專利名稱：一種豬瘟病毒強毒Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鑒別檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬瘟病毒強毒(CSFV) Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鑒別檢測方法，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬瘟(Classicalswine fever，CSF)或(Hog cholera，HC)是一種嚴(yán)重危害豬的烈性病毒性傳染病。由于CSF對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，且難以有效控制，世界動物衛(wèi)生組織(OIE) 曾經(jīng)將其列為A類動物疫病，在2008版的《陸生動物法典》1. 2. 3. 5中將其列為必須報告的7種豬的重要傳染病之一。2008年我國農(nóng)業(yè)部公告1125號《一、二、三類動物疫病病種名錄》中也將其列為17種一類動物傳染病之一。世界各國對CSF都采取嚴(yán)格的防控措施， 將其控制或撲滅。OIE的最新資料顯示，目前在中美洲、南美洲、歐洲、亞洲和非洲部分地區(qū)都有CSF的發(fā)生，北美、澳大利亞和新西蘭已經(jīng)消滅了 CSF。但從20世紀(jì)90年代開始，CSF 又在部分國家和地區(qū)出現(xiàn)暴發(fā)和流行，如新西蘭(1997)、德國(1993-2001)、比利時(1990， 1993，1994)、意大利(1995，1996，1997)、英國(2000)、羅馬尼亞(2000)、斯洛伐克(2000)、 西班牙(2000)、新加坡(2007)。保加利亞在2009年8月發(fā)生過CSF, 2008-2010年1月俄羅斯、2009年墨西哥、2009年巴西、2010年瓜地馬拉等國家和地區(qū)都有CSF發(fā)生病例的報告，可見CSF依然是目前豬群中重要的疫病。雖然各國都對其采取了嚴(yán)厲的措施，但不時仍有新病例的出現(xiàn)乃至疫病的暴發(fā)。對豬瘟的根除還需要下很大的氣力，在本病的研究上也還有許多未知的方面，需要進一步的深入研究。在豬瘟的防控方面，國外發(fā)達國家主要采取撲殺患病豬和帶毒豬而達到對該病的凈化，如歐盟從20世紀(jì)90年代開始采取對豬瘟患豬和豬瘟病毒感染豬進行宰殺的方式而達到對CSF凈化的目的；中國采取的是疫苗免疫接種為主的政策，豬瘟弱毒疫苗是目前生產(chǎn)中主要使用的疫苗，使用最廣泛的是豬瘟兔化弱毒疫苗(C-株)，其免疫保護確實，在豬瘟的防控上起到了重要作用。弱毒疫苗免疫豬雖然可以產(chǎn)生完全的免疫保護，但也存在無法從血清學(xué)上區(qū)分CSFV自然感染豬和疫苗免疫豬的問題，給CSFV感染豬和疫苗免疫豬的鑒別檢測帶來了很大困難；近年來研制的新型豬瘟疫苗，在防止弱毒疫苗毒力返強方面有其優(yōu)勢，但也存在臨床應(yīng)用的問題，如各種豬瘟亞單位疫苗存在免疫效率低，不能提供完全的免疫保護的問題，也不能滿足CSFV感染時的緊急免疫需要。尤其是20世紀(jì)70年代后期國內(nèi)豬瘟的流行和發(fā)病特點發(fā)生了很大變化，在臨床表現(xiàn)趨于復(fù)雜化，出現(xiàn)了所謂“非典型豬瘟”、“溫和型豬瘟”和“帶毒母豬綜合征”，典型性病例減少，給疾病的診斷帶來困難。由于發(fā)達國家對豬瘟采取撲殺而非免疫政策，對豬瘟的診斷還是以血清學(xué)為主，因此某些注射了豬瘟弱毒疫苗的豬群有可能全部被撲殺掉。因此，亟待建立一種可以準(zhǔn)確鑒別診斷CSFV 野毒感染豬和疫苗免疫豬的敏感而特異的方法
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種豬瘟病毒強毒 Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鑒別檢測方法。一種豬瘟病毒強毒Siimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鑒別檢測方法，包括以下步驟(1)合成引物，參照GenBank收錄的CSFV基因組序列，通過MegAlign軟件對其序列進行了比較，在高度保守和強弱毒有明顯差異的區(qū)段設(shè)計引物CSFV 強毒的檢測引物為 CSFV-S-F/CSFV-S-R 上游引物(CSFV-S-F):5，-CAGAAACATCAAATAC-3，(10666-10681)；下游引物(CSFV-S-R):5，-CGTCGGCACAGATT-3，(11093-11080)；CSFV 弱毒的檢測引物為 CSFV-C-F/CSFV-C-R 上游引物(CSFV-C-F):5，-CATGGAGGCGCTGGCA-3，(7532-7547)；下游引物(CSFV-C-R):5，-CACAAATTTCCTTCCGTCT-3，(7796-7778)；(2)提取病毒RNA、合成cDNA模板；(3)PCR擴增，可從弱毒模板中擴增出1條256bp的條帶；可從強毒模板中擴增出1 條42^ρ的條帶。本方法在分析國內(nèi)外提交的CSFV兔化弱毒疫苗株、Shimen株全基因序列的基礎(chǔ)上，分析對比CSFV強毒株和弱毒疫苗株存在基因差異的區(qū)域，設(shè)計特異性引物。通過對標(biāo)準(zhǔn)Siimen株和C株的擴增表明，引物可以特異性擴增豬瘟病毒強毒和豬瘟病毒弱毒且強毒和弱毒之間未見交叉反應(yīng)，該方法未能在其他豬源病毒(PRRSV、PPV、PRV、PCV-2)中擴增出片段，證明該方法具有良好的特異性。該方法只需要進行在反轉(zhuǎn)錄之后進行一次PCR，適合一般實驗室開展進行豬瘟病毒強毒和弱毒的鑒別檢測，可以有效減少免疫未感染豬被誤殺，而產(chǎn)生一定的經(jīng)濟效益。


圖1豬瘟病毒強毒和弱毒的擴增結(jié)果；M. DNA Marker DL 2000 ；1.弱毒引物+弱毒模板；2.強毒引物+強毒模板；3.陰性對照。圖2豬瘟病毒強弱混合毒的擴增結(jié)果；M. DNA Marker DL 2000plus ；1.強弱毒引物+強弱毒模板；2.陰性對照。圖3豬瘟病毒強毒和弱毒的交叉PCR ;M. DNA Marker DL 2000 ；1.強毒引物+強毒 cDNA ；2.強毒引物+弱毒cDNA ;3.弱毒引物+弱毒cDNA ;4.弱毒引物+強毒cDNA。圖4強弱毒引物特異性；M. DNA Marker DL 2000 ；1.陰性對照；2.強弱毒引物+強弱毒模板；3.強弱毒引物+PPV ;4.強弱毒引物+PRV ;5.強弱毒引物+PRRSV ；6.強弱毒引物 +PCV-2。圖5豬瘟病毒強毒株P(guān)CR敏感性；M. DNAMarker DL 2000 ； 1.陰性對照； 2. 1 μ LcDNA ；3. 0. 1 μ L cDNA ；4. 0. 01 μ L cDNA ；5. 0. 001 μ L cDNA。圖6豬瘟病毒弱毒株P(guān)CR敏感性；Μ. DNA Marker DL 2000 ； 1.陰性對照； 2. 1 μ LcDNA ；3. 0. 1 μ L cDNA ；4. 0. 01 μ L cDNA ;5· 1 X 1(Γ3 μ L cDNA ;6· 1 X 1(Γ4 μ L cDNA ； 7. 1Χ1(Γ5μ L cDNA。圖7豬瘟病毒強弱毒株雙重PCR的敏感性；M. DNAMarker DL2000 ；1.陰性對照；2. 2μ L cDNA ；3. 0. 2 μ L cDNA ； 4. 0. 02 μ L cDNA ;5· 2 X 1(Γ3 μ L cDNA ;6· 2 X 1(Γ4 μ L cDNA ； 7. 2Χ1(Γ5μ L cDNA。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。1. 1材料與方法L1.1 材料1. 1. 1. 1 試齊[JTRIzol Reagent 購自 Invitrogen 公司；DNA Marker DL 2000、pMD19_T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購自均大連TaKaRa公司；2XTaq PCR Mix，膠回收試劑盒購自Vigorous。其余均為國產(chǎn)或進口分析純。1. 1. 1. 2 主要儀器純水儀(法國MILIP0RE)，臺式高速離心機(美國Sigma 1-15)，微量移液器(德國印pendorf)，冰箱(日本SANYO MDF-U4086S)，電子天平(美國Adventurer)，制冰機 (美國 GRANT FM70-FM100-FM130)，電泳儀(DYY- III 8B 北京六一儀器廠)，微波爐(Haier M0-2270M1)，干烤箱(上海?，擠GX-914;3B-1)，恒溫培養(yǎng)箱(上海?，擠PX-9082B-1)，超凈工作臺(DL-CJ-1N哈爾濱東聯(lián)電子有限公司)，PCR儀(德國印pendorf Master cycler，美國MJ Research PTC-100)；高速低溫離心機(美國 Sigma3_18，德國印pendorf centrifuge 5414R)。1. 1. 1.3毒株及檢測樣品豬瘟兔化弱毒疫苗株(C株)、豬瘟病毒強毒株(aiimen株)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)，所用病毒株均購自中國獸藥監(jiān)察所。1.1.2 方法1.1.2.1 引物合成參照GenBank收錄的CSFV兔化弱毒疫苗株和^imen株的基因序列，通過 MegAlign軟件對不同分離株的序列進行了比較，在高度保守和強弱毒有明顯差異的區(qū)段設(shè)計引物。CSFV強毒的檢測引物為CSFV-S-F/CSFV-S-R，預(yù)期擴增產(chǎn)物大小428bp。CSFV弱毒的檢測引物為CSFV-C-F/CSFV-C-R，預(yù)期擴增產(chǎn)物長度256bp。引物由北京六合華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，使用濃度為10 μ mol/L。(1)豬瘟病毒強毒shimen株引物序列(參考毒株AF09M48)上游引物(CSFV-S-F) 5，-CAGAAACATCAAATAC-3，(10666-10681)，(SEQ ID N0: 1)；下游引物(CSFV-S-R):5，-CGTCGGCACAGATT-3，(11093-11080)，(SEQ ID NO 2)；預(yù)期擴增片段長度為428bp。(2)豬瘟病毒弱毒引物序列(參考毒株AF091507)上游引物(CSFV-C-F):5，-CATGGAGGCGCTGGCA-3，(7532-7547)，(SEQ ID NO 3)；下游引物(CSFV-C-R)5，-CACAAATTTCCTTCCGTCT-3，(7796-7778)，(SEQ ID N0: 4)；
預(yù)期擴增片段長度為256bp。1. 1. 2. 2豬瘟病毒強毒Siimen株和疫苗弱毒C株檢測RT-PCR方法建立1. 1. 2. 2. 1 病毒 RNA 提取及 cDNA 合成分別取100 μ L豬瘟病毒強毒和弱毒細胞培養(yǎng)物，按照Trizol試劑使用說明書方法抽提總RNA。具體步驟如下(1)于1. 5mL離心管中加病毒細胞培養(yǎng)物100 μ L，再加I^izol lmL，充分混勻，室溫放置IOmin ；(2)加入200 μ L氯仿，顛倒混勻(輕輕)，室溫孵育IOmin ；(3) 40C，12000r/min離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)移到一新1. 5mL離心管中；(4)在上清中加入等體積冰冷異丙醇沉淀RNA，室溫放置20min，4°C 12000r/min離心 IOmin ；(5)棄上清，用75%乙醇(1%。DEPC水配制)洗滌沉淀，每ImL Trizol處理樣品加至少ImL 75%乙醇振蕩離心管，懸浮沉淀，4°C 8000r/min離心5min ；(6)小心吸去上清，室溫干燥沉淀5 lOmin，用無RNase酶水(30 μ L)溶解沉淀， 加1 μ L (40U/ μ L) RNA酶抑制劑(冰上操作)，置_80°C備用。對提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)體系如下
5 xPrimeScript BufferPrimeScript RT Enzyme Mix I0.5 μ Oligo dt Primer(50pmol/L)Random 6 mers(100pmol/L)RNA5 pL總體積IOpL置37°C 25min后，85°C 5s終止反應(yīng)，將cDNA產(chǎn)物置于_20°C保存。1. 1. 2. 2. 2PCR 擴增分別以反轉(zhuǎn)錄獲得的豬瘟病毒強毒shimen株和疫苗弱毒C株的cDNA為模板，用設(shè)計的強、弱毒引物進行PCR擴增。PCR體系為總體積20 μ L，其成分組成如下
2x PCR Mix10 pL
上游引物(1 Ομιηο /L)0.5 μ
下游引物(ΙΟμιηοΙ/L)0.5 μ ,
ddH207 pL
cDNA 模板2 \xL
總體積20 pLPCR 反應(yīng)條件為95°C 3min ；94°C 30s, 50 °C 30s, 72 °C 40s，35 個循環(huán)；72°C 延伸 lOmin，置于4°C保存。
取10 μ L PCR產(chǎn)物，在2. 0%瓊脂糖凝膠上電泳50min，用溴化乙淀染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察記錄結(jié)果。1. 1. 2. 2. 3PCR 產(chǎn)物鑒定PCR產(chǎn)物的膠回收按照下列程序進行(1)在紫外燈下，用干凈的手術(shù)刀片將所需回收的DNA條帶切下，盡量切除不含 DNA的凝膠，得到的凝膠體積越小越好；(2)將切下含有DNA條帶的凝膠放入1. 5mL離心管中，稱重；(稱一個空的1. 5mL 離心管后，放入凝膠塊再稱一次，兩次之差即為凝膠的重量。)(3)加入3倍體積凝膠的溶膠結(jié)合液DB (例如凝膠重為0. Ig即lOOmg，則其體積可視為100 μ L，因此需要加入300 μ L的DB。如果凝膠濃度大于2%，則應(yīng)加入6倍體積凝膠的溶膠結(jié)合液DB。凝膠塊最大不能超過400mg，如果超過400mg，則需要用多個離心柱)， 56 °C 水浴 IOmin ；(4)每IOOmg最初的凝膠重量加入150 μ L異丙醇，震蕩混合；(5)將上步所得溶液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，12000r/min離心 30s 60s，倒掉收集管中的廢液；(6)加入700 μ L漂洗液WB，12000r/min離心lmin，棄掉廢液；(7)加入500 μ L漂洗液WB，12000r/min離心lmin，棄掉廢液；(8)將吸附柱AC放回空的收集管中，12000r/min離心aiiin，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)；(9)取出AC，放入一個潔凈的1. 5mL離心管中，在其吸附膜的中間部位加50 μ L洗脫緩沖液EB (洗脫緩沖液事先在65 70°C水浴中加熱效果更好)，室溫靜置2min，12000r/ min離心lmin。如需較多量的DNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，12000r/min離心lmin，離心管底部的液體即為所需的DNA，_20°C保存，備用。PCR產(chǎn)物直接連接T載體，體系如下PMD19-T Vector0. 5 μ LDNA4· 5 μ LSolution I5μ L在16°C，連接2小時以上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Dffia大腸埃希菌感受態(tài)細胞無菌條件將連接產(chǎn)物加到50 μ L DH5a感受態(tài)細胞中，輕彈混勻后，冰浴30min，期間彈勻2_3次；將轉(zhuǎn)化體系置42°C水浴中熱休克90s，注意不要搖動離心管；快速將離心管置于冰上l-2min，使細胞冷卻；加入 800 μ L預(yù)熱到37°C的無抗生素LB液體培養(yǎng)基，37°C以225r/min慢搖培養(yǎng)45min，使細胞復(fù)蘇；吸取100-200 μ L培養(yǎng)物，均勻涂布于含AmpicillindOO μ g/mL)的LB瓊脂平板上；將平板置于室溫直至液體完全被吸收；倒置平皿，37°C溫箱中培養(yǎng)，12-16h左右。挑取典型單菌落進行PCR鑒定，其體系與普通PCR體系相同；將陽性菌落培養(yǎng)后將菌液送北京六合華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定。1. 1. 2. 2. 4豬瘟病毒強毒shimen株和疫苗弱毒C株檢測雙重PCR的建立(1)分別取80 μ L強毒細胞培養(yǎng)物和20 μ L弱毒細胞培養(yǎng)物混合，Trizol提取混合毒的RNA，過程同1. 1. 2. 2. 1。將獲得的RNA溶解于30 μ L RNase-free水；
(2)對于提取的混合毒RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成混合毒cDNA，體系和方法同前； (3)以豬瘟病毒強弱混合毒cDNA為模板，進行雙重PCR。 體系如下
權(quán)利要求
1. 一種豬瘟病毒強毒Siimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鑒別檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(1)合成引物，參照GenBank收錄的CSFV基因組序列，通過MegAlign軟件對其序列進行了比較，在高度保守和強弱毒株有明顯差異的區(qū)段設(shè)計引物CSFV強毒的檢測引物為CSFV-S-F/CSFV-S-R 上游引物(CSFV-S-F) :5，-CAGAAACATCAAATAC-3，(10666-10681)； 下游引物(CSFV-S-R) :5，-CGTCGGCACAGATT-3，(11093-11080)； CSFV弱毒的檢測引物為CSFV-C-F/CSFV-C-R 上游引物(CSFV-C-F) :5，-CATGGAGGCGCTGGCA-3，(7532-7547)； 下游引物(CSFV-C-R) :5，-CACAAATTTCCTTCCGTCT-3，(7796-7778)；(2)提取病毒RNA、合成cDNA模板；(3)PCR擴增，可從弱毒模板中擴增出1條256bp的條帶；可從強毒模板中擴增出1條 428bp的條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬瘟病毒強毒(CSFV)Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鑒別檢測方法，包括以下步驟(1)合成引物CSFV強毒的檢測引物CSFV-S-F/CSFV-S-R，CSFV弱毒的檢測引物為CSFV-C-F/CSFV-C-R；(2)提取病毒RNA、合成cDNA模板；(3)PCR擴增，可從弱毒模板中擴增出1條256bp的條帶；可從強毒模板中擴增出1條428bp的條帶。該方法只需要在反轉(zhuǎn)錄之后進行一次PCR，適合一般實驗室開展進行豬瘟病毒強毒和弱毒的鑒別檢測，可以有效減少免疫未感染豬被誤殺，而產(chǎn)生一定的經(jīng)濟效益。
文檔編號C12Q1/68GK102230030SQ201110165439
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者劉偉, 寧蓬勃, 張彥明, 王晶鈺, 郭抗抗 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)