豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒、由其制得的豬瘟病毒活疫苗及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒、由其制得的豬瘟病毒活疫苗及制備方法。該方法用豬瘟病毒適應(yīng)毒作為制苗毒種，經(jīng)傳代細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)制備豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒原始毒種、基礎(chǔ)毒種及生產(chǎn)毒種，再通過豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種在傳代細(xì)胞系增殖后連續(xù)收獲合格病毒液作為豬瘟弱毒疫苗用抗原，經(jīng)配苗、分裝、凍干制得豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒活疫苗，該方法在豬瘟毒種制備時(shí)不需要使用兔子傳代來制備毒種，解決了為預(yù)防豬瘟而屠殺兔子等動(dòng)物福利問題，并減少脾毒制備中可能攜帶外源因子和潛在的散毒風(fēng)險(xiǎn)。該方法制備豬瘟病毒活疫苗，病毒繁殖時(shí)間短、收獲次數(shù)多，單位細(xì)胞收獲的病毒液量大，病毒含量高，生產(chǎn)成本低。所制得的豬瘟病毒活疫苗安全性好、免疫效力高。
【專利說明】豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒、由其制得的豬瘟病毒活疫苗及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于畜類生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒、由其制得的豬瘟病毒活疫苗及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬痕是由豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，不同年齡、性別和品種的豬均能感染，死亡率高達(dá)80 %~90 %。豬瘟被國際動(dòng)物衛(wèi)生組織劃分為A類疾病之一，我國將其劃分為一類疾病。中國學(xué)者培育成功的豬瘟兔化弱毒苗是目前世界上公認(rèn)的安全和有效的疫苗，借助于C株疫苗密集接種和綜合防制措施，有關(guān)國家已經(jīng)有效地控制了豬瘟，甚至消滅了豬瘟。在我國，豬瘟流行出現(xiàn)典型豬瘟與非典型豬瘟共存、持續(xù)感染與隱性感染共存、免疫耐受和帶毒綜合征共存等，因此，豬瘟新的流行形式給我國養(yǎng)豬業(yè)防治本病提出了新的挑戰(zhàn)。
[0003]疫苗接種仍是我國目前防制豬瘟的主要措施，2007年農(nóng)業(yè)部出臺(tái)了對豬瘟實(shí)行強(qiáng)制免疫的政策。我國目前生產(chǎn)豬痕兔化弱毒細(xì)胞苗用的細(xì)胞有牛睪丸細(xì)胞原代細(xì)胞和豬睪丸細(xì)胞系(ST細(xì)胞)。但這些疫苗在生產(chǎn)實(shí)踐中仍需使用大量兔子來繁殖豬瘟脾毒作為毒種，在制備豬瘟脾毒時(shí)由于接毒家兔個(gè)體差異容易造成豬瘟種毒制備工藝不穩(wěn)定，同時(shí)脾毒制備工藝復(fù)雜，無菌難以控制，還具有潛在散毒的危險(xiǎn)和動(dòng)物福利問題。
[0004]中國專利CN 101181637A公開了一種用細(xì)胞系生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，該方法選擇傳代細(xì)胞系作為制苗用細(xì)胞，并對制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)，然后進(jìn)行細(xì)胞毒種的繁殖及制苗毒液的繁殖，最后進(jìn)行配苗、分裝及凍干來生產(chǎn)豬瘟活疫苗。該方法在繁殖豬瘟病毒“C株”生產(chǎn)毒種時(shí)是采用ST細(xì)胞系，但在繁殖基礎(chǔ)毒種時(shí)仍需使用大量的兔子，而且，該方法在豬瘟制苗毒液的繁殖時(shí)收毒時(shí)間較長、收獲次數(shù)較少，單位細(xì)胞收獲的病毒液少。此外，該方法病毒含量低，疫苗成本高。
[0005]因此，目前存在的問題是需要研究開發(fā)一種病毒含量高，成本低的豬瘟病毒活疫苗，以及一種在豬瘟毒種制備時(shí)不再使用兔子來繁殖豬瘟病毒，且病毒繁殖時(shí)間短、收獲次數(shù)多，單位細(xì)胞收獲的病毒液量大的豬瘟病毒活疫苗制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒、由其制得的豬瘟病毒活疫苗及制備方法，該方法使用豬瘟病毒適應(yīng)毒作為制備豬瘟弱毒疫苗用毒種，經(jīng)傳代細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)制備豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒原始毒種、豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒基礎(chǔ)毒種、豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種，再通過豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種在傳代細(xì)胞系增殖后連續(xù)收獲的合格病毒液作為豬瘟弱毒疫苗用抗原，再經(jīng)配苗、分裝、凍干制得豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒活疫苗。該方法在豬瘟毒種制備時(shí)不再使用兔子來繁殖豬瘟病毒，且病毒繁殖時(shí)間短、收獲次數(shù)多，單位細(xì)胞收獲的病毒液量大，病毒含量聞，成本低廉。
[0007]為此，本發(fā)明提供了一種豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒，是由豬瘟兔化弱毒株經(jīng)過傳代細(xì)胞系連續(xù)培養(yǎng)后獲得，并且，將其耳源靜脈接種健康家兔Iml后，其體溫?zé)o反應(yīng)或僅出現(xiàn)輕熱反應(yīng)。
[0008]根據(jù)本發(fā)明，所述適應(yīng)毒為豬瘟兔化弱毒株的豬瘟病毒細(xì)胞適應(yīng)CC株(Classical Swine Fever Cell Adapted Virus strain CC),其保藏編號為:CCTCC NO:V201224，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學(xué))。保藏日期:2012年06月08日。
[0009]本發(fā)明中所述豬瘟病毒細(xì)胞適應(yīng)CC株有以下特性:
[0010]i)在傳代細(xì)胞系中的穩(wěn)定性:所述細(xì)胞適應(yīng)毒在傳代細(xì)胞系20~40代范圍增值病毒含量不小于107_°TCID5(l/ml ；
[0011]ii)兔子體溫反應(yīng)性:所述細(xì)胞適應(yīng)毒以107_°TCID5(l/ml耳源靜脈接種健康家兔Iml后，其體溫?zé)o反應(yīng)或僅出現(xiàn)輕熱反應(yīng)；
[0012]iii)免疫原性:所述細(xì)胞適應(yīng)毒對豬的最小免疫原性≤10_7_°/ml，以I個(gè)TCID5tl免疫劑量肌肉接種豬瘟抗體陰性健康豬，免疫兩周后攻Iml豬瘟石門系血毒(IO5MLD/ml) 100%保護(hù)；
[0013]iv)安全性:將所述細(xì)胞適應(yīng)毒以107_°TCID5Q/ml肌肉注射仔豬或妊娠母豬IOml注射不引起發(fā)病或死亡，母豬不引起流產(chǎn)或死胎。
[0014]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種根據(jù)本發(fā)明所述豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒的制備方法，其將豬瘟兔化弱毒株接入傳代細(xì)胞系連續(xù)培養(yǎng)至少20代，所述培養(yǎng)時(shí)間為24h~72h/代。
[0015]本發(fā)明還提供了一種根據(jù)本發(fā)明所述豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒制得的豬瘟病毒活疫苗。
[0016]本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種根據(jù)本發(fā)明所述豬瘟病毒活疫苗的制備方法，包括:
[0017]步驟A，制備弱毒疫苗用抗原；
[0018]步驟B，將制備豬瘟弱毒疫苗用抗原加入適當(dāng)凍干保護(hù)劑，充分混勻后定量分裝，凍干，制得豬瘟病毒活疫苗；
[0019]其中，在步驟A中，將豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種接入傳代細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)收獲細(xì)胞上清液檢驗(yàn)合格后作為制備豬瘟弱毒疫苗用抗原。
[0020]根據(jù)本發(fā)明方法，在步驟A中，豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種在傳代細(xì)胞系培養(yǎng)適應(yīng)不超過I代。所述連續(xù)收獲包括將豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種接入傳代細(xì)胞，培養(yǎng)2~5日后收獲細(xì)胞上清液，并補(bǔ)加維持液繼續(xù)培養(yǎng)的循環(huán)操作，所述循環(huán)的次數(shù)為8~10次。
[0021]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，還包括在步驟A之前的以下步驟:
[0022]步驟1，制備原始毒種:將豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒接入傳代細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，收獲細(xì)胞上清液檢驗(yàn)合格后作為豬痕細(xì)胞適應(yīng)毒原始毒種；
[0023]步驟2，制備基礎(chǔ)毒種:將豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒原始毒種接入傳代細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，收獲細(xì)胞上清液檢驗(yàn)合格后作為豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒基礎(chǔ)毒種；
[0024]步驟3，制備生產(chǎn)毒種:將豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒基礎(chǔ)毒種接入傳代細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，收獲細(xì)胞上清液檢驗(yàn)合格后作為豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種。
[0025]并且，在步驟I中，豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒在傳代細(xì)胞系中的培養(yǎng)不超過3代。在步驟2中，豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒原始毒種在傳代細(xì)胞系中的培養(yǎng)不超過3代。在步驟3中，豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒基礎(chǔ)毒種在傳代細(xì)胞系中的培養(yǎng)不超過3代。所述培養(yǎng)時(shí)間為24h~72h/代。
[0026]本發(fā)明中，所述傳代細(xì)胞系為ST細(xì)胞系、PK15細(xì)胞系、STK細(xì)胞系或BT細(xì)胞系。優(yōu)選所述傳代細(xì)胞系為BT細(xì)胞系。具體說來，本發(fā)明在培養(yǎng)豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒以及制備豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒原始毒種、豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒基礎(chǔ)毒種和豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種過程中，采用細(xì)胞系進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代細(xì)胞系為ST細(xì)胞系、PK15細(xì)胞系、STK細(xì)胞系或BT細(xì)胞系。優(yōu)選所述傳代細(xì)胞系為BT細(xì)胞系。
[0027]本發(fā)明同時(shí)還提供了一種培養(yǎng)豬瘟病毒的方法，其采用傳代細(xì)胞系進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其中，所述傳代細(xì)胞系為BT細(xì)胞系。
[0028]本發(fā)明中用家兔對疫苗效力進(jìn)行效檢。按所規(guī)定的頭份用無菌生理鹽水將每頭份疫苗稀釋7500倍，耳靜脈注射體重為1.5~3kg家兔2只，每只1ml。家兔接種后，上下午各測體溫I次，48小時(shí)后，每隔6小時(shí)測體溫I次，其體溫反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)如下:
[0029]定型熱反應(yīng):潛伏期48~96小時(shí)，體溫上升呈明顯曲線，至少有3個(gè)溫次超過常溫1°C以上，并稽留18~36小時(shí)。如稽留42小時(shí)以上，必須攻毒，攻毒后無反應(yīng)可判為定型熱反應(yīng)。
[0030]輕熱反應(yīng):潛伏期48~96小時(shí)，體溫上升呈明顯曲線，至少有2個(gè)溫次超過常溫
0.50C以上，并稽留12~36小時(shí)。
[0031]無反應(yīng):體溫正常。
[0032]此外，體溫反應(yīng)呈二次高峰，有一次高峰符合定型熱反應(yīng)(++)或輕熱反應(yīng)(+)標(biāo)準(zhǔn)者，均須攻毒。攻毒后無反應(yīng)時(shí)，該兔體溫反應(yīng)可判為定型熱反應(yīng)或輕熱反應(yīng)。
[0033]本發(fā)明使用豬瘟病毒適應(yīng)毒作為制備豬瘟弱毒疫苗用毒種，經(jīng)傳代細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)制備豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒原始毒種、豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒基礎(chǔ)毒種、豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種，再通過豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種在傳代細(xì)胞系增殖后連續(xù)收獲的合格病毒液作為豬瘟弱毒疫苗用抗原，再經(jīng)配苗、分裝、凍干制得豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒活疫苗，該方法在豬瘟毒種制備時(shí)不再需要使用兔子傳代來制備毒種，解決了為預(yù)防豬瘟而屠殺兔子等動(dòng)物福利問題并減少脾毒制備中可能攜帶外源因子和潛在散毒`的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明方法制備豬瘟病毒活疫苗，病毒繁殖時(shí)間短、收獲次數(shù)多，單位細(xì)胞收獲的病毒液量大，病毒含量高，并能降低疫苗生產(chǎn)成本。所制得的豬瘟病毒活疫苗安全性好、免疫效力高。
[0034]mmm
[0035]豬痕病毒細(xì)胞適應(yīng)CC 株(Classical Swine Fever Cell Adapted Virus straincc)，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2012年06 月 08 日，保藏編號:CCTCC NO:V 201224。
[0036]為獲得免疫性強(qiáng)的菌種，各菌種經(jīng)敏感豬體復(fù)壯鑒定合格后凍干保存并保藏?！揪唧w實(shí)施方式】
[0037]下面將結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0038]實(shí)施例
[0039]實(shí)施例1:豬瘟兔化弱毒適應(yīng)細(xì)胞的篩選
[0040]1.病毒與細(xì)胞株
[0041]豬瘟兔化弱毒為P480代脾毒(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，BT細(xì)胞(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)作為適應(yīng)病毒用細(xì)胞系。ST細(xì)胞(ATCC, American type culture collection,美國模式培養(yǎng)物集存庫)，PK15細(xì)胞(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，IBRS-2細(xì)胞(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，牛睪丸原代細(xì)胞(自制)，SK6細(xì)胞(ATCC)。
[0042]2.實(shí)驗(yàn)方法
[0043](I)豬瘟兔化弱毒在細(xì)胞中增殖試驗(yàn)
[0044]①牛睪丸細(xì)胞的制備方法
[0045]無菌取新生犢牛的睪丸I對，浸泡于含有1000U/ml青霉素的Hank’s液中，在無菌條件下去除包囊和睪丸囊膜，然后加入0.25wt%胰酶消化液進(jìn)行消化，消化后加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，然后用吸管將細(xì)胞吹散。最后細(xì)胞懸液用無菌紗布過濾，取過濾后的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后調(diào)整細(xì)胞密度為50萬細(xì)胞/ml鋪于培養(yǎng)瓶中，置于37°C含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)成單層后即為原代細(xì)胞，可用于接毒或傳代。
[0046]②制備6種細(xì)胞單層細(xì)胞
[0047]細(xì)胞用含0.25Wt%或0.5Wt%EDTA(乙二胺四乙酸)的胰酶消化后，以l: 2~I: 4的比例分到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入細(xì)胞生長液(含5wt%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基)，在37°C含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3日，細(xì)胞形成單層。
[0048]③取豬瘟兔化弱毒脾毒，按0.3%~0.5% (v/v)接入已長滿單層的6種細(xì)胞，在37°C含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48~72日直接凍存，凍融2次后分別進(jìn)行第二次繼代，連續(xù)繼代20次。病毒每繼代5代用相同的ST細(xì)胞進(jìn)行病毒含量的測定，比較豬瘟病毒在不同細(xì)胞連續(xù)繼代后的使用能力,確定繁殖豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒適宜細(xì)胞系。
[0049](2)間接免疫法測定病毒含量
[0050]取待測病毒液做十倍系列稀釋，接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，然后用吸管滴入消化后的ST細(xì)胞，每孔2.0萬細(xì)胞，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C培養(yǎng)3日，進(jìn)行熒光染色判定。出現(xiàn)熒光的即判定該孔細(xì)胞感染，按R-M法計(jì)算TCID5tlt5
[0051]3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0052]豬瘟兔化弱毒在6種細(xì)胞中的增值能力測定結(jié)果見表1。
[0053]表1豬瘟兔化弱毒在不同細(xì)胞增值病毒含量的差異
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒，是由豬瘟兔化弱毒株經(jīng)過傳代細(xì)胞系連續(xù)培養(yǎng)后獲得，并且，將其耳源靜脈接種健康家兔Irnl后，其體溫?zé)o反應(yīng)或僅出現(xiàn)輕熱反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適應(yīng)毒，其特征在于:所述適應(yīng)毒為豬瘟兔化弱毒株的豬瘟病毒細(xì)胞適應(yīng)CC株(Classical Swine Fever Cell Adapted Virus strain CC)，其保藏編號為:CCTCC NO:V201224，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒的制備方法，其特征在于:將豬瘟兔化弱毒株接入傳代細(xì)胞系連續(xù)培養(yǎng)至少20代，所述培養(yǎng)時(shí)間為24h~72h/代。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒制得的豬瘟病毒活疫苗。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述豬瘟病毒活疫苗的制備方法，包括: 步驟A，制備弱毒疫苗用抗原； 步驟B，將制備豬瘟弱毒疫苗用抗原加入適當(dāng)凍干保護(hù)劑，充分混勻后定量分裝，凍干，制得豬瘟病毒活疫苗； 其特征在于:在步驟A中，將豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種接入傳代細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)收獲細(xì)胞上清液檢驗(yàn)合格后作為制備豬瘟弱毒疫苗用抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于: 在步驟A中，豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種在傳代細(xì)胞系培養(yǎng)適應(yīng)不超過I代； 所述連續(xù)收獲包括將豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種接入傳代細(xì)胞，培養(yǎng)2~5日后收獲細(xì)胞上清液，并補(bǔ)加維持液繼續(xù)培養(yǎng)的循環(huán)操作，所述循環(huán)的次數(shù)為8~10次。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:還包括在步驟A之前的以下步驟: 步驟1，制備原始毒種:將豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒接入傳代細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，收獲細(xì)胞上清液檢驗(yàn)合格后作為豬痕細(xì)胞適應(yīng)毒原始毒種； 步驟2，制備基礎(chǔ)毒種:將豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒原始毒種接入傳代細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，收獲細(xì)胞上清液檢驗(yàn)合格后作為豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒基礎(chǔ)毒種； 步驟3，制備生產(chǎn)毒種:將豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒基礎(chǔ)毒種接入傳代細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，收獲細(xì)胞上清液檢驗(yàn)合格后作為豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒生產(chǎn)毒種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于: 在步驟I中，豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒在傳代細(xì)胞系中的培養(yǎng)不超過3代； 在步驟2中，豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒原始毒種在傳代細(xì)胞系中的培養(yǎng)不超過3代； 在步驟3中，豬瘟細(xì)胞適應(yīng)毒基礎(chǔ)毒種在傳代細(xì)胞系中的培養(yǎng)不超過3代； 所述培養(yǎng)時(shí)間為24h~72h/代。
9.根據(jù)權(quán)利要求3、5~8中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述傳代細(xì)胞系為ST細(xì)胞系、PK15細(xì)胞系、STK細(xì)胞系或BT細(xì)胞系。
10.一種培養(yǎng)豬瘟病毒的方法，其采用傳代細(xì)胞系進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其特征在于:所述傳代細(xì)胞系為BT細(xì)胞系。
【文檔編號】A61K39/187GK103571797SQ201210278688
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月7日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司