人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人3型腺病毒展示載體的構(gòu)建方法，具體地說(shuō)，涉及一種人3型腺 病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺病毒顆粒，是一種無(wú)囊膜病毒，其為一種具有20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)的的病毒顆粒。 其殼體由252個(gè)亞單位構(gòu)成，其中240亞單位為6鄰體構(gòu)成的三聚體，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中 和抗體以及組合型特異抗體。
[0003] 之前我們發(fā)明了人3型腺病毒展示載體Golden gate的構(gòu)建方法該，可以將外源 片段插入到腺病毒6鄰體高變區(qū)HVR1位置。但是，該方法是低通量的，因?yàn)閱瓮ǖ垒d體構(gòu) 建工作，往往需要做大量的重復(fù)工作，工作重復(fù)性和無(wú)序性常常導(dǎo)致載體構(gòu)建工作中出現(xiàn) 的樣本交叉污染，給工作造成極大不便。另外，隨著生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，目前高通量研 究工作逐漸增多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于Goldgen gate技術(shù)的人3型腺病 毒展示載體高通量構(gòu)建方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：
[0006] 該人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，所述方法包括以下步驟：
[0007] 1)將PCR片段或者合成的核酸片段，純化后稀釋測(cè)定濃度20ng-50ng/ul ;
[0008] 2)將步驟1)的PCR片段或者合成的核酸片段轉(zhuǎn)移至96孔Golden gate反應(yīng)預(yù)制 板，與配置在所述96孔Golden gate反應(yīng)預(yù)制板混合液進(jìn)行Golden gate反應(yīng)；
[0009] 3)將步驟2) Golden gate反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至感受態(tài)細(xì)胞板中，進(jìn)行Golden gate反 應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化；
[0010] 4)將步驟3) Golden gate反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至大型LB固體培養(yǎng)基上，分 離單克隆抗體；
[0011] 5)挑取步驟4)制備的單克隆抗體，并培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至96孔PCR克隆鑒定預(yù)制板，進(jìn) 行Golden gate反應(yīng)產(chǎn)物克隆鑒定；
[0012] 6)將步驟5)鑒定后的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移至96深孔板中，培養(yǎng)后提取克隆質(zhì)粒，并測(cè)定 克隆質(zhì)粒濃度；
[0013] 7)將質(zhì)粒送測(cè)序。
[0014] 上述的人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，步驟1)所述的純化采用微珠進(jìn)行 純化。
[0015] 上述的人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，所述微珠為磁性微珠。
[0016] 上述的人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，每一份所述96孔Golden gate反 應(yīng)預(yù)制板反應(yīng)混合液為1 U L,包括如下重量組分：
[0017]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 將PCR片段或者合成的核酸片段，純化后稀釋測(cè)定濃度20ng-50ng/ul ; 2) 將步驟1)的PCR片段或者合成的核酸片段轉(zhuǎn)移至96孔Golden gate反應(yīng)預(yù)制板， 與配置在所述96孔Golden gate反應(yīng)預(yù)制板混合液進(jìn)行Golden gate反應(yīng)； 3) 將步驟2) Golden gate反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至感受態(tài)細(xì)胞板中，進(jìn)行Golden gate反應(yīng)產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化； 4) 將步驟3) Golden gate反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至大型LB固體培養(yǎng)基上，分離單 克隆抗體； 5) 挑取步驟4)制備的單克隆抗體，并培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至96孔PCR克隆鑒定預(yù)制板，進(jìn)行 Golden gate反應(yīng)產(chǎn)物克隆鑒定； 6) 將步驟5)鑒定后的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移至96深孔板中，培養(yǎng)后提取克隆質(zhì)粒，并測(cè)定克隆 質(zhì)私濃度； 7) 將質(zhì)粒送測(cè)序。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，其特征在于，步驟 1)所述的純化采用微珠進(jìn)行純化。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，其特征在于，所述微 珠為磁性微珠。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，其特征在于，每一份 所述96孔Golden gate反應(yīng)預(yù)制板反應(yīng)混合液為1 μ L,包括如下重量組分： 余量為水。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，其特征在于，步驟 3) 中所述的感受態(tài)細(xì)胞板為96孔感受態(tài)細(xì)胞板。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，其特征在于，步驟 4) 中所述分離單克隆采用畫線方式分離。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，其特征在于，步驟 6)中所述克隆質(zhì)粒采用96孔板質(zhì)粒提取方法進(jìn)行提取。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法，旨在于提供一種基于Goldgen gate技術(shù)的人3型腺病毒展示載體高通量構(gòu)建方法；其技術(shù)方案是：所述方法包括以下步驟：1)將PCR片段或者合成的核酸片段，純化后稀釋測(cè)定濃度；2)轉(zhuǎn)移至96孔Golden gate反應(yīng)預(yù)制板，與配置在所述96孔Golden gate反應(yīng)預(yù)制板混合液進(jìn)行Golden gate反應(yīng)；3)反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至感受態(tài)細(xì)胞板中，進(jìn)行Golden gate反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化；4)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至大型LB固體培養(yǎng)基上，分離單克隆抗體；5)挑取單克隆抗體，并培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至96孔PCR克隆鑒定預(yù)制板，進(jìn)行Golden gate反應(yīng)產(chǎn)物克隆鑒定；6)轉(zhuǎn)移至96深孔板中，培養(yǎng)后提取克隆質(zhì)粒，并測(cè)定克隆質(zhì)粒濃度；7)將質(zhì)粒送測(cè)序；屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【IPC分類】C12N15-861, C12N15-64
【公開(kāi)號(hào)】CN104673833
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510125522
【發(fā)明人】霍依然, 李紅梅, 王文忠
【申請(qǐng)人】覃啟紅
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年3月20日