖維素。
[0092] 步驟4產(chǎn)物的提純與稱量:將4.巧1111皿抓516.2發(fā)酵生成的膜或團塊取出后，先 用自來水沖洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此時產(chǎn)物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去離子水徹底漂洗直至溶液成中性為止，然后將膜和團塊(保持 平整)置于冷凍干燥下冷凍10小時，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重。纖維素 產(chǎn)量表示為:g/L(培養(yǎng)液）。
[0093] 實施例6
[0094]步驟巧巾子培養(yǎng)液的配制:不需要重復(fù)。
[00%]步驟巧巾子培養(yǎng)液的接種與搖床培養(yǎng):不需要重復(fù)。
[0096] 步驟3發(fā)酵培養(yǎng)液的配制及發(fā)酵：用量筒配合移液槍(槍頭已滅菌)剩余的發(fā)酵液 量取28.54ml發(fā)酵液于11號250ml錐形瓶中，用抑電極將發(fā)酵液抑調(diào)至4.60，同樣于滅菌鍋 中在12TC下滅菌20min，滅菌結(jié)束待其冷卻后，用移液槍（槍頭已滅菌）在超凈臺中量取 4.71ml種子液加入11號250ml錐形瓶中，于搖床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì)菌 纖維素。
[0097] 步驟4產(chǎn)物的提純與稱量:將4.巧1111皿抓516.2發(fā)酵生成的膜或團塊取出后，先 用自來水沖洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此時產(chǎn)物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去離子水徹底漂洗直至溶液成中性為止，然后將膜和團塊(保持 平整)置于冷凍干燥下冷凍10小時，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重。纖維素 產(chǎn)量表示為:g/L(培養(yǎng)液）。
[009引實施例7
[0099] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的配制:不需要重復(fù)。
[0100] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的接種與搖床培養(yǎng):不需要重復(fù)。
[0101] 步驟3發(fā)酵培養(yǎng)液的配制及發(fā)酵：用量筒配合移液槍(槍頭已滅菌)剩余的發(fā)酵液 量取42.92ml發(fā)酵液于12號250ml錐形瓶中，用抑電極將發(fā)酵液抑調(diào)至4.60，同樣于滅菌鍋 中在12TC下滅菌20min，滅菌結(jié)束待其冷卻后，用移液槍（槍頭已滅菌）在超凈臺中量取 7.08ml種子液加入12號250ml錐形瓶中，于搖床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì)菌 纖維素。
[0102] 步驟4產(chǎn)物的提純與稱量:將4.巧1111皿^516.2發(fā)酵生成的膜或團塊取出后，先 用自來水沖洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此時產(chǎn)物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去離子水徹底漂洗直至溶液成中性為止，然后將膜和團塊(保持 平整)置于冷凍干燥下冷凍10小時，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重。纖維素 產(chǎn)量表示為:g/L(培養(yǎng)液）。
[0103] 實施例8
[0104] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的配制:不需要重復(fù)。
[0105] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的接種與搖床培養(yǎng):不需要重復(fù)。
[0106] 步驟3發(fā)酵培養(yǎng)液的配制及發(fā)酵：用量筒配合移液槍(槍頭已滅菌)剩余的發(fā)酵液 量取46.30ml發(fā)酵液于14號250ml錐形瓶中，用抑電極將發(fā)酵液抑調(diào)至5.60，同樣于滅菌鍋 中在12TC下滅菌20min，滅菌結(jié)束待其冷卻后，用移液槍（槍頭已滅菌）在超凈臺中量取 3.70ml種子液加入14號250ml錐形瓶中，于搖床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì)菌 纖維素。
[0107] 步驟4產(chǎn)物的提純與稱量:將4.巧1111皿^516.2發(fā)酵生成的膜或團塊取出后，先 用自來水沖洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此時產(chǎn)物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去離子水徹底漂洗直至溶液成中性為止，然后將膜和團塊(保持 平整)置于冷凍干燥下冷凍10小時，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重。纖維素 產(chǎn)量表示為:g/L(培養(yǎng)液）。
[010引實施例9
[0109] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的配制:不需要重復(fù)。
[0110] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的接種與搖床培養(yǎng):不需要重復(fù)。
[0111] 步驟3發(fā)酵培養(yǎng)液的配制及發(fā)酵：用量筒配合移液槍(槍頭已滅菌)剩余的發(fā)酵液 量取30.79ml發(fā)酵液于15號250ml錐形瓶中，用抑電極將發(fā)酵液抑調(diào)至5.60，同樣于滅菌鍋 中在12TC下滅菌20min，滅菌結(jié)束待其冷卻后，用移液槍（槍頭已滅菌）在超凈臺中量取 2.46ml種子液加入15號250ml錐形瓶中，于搖床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì)菌 纖維素。
[0112] 步驟4產(chǎn)物的提純與稱量:將A.xylinumNUST6.2發(fā)酵生成的膜或團塊取出后，先 用自來水沖洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此時產(chǎn)物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去離子水徹底漂洗直至溶液成中性為止，然后將膜和團塊(保持 平整)置于冷凍干燥下冷凍10小時，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重。纖維素 產(chǎn)量表示為:g/L(培養(yǎng)液）。
[011引實施例10
[0114] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的配制:不需要重復(fù)。
[0115] 步驟巧巾子培養(yǎng)液的接種與搖床培養(yǎng):不需要重復(fù)。
[0116] 步驟3發(fā)酵培養(yǎng)液的配制及發(fā)酵：用量筒配合移液槍(槍頭已滅菌)剩余的發(fā)酵液 量取40.00ml發(fā)酵液于16號250ml錐形瓶中，用抑電極將發(fā)酵液抑調(diào)至5.60，同樣于滅菌鍋 中在12TC下滅菌20min，滅菌結(jié)束待其冷卻后，用移液槍（槍頭已滅菌）在超凈臺中量取 10.00ml種子液加入16號250ml錐形瓶中，于搖床（IGOr/min)30°C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì) 菌纖維素。
[0117] 步驟4產(chǎn)物的提純與稱量:將A.xylinumNUST6.2發(fā)酵生成的膜或團塊取出后，先 用自來水沖洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此時產(chǎn)物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去離子水徹底漂洗直至溶液成中性為止，然后將膜和團塊(保持 平整)置于冷凍干燥下冷凍10小時，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重。纖維素 產(chǎn)量表示為:g/L(培養(yǎng)液）。
[011引表征
[0119] I'SEM
[0120] 結(jié)合圖3,由實施例10制備得到的細(xì)菌纖維素的沈M圖可W看出，木醋桿菌W葡萄 糖酸作唯一碳源所得到的細(xì)菌纖維素膜為=維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，纖維粗細(xì)均勻，與傳統(tǒng)發(fā)酵液制 得的細(xì)菌纖維素在形態(tài)上類似，說明此方法可W應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。
[0121] 2、紅外光譜
[0122] 結(jié)合圖4,由實施例10制備得到的細(xì)菌纖維素的紅外光譜圖可W看出，3343cnfi處 反映了分子間氨鍵引起的0-H基的伸縮振動，在1559cnfi處的吸收峰是由C-H鍵伸縮振動引 起的，深度與纖維素結(jié)晶度有關(guān)，在l〇54cnfi處的吸收峰，是由碳氧鍵的伸縮振動引起的，是 纖維素分子的特征峰，與傳統(tǒng)發(fā)酵液制得的細(xì)菌纖維素結(jié)構(gòu)一致。
[0123] 3、邸 D
[0124] 結(jié)合圖5,由實施例10制備得到的細(xì)菌纖維素的XRD圖可W看出，木醋桿菌W葡萄 糖酸作唯一碳源所得到的細(xì)菌纖維素膜具有較高的結(jié)晶度，布拉格角為14.62、22.82處 有較寬的衍射峰出現(xiàn)，為典型的纖維素 I晶體，與傳統(tǒng)發(fā)酵液所制備的纖維素一致。
【主權(quán)項】
1. 一種以葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化方法，其特征在于，步 驟如下： 步驟1，確定木醋桿菌以葡萄糖酸作唯一碳源需要考慮的發(fā)酵參數(shù)，所述發(fā)酵參數(shù)包括 發(fā)酵液pH、氣液比以及接種量； 步驟2,利用Design Expert8.0.6.1軟件根據(jù)Box-Behnken Design確定實驗方案； 步驟3,按照步驟2所確定的Box-Behnken Design實驗方案完成各組實驗，得到對應(yīng)的 各組細(xì)菌纖維素產(chǎn)量； 步驟4,根據(jù)各組細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量，采用Design Expert8.0.6.1軟件建立響應(yīng)面模 型，確定優(yōu)化的發(fā)酵參數(shù)組合。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化方 法，其特征在于，步驟1所述發(fā)酵參數(shù)的范圍如下：發(fā)酵液pH為4.60~6.60，氣液比為 13 · 30 % ~20 · 00 %，接種量為8 · 00 % ~25 · 00 %。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化方 法，其特征在于，步驟3所述按照步驟2所確定的Box-Behnken Design實驗方案完成各組實 驗，得到對應(yīng)的各組細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，具體如下： (3.1) 根據(jù)步驟2中的實驗方案，配制所需種子培養(yǎng)液，滅菌冷卻完成接種操作后，搖床 30°C下恒溫培養(yǎng)3天，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min; (3.2) 根據(jù)步驟2中的實驗方案，配制所需發(fā)酵培養(yǎng)液，分別分裝至各個錐形瓶中，調(diào)至 各所需PH，滅菌冷卻后，按照步驟2實驗方案中數(shù)據(jù)，分別取相應(yīng)體積的接種量于對應(yīng)發(fā)酵 液中，于搖床30°C下恒溫培養(yǎng)5天來發(fā)酵細(xì)菌纖維素，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min; (3.3) 對步驟(3.2)中由木醋桿菌發(fā)酵生成的細(xì)菌纖維素膜或團塊取出后，先用自來水 沖洗，再浸泡于85 °C的3%。的NaOH溶液中煮2h，然后用4%。的HAc溶液中和，最后用去離子水 漂洗直至溶液成中性為止，然后將細(xì)菌纖維素膜和團塊置于冷凍干燥下冷凍10小時，最后 置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫稱重得到對應(yīng)的各組細(xì)菌纖維素產(chǎn)量。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化方 法，其特征在于，步驟4所確定優(yōu)化的發(fā)酵參數(shù)組合為:發(fā)酵液pH= 5.65，氣液比=20.00 %， 接種量= 16.72%。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的以葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化方 法，其特征在于，步驟（3. 1)中所述種子培養(yǎng)液為葡萄糖2.0%、（NH4)2S040.6 %、 KH2P〇4〇. 1 %、MgS〇4〇. 04%、蛋白胨0.3%、酵母浸粉0.225%、羧甲基纖維素鈉0.04%。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的以葡萄糖酸作唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化方 法，其特征在于，步驟（3.2)中所述發(fā)酵培養(yǎng)液為葡萄糖酸4.5%、蔗糖2.75%、玉米漿 2.0%、（冊4)23〇4〇.1%、1(!12?〇4〇.5%、]\^5〇4〇.07%、乳酸鈣0.02%、似(3〇.15%、檸檬酸 0.06 %、羧甲基纖維素鈉0.04 %。
【文檔編號】C12P19/04GK106047960SQ201610584286
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月22日 公開號201610584286.1, CN 106047960 A, CN 106047960A, CN 201610584286, CN-A-106047960, CN106047960 A, CN106047960A, CN201610584286, CN201610584286.1
【發(fā)明人】孫東平, 梁光蕓, 自強, 顧焱, 陳春濤, 孫汴京, 楊加志
【申請人】南京理工大學(xué)