專利名稱：一種分析楊桃品種遺傳多樣性的方法
一種分析楊桃品種遺傳多樣性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析植物品種遺傳多樣性的方法，尤其涉及一種分析楊桃品種遺傳多樣性的方法。
背景技術(shù)：
楊桃(Averrhoa carambola L.)又名陽桃、三稔子、洋桃等，屬南方熱帶名果之一。 楊桃果實(shí)多汁、營(yíng)養(yǎng)豐富，除鮮食外，還可加工成果醬、蜜餞等，另外還具有祛風(fēng)熱、生津止渴、止血生肌等藥效。楊桃分甜楊桃和酸楊桃，其中甜楊桃是久負(fù)盛名的嶺南佳果之一，原產(chǎn)于亞洲東南部熱帶亞熱帶地區(qū)，引入我國(guó)之后部分成為地方優(yōu)良品種，且由于甜楊桃質(zhì)軟味甜，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的醫(yī)藥價(jià)值和食療效果，從而越來越受人們的喜愛。我國(guó)福建省甜楊桃品種來源主要是通過臺(tái)商帶進(jìn)來，尚未開展過官方引種，由于受某些歷史和人為因素影響、及引進(jìn)楊桃品種的臺(tái)商缺乏相應(yīng)的專業(yè)知識(shí)，使得目前福建省甜楊桃同名異種或同種異名現(xiàn)象十分嚴(yán)重，全省現(xiàn)有多少甜楊桃品種尚是個(gè)未知數(shù)，這給全省甜楊桃產(chǎn)業(yè)的良種選育和推廣帶來了很大的困難，既不利于品種產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，也不利于甜楊桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)技術(shù)作為一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和靈敏度高的分子標(biāo)記技術(shù)，其最早是由Williams和Welsh提出， 該技術(shù)無需事先明確被分析材料的基因組結(jié)構(gòu)，且其引物結(jié)合位點(diǎn)在基因組中隨機(jī)分布， 能夠較為全面揭示種質(zhì)資源的遺傳特征。另外，該技術(shù)在準(zhǔn)確控制擴(kuò)增條件的前提下，同樣具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，適合開展親緣關(guān)系較近的遺傳材料的遺傳多樣性研究。目前RAPD技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于荔枝、枇杷、余甘子、桑樹、蘋果、苦瓜、梨、樹莓和桃等植物上； 但至今尚未見對(duì)楊桃遺傳多樣性的系統(tǒng)分析。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種分析楊桃品種遺傳多樣性的方法，為區(qū)分同名異種或者同種異名的楊桃品種提供了一定的依據(jù)，從而為我國(guó)福建省甜楊桃產(chǎn)業(yè)的良種選育和推廣奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的一種分析楊桃品種遺傳多樣性的方法，先采用CTAB法提取供試楊桃的DNA以備用；之后從已合成的138條RAPD隨機(jī)引物中篩選出13條能獲得清晰多態(tài)性條帶且反應(yīng)穩(wěn)定的引物，并分別利用所篩選獲得的13條引物對(duì)供試楊桃的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；待PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取各PCR產(chǎn)物7 μ L分別進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳以檢查擴(kuò)增結(jié)果，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并貯存圖譜；接著參照?qǐng)D譜，設(shè)定每一條DNA帶均為一個(gè)分子標(biāo)記，并代表一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，且將有帶計(jì)為“ 1”、無帶計(jì)為“0”、強(qiáng)帶和弱帶均計(jì)為“ 1”，從而組成“0-1”的數(shù)據(jù)矩陣；然后將所得數(shù)據(jù)通過DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行處理，且以類平均法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，進(jìn)而自動(dòng)生成所有供試楊桃品種的遺傳聚類圖，并統(tǒng)計(jì)各引物的多態(tài)條帶百分率。
進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的體系及條件為反應(yīng)在25 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行，體系中包括 1 個(gè)單位的 Taq 酶、2. 5μ L 的 10XPCR Buffer.O. 5μ L dNTP (IOmM)、1. 0 μ L 的 RAPD引物(10 μ Μ)，并以25ng供試楊桃的DNA為模板；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?4°C變性Imin、復(fù)性38°C 90s、72°C延伸2min，最后72°C 延伸lOmin。本發(fā)明一種分析楊桃品種遺傳多樣性的方法的有益效果在于為區(qū)分同名異種或者同種異名的楊桃品種提供了一定的依據(jù)，從而為我國(guó)福建省甜楊桃產(chǎn)業(yè)的良種選育和推廣奠定了基礎(chǔ)，不僅有利于品種產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，而且還表明了楊桃遺傳多樣性和遺傳背景復(fù)雜性。

下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。圖1是本發(fā)明中部分RAPD引物篩選的電泳圖譜。圖2是本發(fā)明中RAPD引物S103對(duì)17個(gè)楊桃品種擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖譜。圖3是本發(fā)明中RAPD引物S^對(duì)17個(gè)楊桃品種擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖譜。圖4是本發(fā)明中RAPD引物S113對(duì)17個(gè)楊桃品種擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖譜。圖5是本發(fā)明中17個(gè)楊桃品種的聚類圖。
具體實(shí)施方式實(shí)施例一、材料為了更好的對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行闡述，在本實(shí)施例中供試的楊桃品種為 17個(gè)，分別采集各楊桃品種的嫩葉并進(jìn)行編號(hào)，且各楊桃品種名稱及其嫩葉的編號(hào)如表1 所示；138條委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的RAPD隨機(jī)引物。表1供試楊桃品種的名稱及其嫩葉的編號(hào)
編號(hào)名稱1二林種2馬來西亞3臺(tái)農(nóng)1號(hào)4秤錘種5馬來西亞6青干厚斂7黃金香8云霄2號(hào)9紅藤10紅龍11泰國(guó)種12云霄3號(hào)13云霄1號(hào)14楊桃(云霄)15臺(tái)灣軟枝16楊桃(福州)17楊桃(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所)二 ·方法1、供試楊桃嫩葉DNA的制備通過CTAB 法(Hexadecyltrimethylammonium-bromide)提取各楊桃品種嫩葉的 DNA，備用。2、RAPD引物的篩選委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成138條RAPD隨機(jī)引物(IObp寡聚
核苷酸)，它們分別標(biāo)記為S2、S3、S4、......S130，及S190、S191......S199 ；接著將該138
條RAPD隨機(jī)引物通過電泳進(jìn)行篩選(部分RAPD引物篩選的電泳圖譜如圖1所示)，以獲得選擇多態(tài)性好、條帶清晰且比較穩(wěn)定的13條RAPD隨機(jī)引物，它們分別為S5、S24、S29、 S97、S33、S103、S113、S118、S122、S123、S126、S199 和 S197。3、PCR擴(kuò)增反應(yīng)篩選所獲得的13條RAPD隨機(jī)引物對(duì)各楊桃品種的擴(kuò)增過程是一致的，以RAPD隨機(jī)引物S103為例進(jìn)行描述分別以各楊桃品種嫩葉的DNA為模板、RAPD隨機(jī)引物S103為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μ 1體系)如下TaqDNA聚合酶 IOxPCR Buffer dNTP (IOmM) S103 (IOuM) DNA模板 pfu DNA Polymerase(5 U/μΙ)
ddH20 to
1個(gè)單元 2.5 μ 0.5 μ 1.0 μ 25 ng 1 μ 25μ1反應(yīng)條件如下
94 °C 94 °C 38 °C
72 °C
4 min
1 min
90s
2 min
一 40循環(huán)
72 °C 4°C
10 min
保溫待PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取各PCR產(chǎn)物7 μ L分別進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳以檢查擴(kuò)增結(jié)果，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并貯存圖譜；接著參照?qǐng)D譜，設(shè)定每一條DNA帶均為一個(gè)分子標(biāo)記，并代表一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，且將有帶計(jì)為“1”、無帶計(jì)為“0”、強(qiáng)帶和弱帶均計(jì)為“ 1 ”，從而組成“0-1，，的數(shù)據(jù)矩陣；然后將所得數(shù)據(jù)通過DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行處理， 且以類平均法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，進(jìn)而自動(dòng)生成所有供試楊桃品種的遺傳聚類圖，最終統(tǒng)計(jì)各引物的多態(tài)條帶百分率。三、結(jié)果與分析1、RAPD多態(tài)性分析13條RAPD隨機(jī)引物分別對(duì)17個(gè)楊桃品種進(jìn)行的PCR擴(kuò)增結(jié)果見表2，且RAPD隨機(jī)引物S103、S29和S113對(duì)17個(gè)楊桃品種擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖譜見圖2至圖4。由圖2至圖4可見，同一引物在不同品種楊桃材料中擴(kuò)增出不同的譜帶，證明所提取的DNA可以用于 RAPD分析；由表2可知，13條RAPD隨機(jī)引物共產(chǎn)生80條RAPD帶，不同引物獲得的擴(kuò)增帶在4-11條之間，平均6. 15條，RAPD隨機(jī)引物S197擴(kuò)增的條帶最多，達(dá)11條之多，RAPD隨機(jī)引物S118和S199擴(kuò)增的條帶數(shù)量最少，均為4條，且在所擴(kuò)增的條帶中，其中77條為多態(tài)性帶，平均多態(tài)位點(diǎn)5. 92條，多態(tài)率達(dá)97. 19%。由此可知，不同引物所擴(kuò)增出的條帶數(shù)不同，且同一引物、不同楊桃品種間擴(kuò)增出的帶數(shù)也不相同，反映了 17個(gè)楊桃品種之間豐富的多態(tài)性和復(fù)雜的遺傳背景，這不僅為分析楊桃的親緣關(guān)系提供可能，同時(shí)表明楊桃遺傳多樣性和遺傳背景復(fù)雜性。表2不同引物擴(kuò)增的結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種分析楊桃品種遺傳多樣性的方法，其特征在于先采用CTAB法提取供試楊桃的 DNA以備用；之后從已合成的138條RAPD隨機(jī)引物中篩選出13條能獲得清晰多態(tài)性條帶且反應(yīng)穩(wěn)定的引物，并分別利用所篩選獲得的13條引物對(duì)供試楊桃的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；待PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取各PCR產(chǎn)物7 μ L分別進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳以檢查擴(kuò)增結(jié)果，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并貯存圖譜；接著參照?qǐng)D譜，設(shè)定每一條DNA帶均為一個(gè)分子標(biāo)記，并代表一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，且將有帶計(jì)為“ 1”、無帶計(jì)為“0”、強(qiáng)帶和弱帶均計(jì)為 “ 1 ”，從而組成“0-1 ”的數(shù)據(jù)矩陣；然后將所得數(shù)據(jù)通過DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行處理，且以類平均法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，進(jìn)而自動(dòng)生成所有供試楊桃品種的遺傳聚類圖，并統(tǒng)計(jì)各引物的多態(tài)條帶百分率。
2.如權(quán)利要求1所述的一種分析楊桃品種遺傳多樣性的方法，其特征在于所述PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的體系及條件為反應(yīng)在25 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行，體系中包括1個(gè)單位的Taq酶、 2· 5μ L 的 10XPCR Buffer.O. 5μ L dNTP (IOmM)、1· 0 μ L 的 RAPD 引物(10 μ Μ)，并以 25ng 供試楊桃的DNA為模板；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?4°C變性lmin、復(fù)性38°C 90s、72°C延伸2min，最后72°C延伸IOmin0
全文摘要
本發(fā)明提供一種分析楊桃品種遺傳多樣性的方法，先采用CTAB法提取供試楊桃的DNA以備用；之后從已合成的138條RAPD隨機(jī)引物中篩選出13條能獲得清晰多態(tài)性條帶且反應(yīng)穩(wěn)定的引物，并分別利用所篩選獲得的13條引物對(duì)供試楊桃的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的處理。發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于為區(qū)分同名異種或者同種異名的楊桃品種提供了一定的依據(jù)，從而為我國(guó)福建省甜楊桃產(chǎn)業(yè)的良種選育和推廣奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102311995SQ201110158169
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月13日 公開號(hào)201110158169.發(fā)明者劉波, 劉韜, 廖汝玉, 車建美, 黃素芳 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所