專利名稱：一種減毒沙門氏菌傳遞雞γ干擾素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種減毒沙門氏菌傳遞雞Y干擾素的制備方法。背景技術(shù)：
IFN可分為兩個(gè)型(I型和II型)，IFN- α、β屬于I型干擾素，IFN- Y屬于II型干擾素，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用。1995年Digby和Lowenthal首次成功地克隆出雞 IFN- y (chIFN- γ )后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)大腸桿菌、酵母、桿狀病毒等表達(dá)系統(tǒng)對(duì)chIFN- γ 做了大量研究。本課題組也曾將chIFN-γ克隆入原核表達(dá)載體pET3h中，但是表達(dá)的蛋白純化步驟繁瑣、在胃容易被胃酸破壞等缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種對(duì)雞具有明顯的抗新城疫病毒 (NDV)的減毒沙門氏菌傳遞雞γ干擾素的制備方法，它以真核質(zhì)粒pVAXl°為載體表達(dá)雞 Y干擾素(chIFN-γ )具有很高的抗VSV活性，并將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌獲得菌種。本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種減毒沙門氏菌傳遞雞Y干擾素的制備方法，其特征在于包括如下步驟
(1)雞Y干擾素(ChIFN-Y)的成熟蛋白的基因序列的擴(kuò)增；
(2)重組真核表達(dá)質(zhì)粒的獲得；
(3)重組真核質(zhì)粒表達(dá)的chIFN-γ活性單位檢測(cè)；
(4)重組質(zhì)粒pVAXl°-chIFN-γ電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌獲得菌種。該減毒沙門氏菌傳遞雞Y干擾素的制備方法，還包括給雞口服傳遞chIFN-γ的減毒沙門氏菌后攻毒保護(hù)試驗(yàn)將減毒沙門氏菌培養(yǎng)增殖后給雞口服，第一天和第二天各口服一次，劑量為IO8Cfu，第3天以50 LD50的新城疫病毒NDV攻毒。該減毒沙門氏菌傳遞雞Y干擾素的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1-1)引物的設(shè)計(jì)及合成；
(1-1-1)根據(jù) GenBank 公布的 ChIFN-γ 的基因序列(GenBank no. AY501004),采用一對(duì)擴(kuò)增chIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特異性引物，在引物chlFN-Y-Fwd的5’端引入 ^coRI酶切位點(diǎn)和Kozak序列，在引物chIFN- y -Rev的5，端引入煬οI酶切位點(diǎn)，引物序列如下
chIFN-γ-Fwd: 5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGACATACTGCAAGTAGT-3’ chIFN-y-Rev:
5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATTAGCAATTGCATCTC-3’ ；
(1-2)從雞的脾淋巴細(xì)胞提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出chIFN-γ的成熟蛋白 cDNA的PCR產(chǎn)物；
(2)用&ORI和損ol雙酶切pVAXl°，膠回收載體片段，與同樣經(jīng)過(guò)雙酶切并膠回收的chlFN-y成熟蛋白基因的PCR產(chǎn)物在16° C過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，篩選出陽(yáng)性克隆 pVAXl°-chIFN-γ ；
(3-1)重組質(zhì)粒 pVAXl°-chIFN- γ 轉(zhuǎn)染 ΗΕΚ493Α 細(xì)胞；
(3-1-1)將1. 0μδ重組真核質(zhì)粒pVAXl°-chIFN- γ轉(zhuǎn)染ΗΕΚ493Α細(xì)胞，24h后反復(fù)凍融細(xì)胞轉(zhuǎn)染物3次，12000rpm離心lOmin，取上清孵育雞胚成纖維細(xì)胞，24h后接毒IOOTCID5q 的 VSV ；
(3-2)重組質(zhì)粒pVAXl°-chIFN- γ表達(dá)的chIFN- Y蛋白抗VSV活性檢測(cè)； (3-2-1)用VSV檢測(cè)IFN的活性單位高達(dá)1 X 106 °U/0. Iml ；
(4)將0. μδ重組真核質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布卡那霉素抗性平板，獲得減毒沙門氏菌菌株。本發(fā)明減毒沙門氏菌傳遞雞Y干擾素的制備方法，通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出雞γ 干擾素(chIFN- y )的成熟蛋白的cDNA序列，將基因克隆入真核質(zhì)粒表達(dá)載體pVAXl°中，獲得了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXl°-chIFN- Y，將該重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ΗΕΚ493Α細(xì)胞，通過(guò)水泡性口炎病毒(VSV)抑制試驗(yàn)證實(shí)了表達(dá)的chIFN-γ具有很好的抗病毒活性。將該重組真核質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌，無(wú)特定病原體(SPF)雞口服后能夠抵抗新城疫病毒NDV的感染。本發(fā)明由減毒沙門氏菌傳遞chIFN- γ，可有效避免雞口服干擾素后易被胃酸降解、蛋白純化步驟繁瑣等問(wèn)題，此種chIFN-γ可以通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵的方法制取，并且減毒沙門氏菌的貯藏方法簡(jiǎn)單，因此具有適合規(guī)?；a(chǎn)、易貯藏等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)雞具有明顯的抗新城疫病毒NDV保護(hù)力，可以為規(guī)?；u場(chǎng)新城疫等病毒性疾病的預(yù)防和治療提供保障。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。圖1為ChIFN-Y成熟蛋白基因克隆入pVAXl°的示意圖； 圖2為重組質(zhì)粒pVAXl°-chIFN- YEcoRl/Xhol雙酶切鑒定結(jié)果。M1 kb plus DNA Marker ； 1 chIFN- γ的PCR產(chǎn)物對(duì)照；
2:重組陽(yáng)性質(zhì)粒pVAXl -chIFN-Y RI/IAoI雙酶切。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
該減毒沙門氏菌傳遞雞Y干擾素的制備方法，包括如下步驟 (1)雞Y干擾素(ChIFN-Y)的成熟蛋白的基因序列的擴(kuò)增 (1-1)引物的設(shè)計(jì)及合成
(1-1-1)根據(jù) GenBank 公布的 ChIFN-Y 的基因序列(GenBank no. AY501004),設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增chIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特異性引物。在引物chIFN-γ-Fwd的5’端引 A^oRI酶切位點(diǎn)和Kozak序列，在引物chIFN- y -Rev的5，端引入煬οI酶切位點(diǎn)，引物序列如下
chIFN-γ-Fwd: 5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGACATACTGCAAGTAGT-3’ chIFN-y-Rev:
5，-GAGCTCGAGAAGCTTATTAGCAATTGCATCTC-3，上下游引物橫跨chIFN-γ成熟蛋白編碼區(qū)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為480bp左右，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成；
(1-2)無(wú)菌采集健康雞的脾臟，用淋巴細(xì)胞分離液分離脾淋巴細(xì)胞，用10%胎牛血清的 1640液在37°C 5%的(X)2培養(yǎng)lh。然后加入50(^g/mL的PHA刺激1 后，用TRIzol試劑提取總RNA，作為RT-PCR的模板；經(jīng)Oligo (?、欧崔D(zhuǎn)錄后以cDNA為模板，以chIFN-γ-Fwd/ chIFN- y -Rev 為引物在進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，體系為 25μ :cDNA μ , Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, 10XLA PCR Buffer 2. 5μ ，chIFN-γ-Fwd/chlFN-γ-Rev濃度均為 400nmol/L， TaKaRa LA Taq 2U。反應(yīng)條件為預(yù)變性95。C 5min ；95° C 45s, 62° C 45s, 72° C 45S，共進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸lOmin，取出產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。這樣采用RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增出了 chIFN- γ的成熟蛋白cDNA的PCR產(chǎn)物；
(2)重組真核表達(dá)質(zhì)粒的獲得
膠回收獲得chIFN-γ成熟蛋白基因的PCR產(chǎn)物，用和損ol雙酶切載體pVAXl° 并膠回收載體片段，與同樣經(jīng)過(guò)雙酶切的chIFN-γ成熟蛋白基因的PCR產(chǎn)物在16°C過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，37° C過(guò)夜培養(yǎng)16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中 37°C過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，第二天提取質(zhì)粒，進(jìn)行feoRI和損ol雙酶切鑒定。鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒 pVAXl°-chIFN-Y交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，用Vector NTI和DNAMar 軟件分析所插入的基因序列和推導(dǎo)氨基酸序列；
(3)重組真核質(zhì)粒表達(dá)的chIFN-γ活性單位檢測(cè)
(3-1)重組質(zhì)粒 pVAXl°-chIFN- γ 轉(zhuǎn)染 ΗΕΚ493Α 細(xì)胞
(3-1-1)在轉(zhuǎn)染的前一天，準(zhǔn)備好ΗΕΚ493Α細(xì)胞的6孔細(xì)胞板，于37° C 5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在滅菌的1. 5mL的離心管中先加入500μ 37° C預(yù)熱的OPTI-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，然后加入1. θμδ的重組質(zhì)粒pVAXl°-chIFN- γ，輕輕混勻；在另一個(gè)滅菌的1. 5mL的離心管中先加入500μ 37° C預(yù)熱的0ΡΤΙ-ΜΕΜ無(wú)血清培養(yǎng)基，然后加入2. 5μ Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，在室溫放置5min ；然后將兩個(gè)1. 5mL的離心管中的液體混勻在一起，室溫放置20min ；從(X)2培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞板，棄去上清，把混合物輕輕加入到細(xì)胞面上，然后立即把細(xì)胞板放入CO2培養(yǎng)箱中；溫育Mi后，吸掉上清，輕輕加入2. OmL 37°C預(yù)熱的10%的胎牛血清DMEM，放入(X)2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)Mh，然后反復(fù)凍融細(xì)胞轉(zhuǎn)染物3次， 12000rpm離心lOmin，取上清待檢；
(3-2)重組質(zhì)粒pVAXl°-chIFN- γ表達(dá)的chIFN- Y蛋白抗VSV活性檢測(cè)
(3-2-1)向生長(zhǎng)于96孔板上的雞胚成纖維細(xì)胞單層加入倍比維持液稀釋的凍融裂解上清，每個(gè)稀釋度4個(gè)孔，于37° C作用24h，吸去上清，每孔接種IOOTCId50 WVSVj37°C 5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24-36h觀察各孔細(xì)胞病變，以能抑制50%細(xì)胞病變的樣品的最高稀釋度定義為IFN的1個(gè)活性單位(IU)；
經(jīng)檢測(cè)，1. 0μδ的重組質(zhì)粒pVAXl -chIFN- γ轉(zhuǎn)染ΗΕΚ493Α細(xì)胞后的裂解上清中，IFN 的活性單位高達(dá)lX106_°U/0. 1ml，從而證明了重組質(zhì)粒pVAXl -chIFN-Y能夠有效表達(dá) ch IFN- γ ；
(4)重組質(zhì)粒pVAXl°-chIFN-γ電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌獲得菌種
挑取減毒沙門氏菌培養(yǎng)平板上的單個(gè)菌落接種3mL LB液體培養(yǎng)基，37°C、200rpm過(guò)夜振蕩培養(yǎng)；次日，將過(guò)夜培養(yǎng)物按饑體積接種IOOmL LB液體培養(yǎng)基，37° C，200rpm振蕩培養(yǎng)，至OD6tltlnm=O. 4 0. 6 ；將培養(yǎng)物冰浴30min，4000rpm離心IOmin收獲菌體；棄去所有上清，用等體積、冰浴冷的WB溶液重懸細(xì)菌，4°C、4000 rpm，離心30min (WB=10%甘油，90%雙蒸水，過(guò)濾或高壓滅菌)；重復(fù)上一步驟2次；棄去大部分WB，使剩余體積為原始培養(yǎng)物的 0. 5%，重懸，即制備得到減毒沙門氏菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。每管分裝50μ ，- 80°C凍存?zhèn)溆?；?. Wg重組真核質(zhì)粒pVAXl°-chIFN-Y電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌的感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)化參數(shù)為2. 5KV，200Q，25PF。電轉(zhuǎn)化后向電極杯中立即加入ImL LB，37° C振蕩培養(yǎng)Ih ；取 200μ 涂布卡那霉素抗性平板，37° C過(guò)夜培養(yǎng)20h。挑取單菌落于卡那霉素抗性的LB中，過(guò)夜振蕩培養(yǎng)獲得減毒沙門氏菌菌株。
實(shí)施例2:
給雞口服傳遞chIFN-γ的減毒沙門氏菌后攻毒保護(hù)試驗(yàn)
將含有質(zhì)粒pVAXl°-chIFN- γ的減毒沙門氏菌過(guò)夜振蕩培養(yǎng)增殖后離心，用PBS液重懸，計(jì)算cfu，同時(shí)設(shè)立不含任何質(zhì)粒的減毒沙門氏菌做對(duì)照。將含有質(zhì)粒pVAXl°-ChIFN- γ 的減毒沙門氏菌和對(duì)照減毒沙門氏菌的濃度均調(diào)整為108cfu/mL。取20只20日齡的SPF 雞隨機(jī)分為2組，試驗(yàn)組口服IO8Cfu的含有質(zhì)粒pVAXl°-chIFN- γ的減毒沙門氏菌，對(duì)照組口服不含任何質(zhì)粒的減毒沙門氏菌。試驗(yàn)第一天和第二天各口服一次，第3天以50 LD5tl的新城疫病毒NDV攻毒，觀察對(duì)照組10只雞全部死亡，而試驗(yàn)組有8只雞無(wú)新城疫癥狀，另外 2只出現(xiàn)了輕微的精神沉郁癥狀，保護(hù)率為80%，因此具有明顯的保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.一種減毒沙門氏菌傳遞雞Y干擾素的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)雞Y干擾素ChIFN-γ的成熟蛋白的基因序列的擴(kuò)增；(2)重組真核表達(dá)質(zhì)粒的獲得；(3)重組真核質(zhì)粒表達(dá)的chIFN-γ活性單位檢測(cè)；(4)重組質(zhì)粒pVAXl°-chIFN-γ電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌獲得菌種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減毒沙門氏菌傳遞雞Y干擾素的制備方法，其特征在于還包括給雞口服傳遞chIFN-γ的減毒沙門氏菌后攻毒保護(hù)試驗(yàn)將減毒沙門氏菌培養(yǎng)增殖后給雞口服，第一天和第二天各口服一次，劑量為108cfu，第3天以50 LD50的新城疫病毒 NDV攻毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減毒沙門氏菌傳遞雞Y干擾素的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1-1)引物的設(shè)計(jì)及合成；(1-2)從雞的脾淋巴細(xì)胞提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出chIFN-γ的成熟蛋白 cDNA的PCR產(chǎn)物；(2)用&ORI和損ol雙酶切pVAXl°，膠回收載體片段，與同樣經(jīng)過(guò)雙酶切并膠回收的 chlFN-y成熟蛋白基因的PCR產(chǎn)物在16° C過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，篩選出陽(yáng)性克隆 pVAXl°-chIFN-γ ；(3-1)重組質(zhì)粒 pVAXl°-chIFN- γ 轉(zhuǎn)染 ΗΕΚ493Α 細(xì)胞； (3-2)重組質(zhì)粒pVAXl°-chIFN- γ表達(dá)的chIFN- Y蛋白抗VSV活性檢測(cè)； (4)將0. μδ重組真核質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布卡那霉素抗性平板，獲得減毒沙門氏菌菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的減毒沙門氏菌傳遞雞γ干擾素的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1-1-1)采用一對(duì)擴(kuò)增chIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特異性引物，在引物 chIFN- y -Fwd的5，端弓丨入^boRI酶切位點(diǎn)和Kozak序列，在引物chIFN- y -Rev的5，端引入損ο 酶切位點(diǎn)，引物序列如下chIFN-γ-Fwd: 5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGACATACTGCAAGTAGT-3’ chIFN-y-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATTAGCAATTGCATCTC-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的減毒沙門氏菌傳遞雞γ干擾素的制備方法，其特征在于包括如下步驟(3-1-1)將1. 0μδ重組真核質(zhì)粒pVAXl°-chIFN- γ轉(zhuǎn)染ΗΕΚ493Α細(xì)胞，24h后反復(fù)凍融細(xì)胞轉(zhuǎn)染物3次，12000rpm離心lOmin，取上清孵育雞胚成纖維細(xì)胞，24h后接毒IOOTCID5q 的 VSV ；(3-2-1)用VSV檢測(cè)IFN的活性單位高達(dá)IX 106_°U/0. 1ml。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別公開(kāi)了一種減毒沙門氏菌傳遞雞γ干擾素的制備方法。該減毒沙門氏菌傳遞雞γ干擾素的制備方法，其特征在于包括如下步驟雞γ干擾素(chIFN-γ)的成熟蛋白的基因序列的擴(kuò)增；重組真核表達(dá)質(zhì)粒的獲得；重組真核質(zhì)粒表達(dá)的chIFN-γ活性單位檢測(cè)；重組質(zhì)粒pVAX1 -chIFN-γ電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌獲得菌種。本發(fā)明由減毒沙門氏菌傳遞chIFN-γ，可有效避免雞口服干擾素后易被胃酸降解、蛋白純化步驟繁瑣等問(wèn)題，此種chIFN-γ可以通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵的方法制取，具有易貯藏等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)雞具有明顯的NDV保護(hù)力，可以為規(guī)?；u場(chǎng)新城疫等病毒性疾病的預(yù)防和治療提供保障。
文檔編號(hào)C12N15/23GK102250919SQ20111014435
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者張旭東, 李玲 申請(qǐng)人:山東步步贏生物科技有限公司