專利名稱：一種psma重組腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域中的載體及其應(yīng)用，特別是涉及一種PSMA重組腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法與其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腺相關(guān)病毒(AAV)的基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)被鑒定。1983年，Samulski等人描述了 AAV 的末端重復(fù)片段(上游5，端片段，下游3，端片段)(Samulski RJ, Srivastava A，Berns KI, Muzyczka N. Rescue of adeno—associated virus from recombinant plasmids gene correction within the terminal repeats of AAV. Cell. 33 :135-143.)。1984 年， Hermonat等人描述了 AAV的低感染顆粒(lip)基因和包膜(cap)基因(Hermonat PL5Labow MA,Wright R,Berns ΚΙ,Muzyczka N. Genet ics of adeno—associated virus !isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2mutants.J Virol.51 :329-339. Hermonat, P.L. , and Muzyczka. N. Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81 :6466-6470.)。1986 年，Labow等人鑒定了位于上游5，端片段和r印基因之間的p5啟動(dòng)子(Labow MA, Hermonat PL,Berns ΚΙ. Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type2genome. J Virol. 160 :251-258.)。1984年，美國(guó)博沃基因國(guó)際有限公司的主要技術(shù)技術(shù)負(fù)責(zé)人之一 Paul L. Hermonat教授率先證明AAV載體可用于人類疾病的基因治療(Hermonat，P. L.，and Muzyczka. N. Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81 :6466-6470.)。目前，主要是歐美國(guó)家在進(jìn)行以AAV為基礎(chǔ)的基因治療人類疾病的臨床試驗(yàn)。據(jù)美國(guó)糧食和藥品管理局統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)有十余項(xiàng)以AAV為基礎(chǔ)的基因治療臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，主要是將攜帶治療基因的AAV病毒注入患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)治療基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。主要針對(duì)治療的疾病有帕金森氏綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血友病、心力衰竭、進(jìn)行性肌萎縮和奧茲海默綜合癥等非腫瘤性疾病。但是，應(yīng)用于臨床治療的AAV病毒仍存在一些問(wèn)題，例如攜帶治療基因大小受到明顯限制，病毒本身不穩(wěn)定，導(dǎo)致治療基因表達(dá)不穩(wěn)定，以及造成療效不一致。雖然AAV病毒本身的免疫原性很弱，但所表達(dá)的治療基因容易在患者體內(nèi)誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用。AAV是一種非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因產(chǎn)物輔助，才能裝配成為具有感染性的病毒顆粒。AAV基因組全長(zhǎng)約4700堿基對(duì)(bp)，兩端為重復(fù)末端片段(TR)，中間為病毒的結(jié)構(gòu)基因，包括與病毒復(fù)制有關(guān)的Rep基因和病毒衣殼Cap基因。由于存在AAV病毒自身的不穩(wěn)定性及其攜帶外源性基因(治療基因)長(zhǎng)度有限等方面缺陷，因此有必要對(duì)其進(jìn)行基因重組形成重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)。現(xiàn)有大量研究表明，將AAV基因組中的結(jié)構(gòu)基因刪除， 可明顯增加外源性基因的容量。此外，將具有治療作用的外源性基因插入rAAV中，制備成具有感染性的rAAV病毒顆粒，注射入患者體內(nèi)，使其感染體內(nèi)細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)治療基因，從而達(dá)到治療疾病的作用。目前，主要是將rAAV應(yīng)用于帕金森氏綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血友病、心力衰竭、進(jìn)行性肌萎縮和奧茲海默綜合癥等非腫瘤性疾病的治療。但rAAV仍然存在一些不足，如重組病毒不穩(wěn)定，病毒滴度低，接納治療基因的容量仍然有限(一般僅能插入的外源性基因片段最大約2000堿基對(duì)(bp)，否則rAAV的穩(wěn)定性將被破壞)。因此，需要設(shè)計(jì)更為合理的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體，以滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定性高、攜帶外源性基因容量大的PSMA重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體。本發(fā)明所提供的重組腺相關(guān)病毒載體，是將腺相關(guān)病毒(AAV)載體中的腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)基因替換為前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)基因或其突變型基因得到的重組腺相關(guān)病毒載體。本發(fā)明的PSMA重組腺相關(guān)病毒載體是在已知的腺相關(guān)病毒載體的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造得到的，所述腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)基因?yàn)镽印和Lip/Cap基因，腫瘤特異抗原基因PSMA為腫瘤相關(guān)抗原基因，其突變型基因是具有相同功能的相關(guān)腫瘤特異抗原基因片段。已知的腺相關(guān)病毒載體具有p5啟動(dòng)子，為提高目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，還可進(jìn)一步將所述重組腺相關(guān)病毒載體中的P5啟動(dòng)子替換為巨噬細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV) 啟動(dòng)子、beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和SV40病毒啟動(dòng)子中的一個(gè)或幾個(gè)啟動(dòng)子。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述PSMA重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明所提供的構(gòu)建方法，是使用常規(guī)的基因重組的方法，先將腺相關(guān)病毒載體中的腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)基因剔除，再用前述特異抗原基因PSMA或其突變型基因mPSMA取代該剔除基因，得到PSMA重組腺相關(guān)病毒載體。在上述PSMA重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法中，為提高目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，還可進(jìn)一步將所述重組腺相關(guān)病毒載體中的P5啟動(dòng)子替換為巨噬細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和SV40病毒啟動(dòng)子中的一個(gè)或幾個(gè)啟動(dòng)子。與本發(fā)明PSMA重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品，包括重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒、重組腺相關(guān)病毒顆粒和被本發(fā)明重組腺相關(guān)病毒載體感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，如單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系、T淋巴細(xì)胞系等(所述PSMA重組腺相關(guān)病毒載體中的相關(guān)基因或其突變型基因可在單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系或T淋巴細(xì)胞系等細(xì)胞系中在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的作用下獲得表達(dá))等均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。醫(yī)藥用途方面，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抗腫瘤藥物。本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物的活性成分為上述PSMA重組腺相關(guān)病毒載體或與本發(fā)明PSMA重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品。如以本發(fā)明的PSMA重組腺相關(guān)病毒為載體，將腫瘤抗原-野生型和/或突變型腫瘤特異抗原基因?qū)雴魏思?xì)胞-樹突狀細(xì)胞系，并誘導(dǎo)產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞，以達(dá)到患者體外和體內(nèi)免疫刺激的目的，用以治療相關(guān)惡性腫瘤，或以該樹突狀細(xì)胞刺激產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(例如但不僅局限于T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞)治療相關(guān)惡性腫瘤。所述相關(guān)惡性腫瘤為前列腺癌。本發(fā)明所提供的藥物可采用溶劑或粉劑等劑型。所述溶劑的選擇是多種多樣的，如細(xì)胞培養(yǎng)液(基)、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液等均可。需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、吸收促進(jìn)劑和表面活性劑等。用藥方式可為先分離出腫瘤患者體內(nèi)的單核細(xì)胞，再將此藥感染或轉(zhuǎn)染患者的單核細(xì)胞?；?qū)⑥D(zhuǎn)化有野生型和/或突變型前列腺特異抗原PSMA的成熟的樹突狀細(xì)胞所刺激產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞回輸腫瘤患者。上述藥物的用量一般為100 μ 1/5 X IO6/每次，每月2次，療程通常為6個(gè)月。劑
量和療程都可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。為提高療效，本發(fā)明的藥物還可以與抗生素、免疫刺激劑和腫瘤靶向藥物等進(jìn)行組合治療。本發(fā)明還提供了一種殺滅腫瘤的方法。本發(fā)明所提供的殺滅腫瘤的方法，可包括以下步驟1)將腫瘤所在體系(該體系可通過(guò)人工模擬的方式產(chǎn)生或腫瘤患者體內(nèi))中自然產(chǎn)生的單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞被本發(fā)明攜帶野生型腫瘤特異抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體和/或攜帶突變型特異抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體感染或轉(zhuǎn)染，或被與本發(fā)明重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品處理，各自得到處理后的細(xì)胞；2)將步驟1)中處理后的單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤； 或?qū)⑽幢惶幚淼腡淋巴細(xì)胞與所述處理后的單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞混合培養(yǎng)形成抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，再將該抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤；或?qū)⒈惶幚淼腡淋巴細(xì)胞和未被處理的單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤。本發(fā)明所述殺滅腫瘤的方法可具體應(yīng)用到腫瘤治療中，包括給予一個(gè)腫瘤患者回輸抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，該細(xì)胞由來(lái)源于患者的自然產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞與來(lái)源于該患者的單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞混合培養(yǎng)產(chǎn)生的。在混合培養(yǎng)之前，這些在單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞已經(jīng)被本發(fā)明攜帶野生型特異抗原基因的重組腺相關(guān)病毒和/或攜帶突變型特異抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體感染或者轉(zhuǎn)染，或被與本發(fā)明重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品處理；或者，給予一個(gè)腫瘤患者回輸來(lái)源于患者的單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞。在回輸之前， 這些在單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞已經(jīng)被本發(fā)明攜帶野生型特異抗原基因的重組腺相關(guān)病毒和/或攜帶突變型特異抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體感染或者轉(zhuǎn)染，或被與本發(fā)明重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品處理；再或者，給予一個(gè)腫瘤患者回輸上述來(lái)源于患者的T淋巴細(xì)胞和來(lái)源于該患者的自然產(chǎn)生的單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞。在回輸之前，這些T淋巴細(xì)胞已經(jīng)被本發(fā)明攜帶野生型特異抗原基因的重組腺相關(guān)病毒和/或攜帶突變型特異抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體感染或者轉(zhuǎn)染，或被與本發(fā)明重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品處理。本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定性高、攜帶外源性基因容量大的PSMA重組腺相關(guān)病毒 (rAAV)載體。在本發(fā)明的rAAV載體中，AAV的結(jié)構(gòu)基因R印和Lip/Cap基因被野生型或突變型的腫瘤特異性抗原基因PSMA取代。本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒載體可將其攜帶的野生型或突變型的特異性抗原基因輸送入單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系中，攜帶帶有的這些特異性抗原基因的細(xì)胞被用于刺激免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞(不局限于T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞)。 實(shí)驗(yàn)證明，被本發(fā)明的rAAV感染的樹突狀細(xì)胞和所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在患者體內(nèi)可有效地抑制相關(guān)惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或者殺滅腫瘤細(xì)胞，因而，本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒載體或與本發(fā)明重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品可被用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明在惡性腫瘤的臨床治療和應(yīng)用中具有重要的理論和實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為重組腺相關(guān)病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2A至圖2H為八種重組腺相關(guān)病毒載體rAAV的酶切及PCR檢測(cè)結(jié)果；其中圖2B 為rAAV/PSMA的酶切和PCR檢測(cè)結(jié)果。圖3為重組腺相關(guān)病毒rAAV的制備流程圖。圖4為重組腺相關(guān)病毒Raav/PSMA的病毒滴度檢測(cè)結(jié)果。圖5為一種或多種攜帶腫瘤抗原基因的rAAV病毒感染腫瘤患者單核細(xì)胞為基礎(chǔ)的殺滅腫瘤實(shí)驗(yàn)流程。圖6為重組腺相關(guān)病毒rAAV/PSMA感染外周血單核細(xì)胞的效率檢測(cè)結(jié)果。圖7為被重組腺相關(guān)病毒rAAV/PSMA感染的DC表達(dá)⑶80、⑶83以及⑶86水平的檢測(cè)結(jié)果。圖8為被rAAV/PSMA重組腺相關(guān)病毒感染的DC所誘導(dǎo)的CTL的IFN- γ表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果。圖9為被rAAV/PSMA感染的DC所誘導(dǎo)的CTL殺傷腫瘤細(xì)胞以及殺傷特異性檢測(cè)結(jié)果。圖10為一例經(jīng)rAAV/PSMA感染的DC所誘導(dǎo)的CTL治療前后轉(zhuǎn)移病灶變化情況的
影像學(xué)觀測(cè)結(jié)果。圖11為四例經(jīng)rAAV/PSMA感染的DC所誘導(dǎo)的CTL治療前后患者血清中PSMA腫瘤抗原水平的變化情況。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見 《Molecular Cloning :A Laboratory Manual》(Sambrook，J. ,Russell,David W.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所述百分比濃度如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積 (V/V)百分比濃度。所用引物、DNA序列合成及DNA序列測(cè)定均由美國(guó)hvitrogen公司完成。
二部分重纟目腺病毒載彳本rAAV/PSMA實(shí)施例2-1、重組腺相關(guān)病毒載體rAAV/PSMA和rAAV/mPSMA的構(gòu)建及檢測(cè)材料及其來(lái)源A.攜帶AAV 2型全基因組DNA的pBR322質(zhì)粒(命名為pBR_AAV2)由美國(guó)博沃基因國(guó)際有限公司的主要技術(shù)技術(shù)負(fù)責(zé)人之一 Paul L. Hermonat教授制備(Hermonat，P. L.， and Muzyczka,N. Use of adeno—associated virus as a mammalian DNA cloning vector transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81 :6466-6470.)。B.人原代前列腺癌細(xì)胞從前列腺癌患者的癌組織中分離獲得或從商業(yè)渠道獲得。C.攜帶CMV啟動(dòng)子的pCI-neo質(zhì)粒購(gòu)于美國(guó)!Iomega公司，攜帶SV40早期啟動(dòng)子的質(zhì)粒PSG4M購(gòu)于美國(guó)Clonitic公司。D.基因擴(kuò)增核苷酸引物根據(jù)美國(guó)基因庫(kù)中公開發(fā)表的人前列腺特異性膜抗原 (prostate-specific membrane antigen, PSMA)基因序列設(shè)計(jì)(美國(guó) NCI 基因庫(kù)M99487)， 但由于前列腺特異性膜抗原(PSMA)基因mRNA于核苷酸序號(hào)(nt)自5’端第1513-1962 位的基因序列與人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的基因序列相同，故設(shè)計(jì)時(shí)，將此段基因序列刪除。用下述方法構(gòu)建本發(fā)明攜帶前列腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen,PSMA)基因或其突變型基因的重組腺相關(guān)病毒載體(如圖1所示)，具體過(guò)程包括以下步驟一、重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建A. pBR-AAV2質(zhì)粒的改建，具體方法為先用限制性內(nèi)切酶Bst98I和Hpa I (購(gòu)自美國(guó)!Iomega公司)將pBR_AAV2質(zhì)粒中的腺相關(guān)病毒AAV基因組的結(jié)構(gòu)基因R印和Lip/ Cap 基因完全切除，反應(yīng)體系為1 μ g pBR-AAV2, IOU Bst98I，10U Hpa 1,2. 5μ 1 IOX 緩沖液D以及19. 5μ 1去離子水；反應(yīng)條件為在37°C下水浴4小時(shí)。然后，將含有限制性內(nèi)切酶EcoR I和EcoR V酶切位點(diǎn)的核苷酸序列(CGAATTCATGCGATATCGTT)插入質(zhì)粒中，反應(yīng)體系為500ng質(zhì)粒，300ng EcoR I和EcoR V的核苷酸序列，IOIU T4DNA連接酶(購(gòu)自美國(guó)Promega公司)，1.5μ 1 IOXT4DNA連接緩沖液以及11.5μ 1去離子水；反應(yīng)條件為在 4°C下水浴8小時(shí)。然后，保留兩端完整的TR序列或?qū)AV基因組的兩端TR的第75位核苷酸序列處均插入由9個(gè)核苷酸組成的片段CTGCGCTGG，目的是提高rAAV病毒的穩(wěn)定性以及提高病毒的復(fù)制效率，方法為首先用限制性內(nèi)切酶Ban I (購(gòu)自美國(guó)!Iomega公司) 切割兩端的TR，反應(yīng)體系為Iyg上述制備的質(zhì)粒，IOU Ban 1,1.5μ 1 IOX緩沖液G以及 11. 5 μ 1去離子水；反應(yīng)條件為在37°C下水浴4小時(shí)，再將9個(gè)核苷酸片段插入質(zhì)粒中， 反應(yīng)體系為500ng質(zhì)粒，300ng 9個(gè)核苷酸序列，IOIU T4DNA連接酶(購(gòu)自美國(guó)!Iomega公司)，1.5μ 1 10 X T4DNA連接緩沖液以及11. 5μ 1去離子水；反應(yīng)條件為在4°C下水浴8小時(shí)。B.采用基因擴(kuò)增技術(shù)(多聚酶鏈反應(yīng)，PCR)擴(kuò)增CMV啟動(dòng)子，SV40早期啟動(dòng)子。具體方法為先以pCI-neo質(zhì)粒(購(gòu)自美國(guó)Promega公司)為模板，在引物1: AGATCTTCAATATTGGCCAT 和弓丨物 2 TGTCAGAAGCACTGACTGC 的引導(dǎo)下 PCR 擴(kuò)增 CMV 啟動(dòng)子， PCR擴(kuò)增條件為先94°C 4分鐘；再94°C 30秒，60°C 35秒，72°C 1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C 8分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在740bp處出現(xiàn)一條預(yù)期的特異性條帶，將該目的條帶回收并純化后得到CMV啟動(dòng)子。再以pSG4M質(zhì)粒(購(gòu)自美國(guó)Clonit ic公司)為模板，在引物3 GAACCAGCTGTGGAATGTGTC和引物4 TCAGGAAGCTTAGATCTAGC的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增SV40早期啟動(dòng)子，PCR擴(kuò)增條件為先94°C 4分鐘；再94°C 30秒，60°C 35秒，72°C 40，秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C 8分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在359bp處出現(xiàn)一條預(yù)期的特異性條帶，將該目的條帶回收并純化后得到SV40早期啟動(dòng)子。C. PCR 擴(kuò)增 beta 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子 PSMA cDNA (nt260_1512)及其短 PSMA cDNA 片段(分別命名為A(自5’端第260-562位堿基)、B(自5’端第563-862位堿基)、C(自5’ 端第 863-1162 位堿基)、D(自 5，端第 1163-1513 位堿基)以及 PSMAcDNA(nt 1963-2514) 及其短PSMA cDNA片段(分別命名為E(自5’端第1963-2211位堿基)、F自5’端第 2212-2514位堿基)，本實(shí)施例以上述片段為例但不限于上述片段，其它與PSMA cDNA具有相同功能的PSMA cDNA片段均可用于構(gòu)建本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒載體)，具體方法為 采用核酸分離技術(shù)，從人原代前列腺癌細(xì)胞中分離總DNA和mRNA(也可人工合成或從商業(yè)渠道獲得該總DNA和mRNA)，然后以總DNA為模板，在引物5 :CCCGGGCCCAGCACCCCAAG和引物6 :CATCCATGGTGAGCTGCG的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，PCR擴(kuò)增條件為先 940C 4分鐘；再94°C 30秒，58°C 35秒，72°C 1分鐘20秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C 8分鐘， 反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1176bp處出現(xiàn)一條預(yù)期的特異性條帶，將該目的條帶回收并純化后得到beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。再將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成其 cDNA 并以此為模板，在引物 7 :AGATGTGGAATCTCCTTCAC 和引物 8 CAAAATTGTTCTTCTAGGTC 的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增PSMA cDNA(nt260-1512)，PCR擴(kuò)增條件為先94°C 4分鐘；再94°C 30 秒，60°C 35秒，72°C 1分鐘30秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C 8分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1298bp處出現(xiàn)一條預(yù)期的特異性條帶，將該目的條帶回收并純化后得到PSMA cDNA(nt260-1512)，用上述相同方法得到其cDNA片段A(引物 7 禾口弓 I 物 9 CCACTGGGATTGAATTTTG, PSMA cDNA 片段 B (引物 10 :TTTCTTAAACCGGACCT 禾口弓丨物 11 :AATTTTCCCAGAGCAATTG、PSMA cDNA 片段 C(引物 12 CATTAACGGTCTATACCCT 禾口弓丨物 13 :ATAGTATCCAATTGGATG)、PSMA cDNA 片段 D(弓丨物 15 CTACGTGTCTTCGAGGATC 禾口弓I 物 8)、PSMA cDNA(ntl963-2514)(弓| 物 16 CCAATGTTTAAATATCACCTC 禾口弓| 物 17 TTAGGCTACTTCACTTCAC)、短 PSMA cDNA 片段 E (引物 16 和引物 19 GAGTCTCTCACTGAACTTGG)、 短 PSMA cDNA 片段 F (引物 20 CAGGACTTTGACAAAAGCAAC 和引物 17)。D.采用DNA連接技術(shù)，將上述擴(kuò)增的CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、全長(zhǎng)PSMA cDNA或部分PSMA cDNA片段依次插入步驟A經(jīng)改建的pBR_AAV2載體中， 為插入啟動(dòng)子，首先進(jìn)行酶切反應(yīng)，然后進(jìn)行連接反應(yīng)，其中，酶切反應(yīng)體系為lyg質(zhì)粒； IOU限制性內(nèi)切酶BamH I和Ml I (購(gòu)自美國(guó)!Iomega公司)，2. 5 μ 1 IOX緩沖液C以及 19. 5μ 1去離子水；反應(yīng)條件為在37°C下水浴4小時(shí)，連接反應(yīng)體系為500ng酶切后的質(zhì)粒，300ng啟動(dòng)子DNA，10IU T4DNA連接酶(購(gòu)自美國(guó)Promega公司)，1. 5 μ 1 10 X T4DNA連接緩沖液以及11. 5μ1去離子水；反應(yīng)條件為在4°C下水浴8小時(shí)。然后，將攜帶有啟動(dòng)子的質(zhì)粒和全長(zhǎng)的PSMA cDNA分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和EcoRV酶切。酶切反應(yīng)以及進(jìn)行連接反應(yīng)的體系和條件與上述相同。最后分別得到攜帶有CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、
9beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和全長(zhǎng)PSMA cDNA的重組腺相關(guān)病毒載體(命名為rAAV/PSMA)，以及攜帶有CMV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和A或B或C或D不同PSMA cDNA 片段(突變型)或 PSMA cDNA (nt 1963-2514)或 PSMA cDNA (nt 1963-2514)突變型片段 E 或F的重組腺相關(guān)病毒載體(分別命名為rAAV/AmPSMA、rAAV/BmPSMA、rAAV/CmPSMA、rAAV/ DmPSMA, rAAV/PSMA cDNA (nt 1963-2514)、rAAV/EmPSMA, rAAV/FmPSMA，統(tǒng)一命名為 rAAV/ mPSMA)。Ε.將連接后的DNA-rAAV/PSMA和rAAV/mPSMA分別導(dǎo)入基因工程大腸桿菌 (E. coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞(美國(guó)hvitrogen公司)，用含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行抗性篩選，挑取白色單菌落，提取質(zhì)粒并純化，得到rAAV/PSMA質(zhì)粒和rAAV/mPSMA質(zhì)粒。二、重組腺相關(guān)病毒載體的檢測(cè)先對(duì)步驟一獲得的經(jīng)純化的rAAV/PSMA質(zhì)粒和rAAV/mPSMA質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶 (購(gòu)自美國(guó) Promega 公司，依次為 Nhe I&EcoR V,Hind III&EcoR I,Not I&Nhe I 和 Pst I) 進(jìn)行酶切，同時(shí)以無(wú)PSMA基因的rAAV載體為陰性對(duì)照(將CMV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、beta 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子依次插入步驟A經(jīng)改建的pBR-AAV2載體得到，將該載體用限制性內(nèi)切酶 Pst I酶切)，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其中rAAV/PSMA質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果如圖2B所示(1. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。2.無(wú)PSMA基因的rAAV載體(Pst I內(nèi)切酶)。4. rAAV/PSMA (Nhe I 和 EcoR V 內(nèi)切酶)。5. rAAV/PSMA (Hind III 禾口 EcoR I 內(nèi)切酶)。 6. rAAV/PSMA (Not I 和 Nhe I 內(nèi)切酶)。7. rAAV/PSMA (Pst I 內(nèi)切酶))，經(jīng) Nhe I 和 EcoR V 酶切獲得了 1298bp的特異性條帶，經(jīng)Hind III和EcoR I酶切獲得了 2. 7kb和4. 9kb的特異性條帶，經(jīng)Not I和NheI酶切獲得了 1. Ikb的特異性條帶，經(jīng)I3St I酶切獲得了 0. 37kb 和1. Skb的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。rAAV/mPSMA質(zhì)粒的酶切檢測(cè)結(jié)果也與預(yù)期結(jié)果相符。再對(duì)rAAV/PSMA質(zhì)粒和rAAV/mPSMA質(zhì)粒用基因擴(kuò)增(PCR)的方法做進(jìn)一步的檢測(cè)， 其中rAAV/PSMA質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果如圖2B所示(3. PCR基因擴(kuò)增產(chǎn)物)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了 1298bp 的預(yù)期的特異性條帶。rAAV/mPSMA質(zhì)粒的PCR檢測(cè)結(jié)果也與預(yù)期結(jié)果相符(擴(kuò)增產(chǎn)物的大小依次為 rAAV/AmPSMA :303bp、rAAV/BmPSMA :300bp、rAAV/CmPSMA :300bp、rAAV/DmPSMA 351bp 以及 PSMA cDNA(ntl963_2514) :552bp、rAAV/EmPSMA :249bp、rAAV/FmPSMA :303bp。 上述檢測(cè)結(jié)果表明獲得了插入位置及序列均正確的攜帶前列腺特異性膜抗原(PSMA)基因的重組腺相關(guān)病毒載體rAAV/PSMA和以及攜帶前列腺特異性膜抗原(PSMA)突變型基因的重組腺相關(guān)病毒載體rAAV/mPSMA。實(shí)施例2-2、重組腺相關(guān)病毒(rAAV)的制備及病毒滴度測(cè)定材料及其來(lái)源A.實(shí)施例2-1構(gòu)建的攜帶前列腺特異性膜抗原(PSMA)基因的重組腺相關(guān)病毒載體rAAV/PSMA和以及攜帶前列腺特異性膜抗原(PSMA)突變型基因的重組腺相關(guān)病毒載體 rAAV/mPSMA (rAAV/AmPSMA, rAAV/BmPSMA、rAAV/CmPSMA 和 rAAV/DmPSMA)。B.含AAV的R印基因和Lip/Cap基因的輔助質(zhì)粒pHelper:由美國(guó)阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院基因治療中心劉勇教授構(gòu)建(Liu, Y.，Chiriva-Internati, M.，Grizzi, F. Salat i, Ε. , Roman ,J.J. , Lim S. ,and Hermonat,P. L. Rapid induct ion of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16 E6antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8 :948-957.)。C.含有整合于細(xì)胞染色體并表達(dá)的腺病毒基因(El、E2A、E4、VAI和VAII基因)的AAV-HEK293細(xì)胞由美國(guó)阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院基因治療中心建立(Liu， Y. , Chiriva-Internati, Μ. , Grizzi, F. Salati, Ε. , Roman, J. J. , Lim S. , and Hermonat, P. L. Rapid induction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16 E6 antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector. Cancer Gene Therapy 8 :948-957.)。D.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin 購(gòu)自美國(guó)hvotrogen公司。Ε. DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(或小牛血清)購(gòu)自美國(guó)Cellgro公司。F. PCR DIG標(biāo)記試劑盒和DIG雜交檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士 Roche公司。G. DNA拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)分別為IO12拷貝數(shù)(copies)/μ 1至IO6(copies)/ μ 1，購(gòu)自美國(guó)Promega公司。一、重組腺相關(guān)病毒(rAAV)的制備參照?qǐng)D3，用下述方法制備重組腺相關(guān)病毒(rAAV)，以制備一盤10. Ocm細(xì)胞培養(yǎng)皿的病毒為例，當(dāng)AAV-HEK293細(xì)胞在二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)至約占培養(yǎng)皿面積70% 時(shí)，進(jìn)行如下操作A.按照Lipofectin的使用說(shuō)明進(jìn)行操作將1. O μ g rAAV載體(rAAV/PSMA或 rAAV/mPSMA) ,l.Oyg pHelper 質(zhì)粒，4. O μ 1 Lipofectin 和 50. O μ 1 含 10% 胎牛血清(或小牛血清)的DMEM培養(yǎng)基混勻，室溫靜置20分鐘。B.將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。C. 72小時(shí)后，收獲培養(yǎng)皿中的所有細(xì)胞和培養(yǎng)液。D.劇烈振蕩1分鐘后，離心，保留上清，即rAAV病毒液。E.將收集的rAAV病毒液過(guò)濾除菌。將獲得的攜帶腫瘤抗原基因_前列腺特異性膜抗原基因PSMA cDNA(nt260-1512)及其部分PSMA cDNA片段(A、B、C、D，突變型基因) 以及PSMA cDNA(ntl963-2514)及其部分片段(E和F突變型基因)的rAAV病毒分別命名為 rAAV/PSMA、rAAV/AmPSMA、rAAV/BmPSMA、rAAV/CmPSMA、rAAV/DmPSMA 以及 rAAV/PSMA cDNA(ntl963-2514)，rAAV/EmPSMA 和 rAAV/FmPSMA。二、重組腺相關(guān)病毒(rAAV)的病毒滴度測(cè)定采用常規(guī)的斑點(diǎn)雜交法，對(duì)步驟一獲得的各種rAAV病毒(rAAV/PSMA、rAAV/ AmPSMA, rAAV/BmPSMA, rAAV/CmPSMA, rAAV/DmPSMA 以及 rAAV/PSMA cDNA(ntl963- 2514)， rAAV/EmPSMA和rAAV/FmPSMA)進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，具體方法包括以下步驟僅所用的DNA 探針為針對(duì)PSMA基因的特異性探針。A.采用常規(guī)的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒顆粒DNA。B.將尼龍膜置于斑點(diǎn)印跡儀中，加入經(jīng)堿變性的rAAV病毒顆粒DNA，并加入DNA 拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，抽真空。C.取出尼龍膜干燥后，紫外線固定。D.用PCR DIG標(biāo)記試劑盒并參照試劑盒說(shuō)明書制備DIG標(biāo)記的特異性探針，探針為“實(shí)施例 2-1 步驟 C 中所獲得的 PSMA cDNA(nt260-1512)或 PSMAcDNA (nt 1963-2514)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線下檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果均出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，表明探針標(biāo)記成功。E.用DIG雜交檢測(cè)試劑盒并參照試劑盒說(shuō)明書，在雜交爐中對(duì)各種rAAV病毒顆粒 DNA進(jìn)行DNA雜交。其中，rAAV/PSMA的檢測(cè)結(jié)果如圖4B所示，rAAV/PSMA的病毒滴度為IOici-IO11拷貝/mL。rAAV/PSMA cDNA (ntl963_2514)和六種 rAAV/mPSMA 的病毒滴度亦可達(dá)到 IOici-IO12 拷貝/mL。實(shí)施例2-3、腫瘤抗原導(dǎo)入單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系的殺滅腫瘤實(shí)驗(yàn)材料及其來(lái)源A. rAAV 病毒rAAV/PSMA，rAAV/PSMA cDNA (ntl963_2514)和 rAAV/mPSMA (rAAV/ AmPSMA、rAAV/BmPSMA、rAAV/CmPSMA、rAAV/DmPSMA、rAAV/EmPSMA、rAAV/FmPSMA)。B. AIM-V細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)hvitrogen公司。C.細(xì)胞因子集落細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)，白細(xì)胞介素2，4，7 (IL-2，4，7)以及腫瘤壞死因子(TNF-α)購(gòu)自購(gòu)自美國(guó)R&D公司。一、殺滅腫瘤實(shí)驗(yàn)如圖5所示，將本發(fā)明的攜帶前列腺特異膜抗原PSMA基因及其突變型基因的rAAV 病毒感染腫瘤患者單核細(xì)胞為基礎(chǔ)的殺滅腫瘤實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程包括以下步驟A.取腫瘤患者50-150毫升外周血，用血細(xì)胞分離儀(或淋巴細(xì)胞分離液)按常規(guī)方法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，與AIM-V培養(yǎng)基混勻后，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)。B.除去懸浮細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞(單核細(xì)胞，monocyte, Mo)。懸浮細(xì)胞即外周血淋巴細(xì)胞，將其與AIM-V培養(yǎng)基混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)備用。C.加入一種(或多種，效果更佳)本發(fā)明實(shí)施例2-2獲得的rAAV病毒，加入量約為100-1000M0I，同時(shí)再加入GM-CSF (800IU/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。D.除去舊培養(yǎng)基，補(bǔ)充含 GM-CSF，IL-4 (800IU/mL)以及 TNF- a (20IU/mL)的 AIM-V培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。E.培養(yǎng)5天后，收獲成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)，并與所培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞混合， 在AIM-V培養(yǎng)基中加入IL-2 (20IU/mL)以及IL-7 (500IU/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)。F.培養(yǎng)至7-9天后，收獲激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)進(jìn)行檢測(cè)。二、樹突狀細(xì)胞(DC)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的檢測(cè)A. rAAV感染外周血單核細(xì)胞的效率檢測(cè)采用常規(guī)的熒光抗體標(biāo)記染色法，用針對(duì)腫瘤抗原-前列腺特異性膜抗原PSMA的特異性熒光抗體(購(gòu)自美國(guó)R&D公司)標(biāo)記步驟一獲得的被本發(fā)明rAAV感染的單核細(xì)胞或未成熟的DC，再進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。其中，重組腺相關(guān)病毒rAAV/PSMA 感染外周血單核細(xì)胞的效率檢測(cè)結(jié)果如圖6B所示，VrAAV/PSMA感染外周血單核細(xì)胞的效率為92%，所構(gòu)建和制備的各種攜帶腫瘤抗原的rAAV(rAAV/AmPSMA、rAAV/BmPSMA、rAAV/ CmPSMA,rAAV/DmPSMA,rAAV/PSMA cDNA (ntl963_2514)、rAAV/EmPSMA、rAAV/FmPSMA)感染外周血單核細(xì)胞的效率均約為80% -90%，證明本發(fā)明的rAAV具有較高的感染效率。B.樹突狀細(xì)胞(DC)的CD分子水平的檢測(cè)
DC表達(dá)⑶80、⑶83以及⑶86的水平與DC的功能呈正相關(guān)。用與步驟A相同的檢測(cè)方法，即分別采用熒光標(biāo)記的針對(duì)這三種CD分子的抗體(購(gòu)自美國(guó)BD公司)對(duì)步驟一獲得的DC表達(dá)⑶80、⑶83以及⑶86的水平進(jìn)行檢測(cè)，以無(wú)刺激的DC為對(duì)照。其中，重組腺相關(guān)病毒rAAV/PSMA感染的DC表達(dá)⑶80、⑶83以及⑶86水平的檢測(cè)結(jié)果如圖7B所示，被 rAAV/PSMA 及其它攜帶腫瘤抗原的 rAAV (rAAV/AmPSMA、rAAV/BmPSMA, rAAV/CmPSMA、 rAAV/DmPSMA, rAAV/PSMA cDNA (nt 1963-2514)、rAAV/EmPSMA、rAAV/FmPSMA)感染的 DC 所表達(dá)的CD分子水平明顯高于對(duì)照，證明構(gòu)建和制備的攜帶腫瘤抗原-前列腺特異性膜抗原 PSMA及其突變型的rAAV感染外周血單核細(xì)胞后，所誘導(dǎo)的DC的功能強(qiáng)大。C.細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表達(dá)的γ干擾素(IFN-γ)水平的檢測(cè)CTL的功能及其殺傷腫瘤細(xì)胞的能力與IFN-Y的表達(dá)水平呈正相關(guān)。用與步驟A 類似的方法檢測(cè)被本發(fā)明rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL表達(dá)IFN- γ的水平(以無(wú)刺激的 DC所誘導(dǎo)的CTL為對(duì)照。)，DC與外周血淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)結(jié)束后，收獲細(xì)胞，采用傳統(tǒng)的胞內(nèi)染色法進(jìn)行細(xì)胞熒光染色標(biāo)記，所用抗體為針對(duì)IFN-Y的熒光標(biāo)記抗體(購(gòu)自BD公司)，最后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。其中，被rAAV/PSMA感染的DC所誘導(dǎo)的CTL的IFN- γ 表達(dá)水平如圖8Β所示。被rAAV/PSMA及其它攜帶腫瘤抗原的rAAV (rAAV/AmPSMA、rAAV/ BmPSMA,rAAV/CmPSMA、rAAV/DmPSMA、rAAV/PSMA cDNA (nt1963-2514)、rAAV/EmPSMA, rAAV/ FmPSMA)感染的DC所誘導(dǎo)的CTL表達(dá)IFN- γ的水平明顯高于對(duì)照，證明被本發(fā)明構(gòu)建和制備的攜帶腫瘤抗原-前列腺特異性膜抗原及其突變型的rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL功能強(qiáng)大。D.細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)殺傷腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)混合培養(yǎng)結(jié)束后，將步驟一中被rAAV (rAAV/PSMA、rAAV/AmPSMA、rAAV/BmPSMA、 rAAV/CmPSMA,rAAV/DmPSMA,rAAV/PSMA cDNA(nt 1963-2514)、rAAV/EmPSMA、rAAV/FmPSMA) 感染的DC所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞按20 1(淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞)與前列腺癌細(xì)胞混合后，采用傳統(tǒng)的MTT法和51Cr (鉻-51)殺傷試驗(yàn)，檢測(cè)CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。其中rAAV/PSMA感染的DC所誘導(dǎo)的CTL的腫瘤細(xì)胞殺傷率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖9B所示，被本發(fā)明構(gòu)建和制備的攜帶腫瘤抗原-前列腺特異性膜抗原及其突變型的rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的 CTL能夠更有效地裂解(殺傷)腫瘤細(xì)胞，殺傷率可達(dá)50%左右。從三例前列腺癌患者(A、B、C)中分離出前列腺癌細(xì)胞，以肺，胰腺，肝，腎細(xì)胞為對(duì)照，再用上述相同的方法檢測(cè)步驟一中被rAAV (rAAV/PSMA、rAAV/AmPSMA、rAAV/BmPSMA、 rAAV/CmPSMA, rAAV/DmPSMA、rAAV/PSMA cDNA (ntl963_2514)、rAAV/EmPSMA、rAAV/FmPSMA) 感染的DC所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的特異性。其中，被rAAV/PSMA感染的DC所誘導(dǎo)的CTL的腫瘤細(xì)胞殺傷特異性檢測(cè)結(jié)果如圖9B所示，被本發(fā)明構(gòu)建和制備的攜帶腫瘤抗原-前列腺特異性膜抗原及其突變型的rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL對(duì)上述細(xì)胞無(wú)殺傷作用，證明被本發(fā)明構(gòu)建和制備的攜帶腫瘤抗原-前列腺特異性膜抗原及其突變型的rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL具有抗原特異性，即對(duì)抗原陰性的細(xì)胞無(wú)殺傷作用。上述檢測(cè)結(jié)果表明，被本發(fā)明攜帶腫瘤抗原-前列腺特異性膜抗原PSMA及其突變型的rAAV感染的DC(統(tǒng)稱為rAAV-DC)所誘導(dǎo)的CTL對(duì)前列腺癌具有較好的療效，可用于制備抗腫瘤藥物。實(shí)施例2-4、腫瘤治療的臨床實(shí)驗(yàn)
一、療效及存活時(shí)間檢測(cè)應(yīng)用重組腺相關(guān)病毒-樹突狀細(xì)胞技術(shù)，即將實(shí)施例2-3中被本發(fā)明rAAV(rAAV/ PSMA, rAAV/AmPSMA、rAAV/BmPSMA、rAAV/CmPSMA、rAAV/DmPSMA、rAAV/PSMA cDNA (nt 1963-2514)、rAAV/EmPSMA 和 rAAV/FmPSMA)中的一種或兩種感染的 DC(rAAV-DC)所誘導(dǎo)的 CTL回輸14例前列腺癌患者，輸注量為1 X 109-5 X IO90治療療程通常為6個(gè)月，每月2_3 次，病情改善后可減為每月1-2次，進(jìn)一步可減為每1-3月治療一次。以檢測(cè)其在體內(nèi)的抗腫瘤效果。治療效果(rAAV-DC治療后的反應(yīng))統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2-1所示(B 血清腫瘤標(biāo)志物減少或消失。Q 病人生活質(zhì)量改善。如疼痛減輕或消失，食欲增加等等。C:CT or PET-CT 顯示癌癥病灶或轉(zhuǎn)移病灶明顯減小或消失。)，不良反應(yīng)多數(shù)病例治療后短時(shí)間內(nèi)會(huì)出現(xiàn)輕度流感樣反應(yīng)，但病人均能承受，且癥狀短期內(nèi)消失，沒(méi)有觀察到嚴(yán)重不良反應(yīng)及毒性反應(yīng)。療程及生存時(shí)間統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2-2所示(治療后已存活時(shí)間病人開始接受rAAV-DC 治療后的存活時(shí)間(已經(jīng)死亡病例計(jì)算至死亡時(shí))。)，死亡病例均非因rAAV-DC治療引起， 本組病人大多數(shù)處于癌癥終末期，部分病人已經(jīng)因過(guò)度放化療造成免疫功能、肝腎功能衰竭。上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)一步證明，被本發(fā)明的rAAV感染的DC(統(tǒng)稱為rAAV-DC)所誘導(dǎo)的CTL 在患者體內(nèi)能夠發(fā)揮一定的療效，可有效地抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或者殺滅腫瘤細(xì)胞， 且安全性較高，可用于制備抗腫瘤藥物。表2-1用重組腺相關(guān)病毒-樹突狀細(xì)胞技術(shù)(rAAV-DC)治療14例前列腺癌患者的療效的統(tǒng)計(jì)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種PSMA重組腺相關(guān)病毒載體，是將腺相關(guān)病毒載體中的腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)基因替換為前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)基因或其突變型基因得到的重組腺相關(guān)病毒載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒載體，其特征在于將所述重組腺相關(guān)病毒載體中的P5啟動(dòng)子替換為巨噬細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和SV40病毒啟動(dòng)子中的一個(gè)或幾個(gè)啟動(dòng)子。
3.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述重組腺相關(guān)病毒載體的方法，是先將腺相關(guān)病毒載體中的腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)基因剔除，再用所述腫瘤抗原PSMA基因或其突變型基因取代該剔除基因， 得到重組腺相關(guān)病毒載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法還包括將所述重組腺相關(guān)病毒載體中的P5啟動(dòng)子替換為巨噬細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和SV40病毒啟動(dòng)子中的一個(gè)或幾個(gè)啟動(dòng)子的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟A.pBR-AAV2質(zhì)粒的改建先用限制性內(nèi)切酶Bst98 I和Hpa I將pBR_AAV2質(zhì)粒中的腺相關(guān)病毒AAV基因組的結(jié)構(gòu)基因R印和Lip/Cap基因完全切除，然后將含有限制性內(nèi)切酶EcoR I和EcoR V酶切位點(diǎn)的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入質(zhì)粒中，保留兩端完整的TR序列或?qū)AV基因組的兩端TR的第75位核苷酸序列處均插入由9個(gè)核苷酸組成的片段CTGCGCTGG ；B.采用基因擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增CMV啟動(dòng)子和SV40早期啟動(dòng)子；C.PCR擴(kuò)增beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、全長(zhǎng)PSMA cDNA和部分PSMA cDNA片段；D.采用DNA連接技術(shù)，將上述擴(kuò)增的CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、全長(zhǎng)PSMA cDNA或部分PSMA cDNA片段依次插入步驟A經(jīng)改建的pBR_AAV2載體中，為插入啟動(dòng)子，首先進(jìn)行酶切反應(yīng)，然后進(jìn)行連接反應(yīng)，得到攜帶有CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和全長(zhǎng)PSMA cDNA的PSMA重組腺相關(guān)病毒載體(命名為rAAV/ PSMA)，或攜帶有CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和PSMA cDNA片段的突變型PSMA重組腺相關(guān)病毒載體(命名為rAAV/mPSMA)。
6.與權(quán)利要求1或2所述或權(quán)利要求3或4或5所述方法制備得到的PSMA重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品，包括PSMA重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒、PSMA重組腺相關(guān)病毒或被 PSMA重組腺相關(guān)病毒載體感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
7.權(quán)利要求6所述PSMA重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品的制備方法，分別為PSMA重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒的制備在權(quán)利要求5所述方法A-D步驟后增加步驟E 將連接后的DNA-rAAV/PSMA或rAAV/mPSMA分別導(dǎo)入基因工程大腸桿菌(E. coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行抗性篩選，挑取白色單菌落，提取質(zhì)粒并純化,得到rAAV/PSMA質(zhì)粒和rAAV/mPSMA質(zhì)粒；PSMA重組腺相關(guān)病毒的制備以所述PSMA重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒和pHelper質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-HEK293細(xì)胞(宿主細(xì)胞)得到PSMA重組rAAV病毒或突變型PSMA重組rAAV 病毒，分別命名為rAAV/PSMA病毒和rAAV/mPSMA病毒；PSMA重組腺相關(guān)病毒載體感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的制備用所述PSMA重組腺相關(guān)病毒分別或依次感染或轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)和T淋巴細(xì)胞(CTL)得到，所述細(xì)胞系包括單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系和T淋巴細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求1或2所述的PSMA重組腺相關(guān)病毒載體在制備抗前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求7方法制備得到的rAAV/PSMA或rAAV/mPSMA質(zhì)粒、rAAV/PSMA或rAAV/mPSMA病毒、被PSMA重組腺相關(guān)病毒分別或依次感染或轉(zhuǎn)染得到的單核細(xì)胞或DC或CTL在制備抗前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
10.一種體外殺滅腫瘤的方法，包括以下步驟1)將腫瘤所在體系中自然產(chǎn)生的單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞被權(quán)利要求1或 2所述或權(quán)利要求3或4或5所述方法制備得到的攜帶野生型腫瘤抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體和/或攜帶突變型腫瘤抗原基因的PSMA重組腺相關(guān)病毒載體感染或轉(zhuǎn)染，或被權(quán)利要求6所述或權(quán)利要求7方法制備得到的與PSMA重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品處理， 各自得到處理后的細(xì)胞；2)將步驟1)中處理后的單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤；或?qū)⑽幢惶幚淼腡淋巴細(xì)胞與所述處理后的單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞混合培養(yǎng)形成抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，再將該抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤； 或?qū)⒈惶幚淼腡淋巴細(xì)胞和未被處理的單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤。
全文摘要
一種PSMA重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)及其構(gòu)建方法與其應(yīng)用。該rAAV是將腺相關(guān)病毒載體中的腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)基因替換為腫瘤抗原基因PSMA或其突變型基因得到。本發(fā)明的rAAV可將其攜帶的野生型或突變型的前列腺特異性抗原基因輸送入單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系中，被用于刺激免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，被本發(fā)明的rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL在患者體內(nèi)可有效地抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或者殺滅腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒載體或其相關(guān)產(chǎn)品可被用于制備治療前列腺癌的藥物。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102268454SQ20111012563
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月23日
發(fā)明者劉勇, 張文杰 申請(qǐng)人:核力康健生物醫(yī)藥技術(shù)(天津)有限公司