專利名稱：一種生物法多級(jí)定向轉(zhuǎn)化鄰甲酚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及用生物法轉(zhuǎn)化鄰甲酚類化合物的方法。
背景技術(shù)：
甲酚類化合物是酚類化合物中具有代表性的一種物質(zhì)，是生產(chǎn)殺螟松、倍硫磷、速滅威、二氯苯醚菊酯等殺蟲劑以及彩色膠片、樹脂、增塑劑和香料合成的中間體，具有強(qiáng)烈的腐蝕性及毒性，被美國(guó)EPA列入環(huán)境優(yōu)先控制污染物的名單。關(guān)于含甲酚廢水的處理方法，與物化法相比較，生物法具有經(jīng)濟(jì)、安全、處理閾值低、殘留少、無二次污染等方面的優(yōu)點(diǎn)。目前，人們?cè)跓o害化生物降解甲酚類化合物研究中，發(fā)現(xiàn)在甲酚類化合物污染的土壤、水體中存在的很多細(xì)菌、真菌、藻類及水生動(dòng)植物都具有降解甲酚的能力，在好氧微生物治理過程中，幾乎所有的甲酚類化合物被微生物不同程度的氧化/降解為小分子化合物(X)2和H2O。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)微生物代謝甲酚類化合物能夠形成二醇類、苯甲酸及粘糠酸半醛類中間產(chǎn)物，而這些物質(zhì)正是現(xiàn)代化工、制藥工業(yè)中的重要有機(jī)中間體，應(yīng)用前景十分廣泛。因此，對(duì)鄰甲酚及其同系物的污染物的處理可以從傳統(tǒng)意義上的降低COD、將污染物完全降解礦化為(X)2和H2O,改變?yōu)樯捎杏弥虚g體的生物轉(zhuǎn)化，以最大程度地實(shí)現(xiàn)污染物資源化。2002年，BUhler等利用惡臭假單胞菌Pseudomonas putida mt_2的二甲苯單加氧酶基因工程菌多級(jí)轉(zhuǎn)化甲苯和偏甲基苯，分別生成相應(yīng)的醇和醛。(Characterization and Application of Xylene Monooxygenase for MultistepBiocatalysis. Applied Environmental Microbiology, 2002,68 :560-568)該工程菌對(duì)底物的多級(jí)轉(zhuǎn)化是通過二甲苯單加氧酶基因?qū)谆M(jìn)行三步轉(zhuǎn)化生成相應(yīng)羧酸。這種多級(jí)生物轉(zhuǎn)化方法很難控制各級(jí)轉(zhuǎn)化過程，該方法在轉(zhuǎn)化過程中，未轉(zhuǎn)化的底物如甲苯和偏甲基苯抑制了第二步和第三步轉(zhuǎn)化反應(yīng)，第二步轉(zhuǎn)化所得的相應(yīng)的醇類抑制了第三步反應(yīng)，很難實(shí)現(xiàn)甲苯和偏甲基苯可控、定向轉(zhuǎn)化。大連理工大學(xué)從石化公司污水處理系統(tǒng)二沉池污泥中篩選到的高效苯酚降解菌ArthrcAacter sp. W1，結(jié)合生理生化鑒定、菌株的形態(tài)觀察、Biolog鑒定及16S rDNA 序列分析，該菌株屬于ArthrcAacter種屬，在GenBank中的注冊(cè)號(hào)為EU339930。曲媛媛等人在 Applied Biochemistry and Biotechnology (159 (3). 623-633，2009)上發(fā)表題為“Biodegradation of Mixed PhenolicCompounds Under High Salt Conditions and Salinity Fluctuations byArthrobacter sp. Wl”的文章中提到，該菌能在溫度20 30°C， PH 5. O 9. O和鹽度10 100g/L NaCl條件下以苯酚為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，能夠降解鄰甲酚、間甲酚、對(duì)甲酚、苯甲酸、水楊酸、對(duì)甲基酚、氨基酚、對(duì)苯二酚等多種芳香化合物。根據(jù)苯酚羥化酶的保守序列合成一對(duì)引物，以ArthrcAacter sp. Wl的基因組DNA為模板，通過PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出的基因保守序列，再根據(jù)該苯酚羥化酶基因保守序列，采用染色體步移的方法，獲得了總長(zhǎng)為^90bp的ArthrcAacter sp. Wl菌株的苯酚羥化酶基因全長(zhǎng)序列，其Genbank注冊(cè)號(hào)為FJ610336。由該基因構(gòu)建的基因工程菌對(duì)酚類同系物具有降解作用。大連理工大學(xué)從石化公司污水處理系統(tǒng)二沉池污泥中篩選到高效的聯(lián)苯降解菌株Dyella ginsengisoli sp. LA-4，結(jié)合生理生化鑒定、菌株的形態(tài)觀察、Biolog鑒定及16S rDNA序列分析，該菌株歸屬于Dyellaginsengisoli種屬，其16S rDNA序列在GenBank中的注冊(cè)號(hào)為EF1913M。該菌株已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 2723。利用染色體步移的方法從菌株LA-4的基因組DNA中擴(kuò)增得到完整的bph基因簇，全長(zhǎng)為12186bp，全序列登錄GenBank，序列號(hào)為EU258607，其中聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因BphC為bph基因簇中的5281bp到61%bp。由該基因構(gòu)建的基因工程菌能將3-甲基兒茶酚、兒茶酚、4-氯兒茶酚和4-甲基兒茶酚轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的粘康酸類物質(zhì)。上述兩種菌株的發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)基因工程菌的構(gòu)建，為鄰甲酚類化合物的生物轉(zhuǎn)化提供了有效的微生物資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是提供一種利用苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，實(shí)現(xiàn)鄰甲酚可控的、多級(jí)定向轉(zhuǎn)化的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種生物法多級(jí)定向轉(zhuǎn)化鄰甲酚方法，其特征在于，采用苯酚羥化酶基因工程菌 PH_IND全細(xì)胞，對(duì)鄰甲酚進(jìn)行第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化，得到的產(chǎn)物為3-甲基兒茶酚，然后采用聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4全細(xì)胞，對(duì)3-甲基兒茶酚進(jìn)行第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化；生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)液成分和含量及反應(yīng)條件為第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)液中苯酚羥化酶基因工程菌PH_IND全細(xì)胞干重為 20 40g/L，鄰甲酚濃度為50 700mg/L，葡萄糖濃度為5 40mmol/L ；在20 40°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速為50 200r/min，振蕩反應(yīng)時(shí)間為10 MOmin ；第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，在第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后的反應(yīng)液中加入全細(xì)胞干重為20 40g/L的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，在20 40°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速為50 200r/min，振蕩反應(yīng)時(shí)間為5 50min。苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind是通過獲取高效苯酚降解菌ArthrcAactersp. Wl中苯酚羥化酶基因全長(zhǎng)序列，連接至載體質(zhì)粒(pET28a (+) Vector)，并轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞大腸桿菌中構(gòu)建的，該工程菌PH_ind經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)即得全細(xì)胞培養(yǎng)物，能夠作為全細(xì)胞催化劑對(duì)鄰甲酚及其同系物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。高效苯酚降解菌ArthrcAacter sp. Wl是從石化公司污水處理系統(tǒng)二沉池污泥中篩選到的，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 4763，該菌株的16SrDNA序列的GenBank注冊(cè)號(hào)為EU339930 ；通過PCR反應(yīng)，擴(kuò)增獲得高效苯酚降解菌ArthrcAacter sp. Wl的苯酚羥化酶基因保守區(qū)序列，并采用染色體步移法獲取未知的側(cè)翼序列，得到含有6個(gè)閱讀框、按KLMNOP六組分順序排列的M90bp苯酚羥化酶基因全長(zhǎng)序列，其Genbank注冊(cè)號(hào)為FJ610336。聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA_4，是通過獲取高效聯(lián)苯降解菌Dyella ginsengisoli LA-4中的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因，連接至載體質(zhì)粒(pEI^8a(+) Vector)， 并轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞大腸桿菌中構(gòu)建的，該工程菌BphC_LA-4經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)即得全細(xì)胞培養(yǎng)物，能夠?qū)?-甲基兒茶酚及其同系物轉(zhuǎn)化為粘糠酸類物質(zhì)；高效聯(lián)苯降解菌株Dyella ginsengisoli sp. LA-4是從石化公司污水處理系統(tǒng)二沉池污泥中篩選到的，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 2723，該菌株的 IBSrDNA序列的GenBank注冊(cè)號(hào)為EF191354，利用染色體步移的方法從該菌株的基因組DNA 中擴(kuò)增得到完整的bph基因簇，全長(zhǎng)為12186bp，其Genbank注冊(cè)號(hào)為EU258607，其中聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因BphC為bph基因簇中的5281bp到61%bp。上述第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化是通過工程菌PH_ind的苯酚羥化酶作用，將鄰甲酚轉(zhuǎn)化為 3-甲基兒茶酚，第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化是通過工程菌BphC_LA_4的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶作用，將 3-甲基兒茶酚轉(zhuǎn)化為粘糠酸類物質(zhì)。生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)液成分、含量和反應(yīng)條件最佳參數(shù)為第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)液中苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind全細(xì)胞干重為35 40g/L，鄰甲酚濃度為75 125mg/ L,葡萄糖濃度為15 20mmol/L，在25 35°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速為100 180r/min，振蕩反應(yīng)時(shí)間為180 MOmin ；第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，在第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后的反應(yīng)液中加入全細(xì)胞干重為30 35g/L的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，在25 35°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速為100 180r/min，振蕩反應(yīng)時(shí)間為30 40min。生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)前，苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4的擴(kuò)大培養(yǎng)按常規(guī)條件進(jìn)行。擴(kuò)大培養(yǎng)苯酚羥化酶基因工程菌PH_im時(shí)，首先將工程菌PH_im接種到固體平板 LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)(即平板活化種子)，再將其接種到液體LB培養(yǎng)基中，制得種子培養(yǎng)液， 然后按體積百分比2 5%的接種量接入液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期 OD600 = 0 . 4 0. 6，加入80 100 μ L (8 10mmol/L)的IPTG，誘導(dǎo)2h，離心收集菌體，經(jīng) PH值為7. 0 7. 5、濃度為0. 1 0. 2mol/L的磷酸緩沖液洗滌，然后用相同緩沖液懸浮，使其全細(xì)胞干重達(dá)到20 40g/L。擴(kuò)大培養(yǎng)工程菌BphC_LA_4的條件與工程菌PH_IND的基本相同，但在加入80 100 μ L (8 10mmol/L)的IPTG后需誘導(dǎo)3h，再離心收集菌體。本發(fā)明的多級(jí)定向轉(zhuǎn)化鄰甲酚的方法反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物單一、提取步驟簡(jiǎn)單，可對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行資源化回收利用，使生產(chǎn)過程定向可控，生產(chǎn)周期短，成本低，生產(chǎn)清潔，適合工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用。該方法也可以用于多級(jí)定向轉(zhuǎn)化鄰甲酚的同系物對(duì)甲酚和間甲酚。


圖1為本發(fā)明第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，3-甲基兒茶酚的生成量(mg/mL)隨工程菌 PH_IND全細(xì)胞干重(g/L)變化的曲線，其他參數(shù)不變。圖2為本發(fā)明第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，3-甲基兒茶酚的轉(zhuǎn)化率(％ )隨工程菌 BphC_LA-4全細(xì)胞干重(g/L)變化的曲線，其他參數(shù)不變。圖3為本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)3-甲基兒茶酚的生成量(曲線a，mg/L)和3_甲基兒茶酚轉(zhuǎn)化率(曲線b，%)隨鄰甲酚濃度(mg/L)變化的曲線，其他參數(shù)不變。圖4為本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)3-甲基兒茶酚的生成量(mg/L)隨時(shí)間變化的曲線，其他參數(shù)不變。圖5為本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)3-甲基兒茶酚轉(zhuǎn)化率(％ )隨時(shí)間變化的曲線，其他參數(shù)不變。
本發(fā)明涉及的高效聯(lián)苯降解菌的生物保藏信息保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)大屯路、中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，日期為 2008 年 10 月 24 日，編號(hào) CGMCC No. 2723，分類命名為=Dyella ginsengisoli ；
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1，苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多級(jí)定向轉(zhuǎn)化鄰甲酚，并考察部分參數(shù)對(duì)3-甲基兒茶酚的生成量和轉(zhuǎn)化率的影響。工程菌PH_ind和工程菌BphC_LA_4擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，配方為 10g/L NaCl, 10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，調(diào)節(jié)pH至7. 0 7. 2，121°C條件下滅菌 20min，培養(yǎng)基冷卻后添加終濃度為10 20mmol/L卡那霉素作為抗生素。固體平板培養(yǎng)基配方為L(zhǎng)B培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加15 20g/L瓊脂?；蚬こ叹臄U(kuò)大培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化鄰甲酚反應(yīng)步驟和參數(shù)如下1、分別將工程菌ΡΗ_ΙΝΙ^Π工程菌BphC_LA_4接種到固體平板LB培養(yǎng)基上，于 37°C靜置培養(yǎng)2天，4°C冰箱保存，作為平板活化種子；2、將步驟1所得的工程菌PH_im和工程菌BphC_LA_4的平板活化種子分別接種到液體LB培養(yǎng)基中，在30°C下150r/min振蕩培養(yǎng)12h，制得種子培養(yǎng)液；3、使用步驟2所得的工程菌PH_im種子培養(yǎng)液，按體積百分比2 5%的接種量接入液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期(0D· = 0. 4 0. 6)，加入80 100 μ L (8 10mmol/L)的IPTG，誘導(dǎo)2h，誘導(dǎo)至OD600 = 1. 0 1. 2，離心收集菌體，經(jīng)pH 值為7. 0 7. 5、濃度為0. 1 0. 2mol/L的磷酸緩沖液洗滌，然后用相同緩沖液懸浮，使其干重為35g/L ；使用步驟2所得的工程菌BphC_LA-4種子培養(yǎng)液，按體積百分比2 5% 的接種量接入液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期(0D_ = 0. 4 0. 6)，加入 80 100 μ L (8 10mmol/L)的IPTG，誘導(dǎo)3h，離心收集菌體，經(jīng)pH值為7. 0 7. 5、濃度為0. 1 0. 2mol/L的磷酸緩沖液洗滌，然后用相同緩沖液懸浮，使其干重為30g/L ；4、制備鄰甲酚溶液(IOg鄰甲酚溶于IOOmL無菌水)，然后用濾膜過濾除菌，使溶液中鄰甲酚濃度為lX105mg/L;5、制備葡萄糖儲(chǔ)備液，取198. 16g葡萄糖溶于IL去離子水，儲(chǔ)備液中葡萄糖濃度為 lmol/L ；6、第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制備出的工程菌PH_ IND全細(xì)胞、步驟4制備出的鄰甲酚溶液20 μ L、步驟5制備出的葡萄糖儲(chǔ)備液400 μ L，使反應(yīng)液中鄰甲酚的濃度為100mg/L，葡萄糖的濃度為20mmol/L(加入鄰甲酚和葡萄糖后反應(yīng)液中的工程菌PH_ind全細(xì)胞干重變化很小，可以忽略不計(jì))，在30°C下，搖床轉(zhuǎn)速150r/min， 振蕩反應(yīng)180min ；7、第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)在第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液中加入5mL全細(xì)胞干重為 30g/L的工程菌BphC_LA-4，在30°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速在150r/min，振蕩反應(yīng)30min。測(cè)定3-甲基兒茶酚的生成量和3-甲基兒茶酚轉(zhuǎn)化率第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束時(shí)，取2mL反應(yīng)液，利用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至2. 0， 然后以等體積的乙醚萃取2次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮蒸干，放入-20°C冰箱備用。檢測(cè)時(shí)以氯仿(液體)二甲基甲酰胺(液體)=2 1(體積比，共3mL)回溶旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮蒸干的產(chǎn)物，并用0. 22 μ m有機(jī)膜過濾；第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束時(shí)，取2mL反應(yīng)液，利用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液PH值至2. 0，然后以等體積的乙醚萃取2次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮蒸干，放入_20°C 冰箱備用。檢測(cè)時(shí)以氯仿(液體)二甲基甲酰胺(液體)=2 1(體積比，共3mL)回溶旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮蒸干的產(chǎn)物，并用0. 22 μ m有機(jī)膜過濾；利用Agilent 1100高效液相色譜儀檢測(cè)第一、二級(jí)反應(yīng)萃取液，檢測(cè)波長(zhǎng)276nm，流速1. OmL/min，進(jìn)樣量為10 μ L，柱溫為室溫；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為超純水。每個(gè)樣品的測(cè)定時(shí)間為30min，其中第1 20min 時(shí)，流動(dòng)相A為30 40%，流動(dòng)相B為70 60%，第20. 10 30min時(shí)流動(dòng)相A為30%， 流動(dòng)相B為70%。測(cè)得第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)3-甲基兒茶酚的生成量為83. 51mg/L，第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)3-甲基兒茶酚的轉(zhuǎn)化率為99%。最后，就全細(xì)胞干重、鄰甲酚濃度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)3-甲基兒茶酚的生成量、3-甲基兒茶酚的轉(zhuǎn)化率的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下1)當(dāng)其他參數(shù)采用本實(shí)施例的數(shù)值時(shí)，3-甲基兒茶酚的生成量隨工程菌PH_ind全細(xì)胞干重變化的曲線如圖1所示。2)當(dāng)其他參數(shù)采用本實(shí)施例的數(shù)值時(shí)，3-甲基兒茶酚轉(zhuǎn)化率隨工程菌BphC_LA_4 全細(xì)胞干重變化的曲線如圖2所示。3)當(dāng)其他參數(shù)采用本實(shí)施例的數(shù)值時(shí)，3-甲基兒茶酚的生成量和3-甲基兒茶酚轉(zhuǎn)化率隨鄰甲酚濃度變化的曲線如圖3 (a, b)所示。如圖3 (a)所示，當(dāng)鄰甲酚濃度為IOOmg/ L時(shí)，3-甲基兒茶酚的生成量最大；從圖3(b)可以看出，3-甲基兒茶酚轉(zhuǎn)化率均在98%以上。4)當(dāng)其他參數(shù)采用本實(shí)施例的數(shù)值時(shí)，3-甲基兒茶酚的生成量和3-甲基兒茶酚轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化的曲線如圖4和圖5所示。實(shí)施例2，苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多級(jí)定向轉(zhuǎn)化鄰甲酚。LB培養(yǎng)基配方及基因工程菌的擴(kuò)大培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化鄰甲酚反應(yīng)步驟1 5同實(shí)施例1，通過控制所收集的菌體質(zhì)量使步驟3制得的工程菌PH_ind全細(xì)胞干重為20g/L，工程菌BphC_LA-4全細(xì)胞干重為25g/L。第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的工程菌PH_IND 全細(xì)胞，步驟4制備的鄰甲酚溶液15 μ L，步驟5制備的葡萄糖儲(chǔ)備液600 μ L，使反應(yīng)液中鄰甲酚的濃度為50mg/L，葡萄糖的濃度為30mmol/L，在40°C下，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，振蕩反應(yīng) 60mino第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)在第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液中加入5mL全細(xì)胞干重為 25g/L的工程菌BphC_LA-4，在40°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速在180r/min，振蕩反應(yīng)5min。按實(shí)施例1所述的測(cè)量方法，測(cè)得第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)3-甲基兒茶酚的生成量為 30. 51mg/L，第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)3-甲基兒茶酚的轉(zhuǎn)化率為84%。實(shí)施例3，苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多級(jí)定向轉(zhuǎn)化鄰甲酚。LB培養(yǎng)基配方及基因工程菌的擴(kuò)大培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化鄰甲酚反應(yīng)步驟1 5同實(shí)施例1，其中步驟3制得的工程菌PH_ind全細(xì)胞干重為25g/L，工程菌BphC_LA-4全細(xì)胞干重為 20g/L。第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的工程菌PH_IND 全細(xì)胞，步驟4制備的鄰甲酚溶液40 μ L，步驟5制備的葡萄糖儲(chǔ)備液100 μ L，使反應(yīng)液中鄰甲酚的濃度為200mg/L，葡萄糖的濃度為5mmol/L，在35°C下，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，振蕩反應(yīng) 240min ；第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)在第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液中加入5mL全細(xì)胞干重為 20g/L的工程菌BphC_LA-4，在35°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速200r/min，振蕩反應(yīng)50min。按實(shí)施例1所述的測(cè)量方法，測(cè)得第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)3-甲基兒茶酚的生成量 44. 38mg/L，第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)3-甲基兒茶酚的轉(zhuǎn)化率95%。實(shí)施例4，苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多級(jí)定向轉(zhuǎn)化鄰甲酚。LB培養(yǎng)基配方及基因工程菌的擴(kuò)大培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化鄰甲酚反應(yīng)步驟1 5同實(shí)施例1，其中步驟3制得的工程菌PH_ind全細(xì)胞干重為30g/L，工程菌BphC_LA-4全細(xì)胞干重為 40g/L。第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的工程菌PH_IND 全細(xì)胞，步驟4制備的鄰甲酚溶液140 μ L，步驟5制備的葡萄糖儲(chǔ)備液300 μ L，使反應(yīng)液中鄰甲酚的濃度為700mg/L，葡萄糖的濃度為15mmol/L，在25°C下，搖床轉(zhuǎn)速50r/min，振蕩反應(yīng) 120min ；第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)在第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液中加入5mL全細(xì)胞干重為 40g/L的工程菌BphC_LA-4，在25°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速在50r/min，振蕩反應(yīng)20min。按實(shí)施例1所述的測(cè)量方法，測(cè)得第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)3-甲基兒茶酚的生成量 17. 45mg/L，第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)3-甲基兒茶酚的轉(zhuǎn)化率98%。實(shí)施例5，苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多級(jí)定向轉(zhuǎn)化鄰甲酚。LB培養(yǎng)基配方及基因工程菌的擴(kuò)大培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化鄰甲酚反應(yīng)步驟1 5同實(shí)施例1，其中步驟3制得的工程菌PH_ind全細(xì)胞干重為40g/L，工程菌BphC_LA-4全細(xì)胞干重為 35g/L。第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的工程菌PH_IND 全細(xì)胞，步驟4制備的鄰甲酚溶液40 μ L，步驟5制備的葡萄糖儲(chǔ)備液400 μ L，使反應(yīng)液中鄰甲酚的濃度為125mg/L，葡萄糖的濃度為40mmol/L，在20°C下，搖床轉(zhuǎn)速lOOr/min，振蕩反應(yīng)IOmin ；第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)在第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液中加入5mL全細(xì)胞干重為 35g/L的工程菌BphC_LA-4，在20°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速在lOOr/min，振蕩反應(yīng)40min。按實(shí)施例1所述的測(cè)量方法，測(cè)得第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)3-甲基兒茶酚的生成量 10. 56mg/L，第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)3-甲基兒茶酚的轉(zhuǎn)化率98%。
權(quán)利要求
1.一種生物法多級(jí)定向轉(zhuǎn)化鄰甲酚的方法，其特征在于，采用苯酚羥化酶基因工程菌 PH_IND全細(xì)胞，對(duì)鄰甲酚進(jìn)行第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化，得到的產(chǎn)物為3-甲基兒茶酚，再采用聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4全細(xì)胞，對(duì)3-甲基兒茶酚進(jìn)行第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化；苯酚羥化酶基因工程菌PH_im是通過獲取中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 4763的高效苯酚降解菌Arthrobacter sp. Wl中總長(zhǎng)為5490bp、Genbank 注冊(cè)號(hào)為FJ610336的苯酚羥化酶基因全長(zhǎng)序列，連接至載體質(zhì)粒(pED8a(+) Vector)，并轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞大腸桿菌中構(gòu)建的；聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4是通過獲取中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 2723的高效聯(lián)苯降解菌Dyella ginsengisoli LA-4中的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因，連接至載體質(zhì)粒 (pET28a(+) Vector)，并轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞大腸桿菌中構(gòu)建的；生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)液成分和含量及反應(yīng)條件為第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)液中苯酚羥化酶基因工程菌PH_IND全細(xì)胞干重為20 40g/L，鄰甲酚濃度為50 700mg/L，葡萄糖濃度為5 40mmol/L，在20 40°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速為50 200r/min，振蕩反應(yīng)時(shí)間為10 MOmin ；第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，在第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后的反應(yīng)液中加入全細(xì)胞干重為20 40g/L的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，在20 40°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速為50 200r/min，振蕩反應(yīng)時(shí)間為 5 50min。
2.如權(quán)利要求1所述的生物法多級(jí)定向轉(zhuǎn)化鄰甲酚的方法，其特征在于，生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)液成分和含量及反應(yīng)條件為第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)液中苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind全細(xì)胞干重為35 40g/L，鄰甲酚濃度為75 125mg/L，葡萄糖濃度為15 20mmol/L，在25 35°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速為100 180r/min，振蕩反應(yīng)時(shí)間為180 240min ；第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，在第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后的反應(yīng)液中加入全細(xì)胞干重為 30 35g/L的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，在25 35°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速為100 180r/min，振蕩反應(yīng)時(shí)間為30 40min。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及用生物法轉(zhuǎn)化鄰甲酚類化合物。其特征在于，第一級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)液中苯酚羥化酶基因工程菌PH IND全細(xì)胞干重為20～40g/L，鄰甲酚濃度為50～700mg/L，葡萄糖濃度為5～40mmol/L，在20～40℃溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速為50～200r/min，振蕩反應(yīng)時(shí)間為10～240min，得到的產(chǎn)物為3-甲基兒茶酚；第二級(jí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，在反應(yīng)液中加入全細(xì)胞干重為20～40g/L的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，控制搖床轉(zhuǎn)速為50～200r/min，振蕩反應(yīng)時(shí)間為5～50min。本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物單一，提取步驟簡(jiǎn)單，可對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行資源回收利用，適合工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P7/44GK102226205SQ20111011835
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者周豪, 周集體, 孔春雷, 張旭旺, 張瑞杰, 時(shí)勝男, 曲媛媛, 李新亮, 許炳雯, 馬橋 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)