專利名稱：一種用于脫色糖蜜酒精廢水的微生物及脫色方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于廢水生物處理領(lǐng)域，具體地涉及一種用于脫色糖蜜酒精廢水的微生物。本發(fā)明還涉及篩選分離上述微生物的方法。本發(fā)明還涉及利用上述微生物進(jìn)行糖蜜酒精廢水生物脫色的方法。
背景技術(shù)：
糖蜜廢水發(fā)酵生產(chǎn)酒精，一直是制糖產(chǎn)業(yè)提高行業(yè)效益、解決糖蜜排放的重要途徑之一，也可適應(yīng)石油能源逐漸枯竭而帶來的未來能源多樣化的需求，但糖蜜酒精廢水的高色素值是此工業(yè)發(fā)展面臨的“瓶頸”問題之一，處理難度在于成分較為復(fù)雜、部分色素不 易被微生物降解及對PH敏感、長時間放置色值不減等特點。糖蜜酒精廢水中的色素主要有類黑精色素、焦糖色素和酚類色素三大類，酚類色素是甘蔗自身產(chǎn)生的一類植物色素，焦糖色素是由糖熱解產(chǎn)生，類黑精色素是糖和氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)形成的一類褐色聚合物，其中類黑精色素最難以降解，焦糖色素和酚類色素都具有可再生和利用價值。傳統(tǒng)的物化法試劑成本高，并有二次污染，而以微生物代謝為手段、污染物消減為目的的環(huán)境生物技術(shù)具有條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點，是一種經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益俱佳的方法。脫色菌種選育是生物脫色技術(shù)的關(guān)鍵之一，目前對于糖蜜酒精廢水的生物脫色研究國內(nèi)外都有一些報道。如細(xì)菌方面，報道的有熒光假單胞菌、植物乳桿菌、希式乳桿菌等，其中希式乳桿菌對模擬糖蜜酒精廢水的脫色率最高達(dá)到40% ;真菌方面，報道的有云芝菌、黃孢原毛平革菌、黑曲霉、煙曲霉、黃曲霉、鏈霉菌等。Pant等使用一株黃曲霉對厭氧處理后的糖蜜酒精廢水進(jìn)行脫色，28天的脫色率達(dá)到74. 67%，從此菌體中提取的降解酶液對未稀釋的厭氧處理的糖蜜酒精廢水的脫色率可達(dá)29. 44%。Murata等報道了一株鏈霉菌TT14最佳培養(yǎng)條件下對類黑精脫色率為64%。國內(nèi)在糖蜜酒精廢水生物脫色方面的研究剛剛起步，目前研究菌種僅限于云芝菌，如冉艷紅等報道了一株云芝菌，搖瓶培養(yǎng)條件下對20%的糖蜜酒精廢液的脫色率為50%。另一方面，不同廢水種類和來源、不同生產(chǎn)季節(jié)、不同的廢水預(yù)處理方式都可能影響脫色降解效率和色值測定。這也是對目前糖蜜酒精廢水脫色率的文獻(xiàn)報道值很難進(jìn)行比較的原因之一。如Kumar等研究發(fā)現(xiàn)云芝和黃孢原毛平革菌在最佳條件下對濃度為6. 25%的經(jīng)厭氧反應(yīng)器處理過的糖蜜酒精廢水的10天脫色率分別為71. 5%和53. 5%，對濃度為25. 0%的糖蜜酒精廢水的脫色率分別為19. 5%和16. 5% ；Ohmomo等報道的嗜熱菌煙曲霉G-2-6在對糖蜜廢水進(jìn)行連續(xù)脫色過程中發(fā)現(xiàn)對經(jīng)透析處理的糖蜜酒精廢水的脫色率達(dá)到70%,但對未透析處理的廢水脫色率只有40% ;Sirianuntapiboon等報道的產(chǎn)乙酸菌No. BP103對未處理糖蜜酒精廢水原液和厭氧處理過的糖蜜酒精廢水的脫色率差別很大，分別為32. 3±3. 2%和73. 5±3. 5%;同樣?xùn)|方伊薩酵母對經(jīng)厭氧處理后的糖蜜廢水7天脫色率達(dá)到90%，但對未處理的糖蜜廢水脫色率則只有50-60%。在這些報道中，起始的廢水色值也不盡相同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可用于脫色糖蜜酒精廢水的微生物。本發(fā)明的又一目的在于提供一種篩選和分離上述微生物的方法。本發(fā)明的再一目的在于提供一種利用上述微生物進(jìn)行糖蜜酒精廢水脫色的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的可用于脫色糖蜜酒精廢水的微生物為黃曲霉(Aspergillus flavus)，該菌已于2010年11月I日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC No. 4292。本發(fā)明提供的篩選和分離上述微生物的方法，以模擬糖蜜酒精廢水色素類黑精為 底物，采用稀釋涂布平板法從自然環(huán)境中篩選獲得能夠脫色類黑精的微生物，將有明顯脫色圈的菌株轉(zhuǎn)接入未處理的實際糖蜜酒精廢水培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，將獲得的具有脫色能力的菌株轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基培養(yǎng)，洗脫孢子制備孢子懸液。所述篩選和分離的方法，其中，糖蜜酒精廢水培養(yǎng)基是在糖蜜酒精廢水中加入葡萄糖 5 25g/L，蛋白胨或 NaNO3 I. O 5. Og/L, KH2PO4O. 5 I. 5g/L, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 5g/L，瓊脂 15 20g/L ;培養(yǎng)溫度為 25 50°C，pH 5 0，轉(zhuǎn)速 100 400rpm。所述篩選和分離的方法，其中，糖蜜酒精廢水稀釋至A475 ^ 3. 5。所述篩選和分離的方法，其中，培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25-28°C。所述的篩選和分離的方法，其中，洗脫孢子是以O(shè). 5%的Tween80溶液。本發(fā)明提供的利用上述微生物進(jìn)行糖蜜酒精廢水生物脫色的方法，主要步驟為糖蜜酒精廢水稀釋至A475 3. 5左右，外加營養(yǎng)源，將孢子懸液接入糖蜜酒精廢水液體培養(yǎng)基中進(jìn)行脫色反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，抽濾分離菌體，通過測試475nm處吸光度的變化計算脫色率。所述的脫色方法，其中，營養(yǎng)源為葡萄糖、果糖、蔗糖或淀粉5 25g/L，蛋白胨或NaNO3 I. O 5. Og/L, KH2PO4 O. 5 I. 5g/L, MgSO4 · 7Η200· 05 O. 5g/L。所述的脫色方法，其中，糖蜜酒精廢水培養(yǎng)基中孢子懸液接種量為IO2 IO7個/
mLo所述的脫色方法，其中，脫色條件為2 7天，20 60°C，pH = 3. O 9.0，轉(zhuǎn)速50 350rpm。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有節(jié)約成本，減少二次污染等優(yōu)點。與現(xiàn)有的生物脫色方法相比，提供了一種可高效脫色未處理糖蜜酒精廢水的菌種。該菌種4天培養(yǎng)對未處理的實際糖蜜酒精廢水的最聞脫色率可達(dá)65%左右，聞于目如報道的大多數(shù)細(xì)菌。與文獻(xiàn)報道的真菌菌株相比，所篩選到的黃曲霉培養(yǎng)時間較短，真菌達(dá)到較高脫色率都需要較長的培養(yǎng)時間，在實際應(yīng)用中會受到限制，而且真菌用于經(jīng)厭氧或好氧處理后的糖蜜酒精廢水的脫色效率較高，對實際糖蜜酒精廢水原液的脫色率不高。因此本專利提供的菌種和脫色工藝具有良好的生物脫色效率，可為實際工業(yè)廢水處理提供一種優(yōu)良的菌種和脫色方法。
具體實施方式
I、本發(fā)明以模擬糖蜜酒精廢水色素類黑精為底物，采用稀釋涂布平板法從自然環(huán)境中篩選獲得能夠脫色類黑精的微生物，將有明顯脫色圈的菌株轉(zhuǎn)接入未處理的實際糖蜜酒精廢水培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，將具有較好脫色能力的菌株進(jìn)行保藏和鑒定。2、接種物制備取出保藏菌種轉(zhuǎn)接試管斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 5天后，以O(shè). 5%的TweenSO溶液洗脫孢子制備孢子懸液，血球計數(shù)板計數(shù)后備用。3、菌株對糖蜜酒精廢水脫色糖蜜酒精廢水稀釋至A475 ^ 3. 5左右，外加適量營養(yǎng)源，按IO2 IO7個/mL的接種量將孢子懸液接入糖蜜酒精廢水液體培養(yǎng)基中進(jìn)行脫色反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20 60°C，pH為3. O 9. 0，搖床轉(zhuǎn)速為50 350rpm，振蕩培養(yǎng)2 7天，反應(yīng)結(jié)束后，抽濾分離菌體，通過可見分光光度計測試475nm處吸光度的變化來計算脫色率。4、在本發(fā)明的方法中，所用的糖蜜酒精廢水為未經(jīng)任何處理的粗餾塔底排出的實 際糖蜜酒精廢水，所用的菌種為黃曲霉，該菌已于2010年11月I日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC No. 4292。本發(fā)明所用菌種為黃曲霉，所用糖蜜酒精廢水為未經(jīng)任何凈化處理的糖蜜酒精廢水原液，未優(yōu)化條件下39°C培養(yǎng)4天對未處理的實際糖蜜酒精廢水脫色率可達(dá)50%以上，經(jīng)優(yōu)化后對未處理實際糖蜜酒精廢水的最高脫色率可達(dá)到65%左右，高于目前的文獻(xiàn)報道值。以下舉若干實施例作詳細(xì)說明。實施例I(I)挑取少許保藏的黃曲霉(Aspergillus flavus)菌株接種到PDA試管斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為葡萄糖 15g/L, NaNO3 3. Og/L, KH2PO4 I. Og/L, MgSO4 ·7Η20 O. lg/L，瓊脂 15g/L, pH 4. 5 9. 0，轉(zhuǎn)速100 400rpm，生化培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)5天。用O. 5% Tween80溶液沖洗孢子，倒入裝有玻璃珠的搖瓶，振蕩分散孢子，過濾得孢子懸液，血球計數(shù)板測定孢子懸液濃度。培養(yǎng)基是在糖蜜酒精廢水中加入(2) 250mL錐形瓶中裝液60mL糖蜜酒精廢水液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為將糖蜜酒精廢水稀釋至 A475 ^ 3. 5，外加葡萄糖 25g/L，NaNO3 2. Og/L, KH2PO4 I. Og/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，pH調(diào)至5.0，孢子接種量為IO4個/mL，39°C，150rpm振蕩培養(yǎng)4天，取出搖瓶，抽濾分離菌體，取ImL濾液用乙酸-乙酸鈉緩沖液(O. 1M，pH5. O) 10倍稀釋，可見分光光度計測脫色前后475nm處吸光度的變化。菌體放入烘箱105°C烘干過夜，電子分析天平稱重。脫色率為50. 91%,細(xì)胞干重為 10. 7900g/L。實施例2(I)菌種種子液培養(yǎng)及接種物制備同實施例I步驟(I)。(2) 250mL錐形瓶中裝液60mL糖蜜酒精廢水液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為將糖蜜酒精廢水稀釋至 A475 ^ 3. 5，外加淀粉 25g/L，NaNO3 2. Og/L, KH2PO4L 0g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，pH調(diào)至5. 0，孢子接種量為IO5個/mL，39°C，150rpm振蕩培養(yǎng)4天，取出搖瓶，抽濾分離菌體，取ImL濾液用乙酸-乙酸鈉緩沖液(0. 1M，pH5. 0) 10倍稀釋，可見分光光度計測脫色前后475nm處吸光度的變化。菌體放入烘箱105°C烘干過夜，電子分析天平稱重。脫色率為58. 09%，細(xì)胞干重為 12. 8067g/L。
實施例3(I)菌種種子液培養(yǎng)及接種物制備同實施例I步驟(I)。(2) 250mL錐形瓶中裝液60mL糖蜜酒精廢水液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為將糖蜜酒精廢水稀釋至 A475 ^ 3. 5，外加淀粉 30g/L，蛋白胨 3. Og/L, KH2PO4L Og/L, MgSO4 · 7H20 O. 5g/L，pH調(diào)至5. 0，孢子接種量為IO5個/mL，39°C，150rpm振蕩培養(yǎng)4天，取出搖瓶，抽濾分離菌體，取ImL濾液用乙酸-乙酸鈉緩沖液(O. 1M，pH5. O) 10倍稀釋，可見分光光度計測脫色前后475nm處吸光度的變化。菌體放入烘箱105°C烘干過夜，電子分析天平稱重。脫色率為62. 67%，細(xì)胞干重為 13. 4083g/L。實施例4(I)菌種種子液培養(yǎng)及接種物制備同實施例I步驟(I)。
(2) 250mL錐形瓶中裝液60mL糖蜜酒精廢水液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為將糖蜜酒精廢水稀釋至 A475 ^ 3. 5，外加淀粉 25g/L，(NH4)2SO4 2. Og/L, KH2PO4 I. Og/L, MgSO4 ·7Η20 O. 5g/L，pH調(diào)至5.0，孢子接種量為IO3個/mL，30°C，150rpm振蕩培養(yǎng)4天，取出搖瓶，抽濾分離菌體，取ImL濾液用乙酸-乙酸鈉緩沖液(O. 1M，pH5. O) 10倍稀釋，可見分光光度計測脫色前后475nm處吸光度的變化。菌體放入烘箱105°C烘干過夜，電子分析天平稱重。脫色率為48. 95%，細(xì)胞干重為 10. 1167g/L。實施例5(I)菌種種子液培養(yǎng)及接種物制備同實施例I步驟(I)。(2) 250mL錐形瓶中裝液60mL糖蜜酒精廢水液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為將糖蜜酒精廢水稀釋至 A475 ^ 3. 5，外加淀粉 30g/L, NH4NO3 2. Og/L, KH2PO4 I. 0g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，pH調(diào)至6. 0，孢子接種量為IO4個/mL，39°C，120rpm振蕩培養(yǎng)5天，取出搖瓶，抽濾分離菌體，取ImL濾液用乙酸-乙酸鈉緩沖液(0. 1M，pH5. 0) 10倍稀釋，可見分光光度計測脫色前后475nm處吸光度的變化。菌體放入烘箱105°C烘干過夜，電子分析天平稱重。脫色率為60. 36%，細(xì)胞干重為 11. 7617g/L。實施例6(I)菌種種子液培養(yǎng)及接種物制備同實施例I步驟(I)。(2) 250mL錐形瓶中裝液60mL糖蜜酒精廢水液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為將糖蜜酒精廢水稀釋至 A475 ^ 3. 5，外加蔗糖 30g/L，蛋白胨 2. 0g/L，KH2P04 I. 0g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L,pH調(diào)至5. 0，孢子接種量為IO4個/mL，39°C，150rpm振蕩培養(yǎng)4天，取出搖瓶，抽濾分離菌體，取ImL濾液用乙酸-乙酸鈉緩沖液(0. 1M，pH5. 0) 10倍稀釋，可見分光光度計測脫色前后475nm處吸光度的變化。菌體放入烘箱105°C烘干過夜，電子分析天平稱重。脫色率為65. 35%，細(xì)胞干重為 14. 2100g/L。
權(quán)利要求
1.一種用于脫色糖蜜酒精廢水的微生物為黃曲霉(Aspergillus flavus)，于2010年11月I日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC No. 4292。
2.一種篩選和分離權(quán)利要求I所述微生物的方法，以模擬糖蜜酒精廢水色素類黑精為底物，采用稀釋涂布平板法從自然環(huán)境中篩選獲得能夠脫色類黑精的微生物，將有明顯脫色圈的菌株轉(zhuǎn)接入未處理的實際糖蜜酒精廢水培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，將獲得的具有脫色能力的菌株轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基培養(yǎng)，洗脫孢子制備孢子懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述篩選和分離的方法，其中，復(fù)篩用的糖蜜酒精廢水培養(yǎng)基是在糖蜜酒精廢水中加入葡萄糖 5 25g/L, NaNO3 I. O 5. Og/L, KH2PO4 O. 5 I. 5g/L, MgSO4 · 7Η200· 05 O.5g/L，瓊脂 15 20g/L ;培養(yǎng)溫度為 25 50°C，pH 5 0，轉(zhuǎn)速 100 400rpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述篩選和分離的方法，其中，糖蜜酒精廢水稀釋至A475 3.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述篩選和分離的方法，其中，培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25-28°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選和分離的方法，其中，洗脫孢子是以O(shè).5%的TweenSO溶液。
7.一種利用權(quán)利要求I的微生物進(jìn)行糖蜜酒精廢水生物脫色的方法 糖蜜酒精廢水稀釋至A475 ^ 3. 5左右，外加營養(yǎng)源，將孢子懸液接入糖蜜酒精廢水液體培養(yǎng)基中進(jìn)行脫色反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，抽濾分離菌體，通過測試475nm處吸光度的變化計算脫色率。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的脫色方法，其中，營養(yǎng)源為葡萄糖、果糖、蔗糖或淀粉5 25g/L，蛋白胨或 NaNO3 I. O 5. Og/L, KH2PO4 O. 5 I. 5g/L, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 5g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的脫色方法，其中，糖蜜酒精廢水培養(yǎng)基中孢子懸液接種量為IO2 IO7 個 /mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的脫色方法，其中，脫色條件為2 7天，20 60°C，pH=3· O 9· O,轉(zhuǎn)速 50 350rpm。
全文摘要
一種用于脫色糖蜜酒精廢水的微生物為黃曲霉(Aspergillus flavus)，該菌已于2010年11月1日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。其篩選和分離是以模擬糖蜜酒精廢水色素類黑精為底物，采用稀釋涂布平板法從自然環(huán)境中篩選獲得能夠脫色類黑精的微生物，將有明顯脫色圈的菌株轉(zhuǎn)接入未處理的實際糖蜜酒精廢水培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，將獲得的具有脫色能力的菌株轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基培養(yǎng)，洗脫孢子制備孢子懸液。糖蜜酒精廢水稀釋至A475≈3.5左右，外加營養(yǎng)源，將孢子懸液接入糖蜜酒精廢水液體培養(yǎng)基中進(jìn)行脫色反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，抽濾分離菌體，通過測試475nm處吸光度的變化計算脫色率。
文檔編號C12R1/67GK102839128SQ20111017677
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者劉幽燕, 李必金, 賀鍇, 何熙璞, 李青云 申請人:廣西大學(xué)