專利名稱：檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)snp位點(diǎn)的試劑盒及其多重pcr擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)SNP位點(diǎn)的試劑盒及其PCR擴(kuò)增方法，尤其是利用多重PCR 結(jié)合分子開關(guān)技術(shù)檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒及其多重PCR擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
華法林是一種雙香豆素類口服抗凝藥，通過抑制維生素K在肝臟細(xì)胞內(nèi)合成凝血因子II、VII、IX、X，從而發(fā)揮抗凝作用。在臨床上主要用于防治血栓栓塞性疾病，如治療血栓栓塞性靜脈炎，降低肺栓塞的發(fā)病率和死亡率，減少外科大手術(shù)，如髖關(guān)節(jié)固定術(shù)、人工置換心臟瓣膜手術(shù)等的靜脈血栓發(fā)生率，以及作為心肌梗塞的輔助用藥。但華法林的有效治療范圍較窄且不同個(gè)體之間給藥劑量存在較大的差異，除了受患者年齡、種族、體重、 飲食等臨床因素影響外，華法林的靶酶VKORCl和代謝酶CYP2C9的基因遺傳多態(tài)性是影響華法林用藥劑量差異性的主要因素，而當(dāng)前確定華法林需求劑量是無法考慮遺傳因素的影響，常常造成患者嚴(yán)重的出血并發(fā)癥。含有Y-谷氨酸殘基的維生素K依賴性凝血因子II、VII、IX、X，以及蛋白C和S， 必須經(jīng)過維生素K依賴性羧化酶(Y-谷氨酸基羧化酶)的羧化作用才能成為有活性的凝血因子。在羧化成過程中，耦聯(lián)氫醌型維生素K被氧化成環(huán)氧型維生素K。香豆素類抗凝藥 (華法林)作為維生素K拮抗劑通過阻斷維生素K還原，使得含有谷氨酸殘基的凝血因子 II、VII、IX、X，以及蛋白C和蛋白S停留在沒有抗凝血生物活性的前體階段。這類蛋白與氧化失活的維生素K結(jié)合，進(jìn)一步阻礙維生素K環(huán)氧化物由環(huán)氧型向氫醌型轉(zhuǎn)變。體內(nèi)環(huán)氧型維生素K被還原為氫醌型維生素K由維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體(VKORC)完成， 藥理學(xué)研究表明，VKORC是維生素K依賴性凝血因子生成的限速酶，VKORC由VKORCl激活， VKORCl不但主導(dǎo)維生素K依賴性凝血因子的生成，而且是香豆素類抗凝藥物-華法林的作用靶點(diǎn)。中國臺(tái)灣學(xué)者Yuan HY報(bào)道，華法林維持劑量與VKORCl啟動(dòng)子區(qū)域多態(tài)性有關(guān)。 VK0RC1-1639位G/A(rs9934438)變異導(dǎo)致其啟動(dòng)子活性不同。VK0RC1GG和AG基因型與 AA基因型相比，GG和AG基因型由于其啟動(dòng)子活性高，VKORClmRNA表達(dá)增加，VKORCl蛋白也相應(yīng)增加，引起VKORC活性增高，從而凝血因子生成較多，由于VKORCl蛋白是華法林作用靶點(diǎn)，所有華法林敏感者1.5mg)全是基因型為AA的純合子，而華法林抵抗的個(gè)體其基因型為AG或GG。Geiser等研究表明，VK0RC1-1639G/A基因多態(tài)性存在民族差異， VK0RC1-1639G/A基因多態(tài)性是民族之間華法林劑量差異的主要原因。華法林在體內(nèi)的代謝主要通過肝臟細(xì)胞色素氧化酶P450 (CYP)系，華法林含S型和R型2種異構(gòu)體，S型主要經(jīng)肝臟CYP2C9代謝，R型由CYP3A4代謝，其中S型華法林的抗凝活性比R型強(qiáng)3 5倍，因此CYP2C9是影響華法林用藥劑量的主要酶之一。國外文獻(xiàn)報(bào)道 86%的CYP2C9突變病例僅需要很低的維持劑量((1. 5mg. cf1)，而需要低維持劑量的普通患者為38%，以此具有CYP2C9突變等位基因的個(gè)體需要減量給藥以較少不良反應(yīng)的發(fā)生。 在我國漢族人群中，該基因的突變型以CYP2C9*3為主，但頻率較低，野生純合型為92. 7%, CYP2C9*2/CYP2C9*3型為6. 6%、CYP2C9*3純合型為0. 7%。兩種突變型都與華法林代謝酶的損傷有關(guān)，從而導(dǎo)致個(gè)體在抗凝治療中所需的華法林劑量較正常人低。CYP2C9*3純合子以及CYP2C腫2和*3的突變型雜合子(CYP2C腫2/ )者華法林需要?jiǎng)┝勘纫吧图兒献拥?60% 75% ；與野生型比較，CYP2C9*2、CYP2C9*3突變型者的需要?jiǎng)┝棵黠@降低，達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)間延長。在同等劑量時(shí)INR值偏高，發(fā)生危及生命的嚴(yán)重出血事件的風(fēng)險(xiǎn)增大。因此，用藥前進(jìn)行CYP2C9基因型檢測(cè)，有助于預(yù)測(cè)患者的最佳華法林負(fù)荷劑量，降低出血事件的發(fā)生率。CYP4F2是代謝花生四烯酸產(chǎn)生二十四烯酸最主要的代謝酶，近來發(fā)現(xiàn)CYP4F2基因的一個(gè)V433M突變使花生四烯酸代謝能力下降，二十四烯酸的產(chǎn)生減少，即此突變降低了 CYP4F2的酶活性。CYP4F2為維生素K的單氧酶，可氧化底物生成ω -羥基衍生物，而且不同基因型的人肝臟微粒顯示出不同的維生素K代謝活性，野生型CC基因肝微粒代謝活性最高，而突變純合型TT基因肝微粒體代謝活性最低，為CC基因型的75%從而減少維生素K 的代謝，使維生素K的濃度升高，進(jìn)而影響華法林的作用。為了達(dá)到相同的抗凝效果，CYP4F2 V433M(rs2108622)位點(diǎn)突變型TT患者需要提高華法林劑量。

發(fā)明內(nèi)容
華法林的靶酶VKORCl和代謝酶CYP2C9、CYP4F2的基因遺傳多態(tài)性直接或間接影響華法林在體內(nèi)的抗凝效果和代謝過程。本發(fā)明提供一種利用多重PCR結(jié)合分子開關(guān)技術(shù)檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒及其多重PCR擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案一種檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒，所述試劑盒可同時(shí)對(duì)VKORCl基因rs9934438 SNP位點(diǎn)、CYP2C9基因rsl799853 和rsl057910 SNP位點(diǎn)及CYP4F2基因rs2108622 SNP位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增分型檢測(cè)，以ALB基因?yàn)閮?nèi)參來檢測(cè)擴(kuò)增條件；野生型2 X緩沖包含上述4個(gè)SNP位點(diǎn)的野生型正向序列特異性引物、共用反向引物和內(nèi)參序列上下游引物，通過擴(kuò)增后DNA電泳條帶的有無判斷是否攜帶對(duì)應(yīng)SNP位點(diǎn)的野生型表型；突變型2 X緩沖液包含上述4個(gè)SNP位點(diǎn)的突變型正向序列特異性引物、共用反向引物和內(nèi)參序列上下游引物，通過擴(kuò)增后DNA電泳條帶的有無判斷是否攜帶對(duì)應(yīng)SNP位點(diǎn)的突變型表型；當(dāng)其中一個(gè)SNP位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的片段長度條帶僅在野生型擴(kuò)增中得出陽性結(jié)果，突變型擴(kuò)增對(duì)應(yīng)位置條帶為陰性時(shí)判讀為野生純合型，相反為突變純合型，野生型和突變型擴(kuò)增都出現(xiàn)陽性條帶其結(jié)果為雜合型，通過野生型和突變型的特異性擴(kuò)增經(jīng)過DNA凝膠電泳綜合分析確認(rèn)受試者的基因型。所屬檢測(cè)VKORCl基因rs9934438 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物以及一個(gè)反向引物的堿基序列如下所示正向野生型引物CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACT正向突變型引物CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACC反向共用引物GGAACCAGGTTAGGACTGTCAACCC所屬檢測(cè)CYP2C9基因rsl799853 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物以及一個(gè)反向引物的堿基序列如下所示
正向野生型引物GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACC正向突變型引物GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACT反向共用引物ATTTCACAGAATTATGCTACAGGATGTATT所屬檢測(cè)CYP2C9基因rsl057910 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物以及一個(gè)反向引物的堿基序列如下所示正向野生型弓丨物AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAT正向突變型弓丨物AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAG反向共用引物ACCATCCTCTCTTTAAGTTTGCATATA所屬檢測(cè)CYP4F2基因rs2108622位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物以及一個(gè)反向引物的堿基序列如下所示正向野生型引物CGGAACCCATCACAACCCAGCTA正向突變型引物CGGAACCCATCACAACCCAGCTG反向共用引物ACCAACCCAACCGTACTCTATGGACCT本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括細(xì)胞裂解液，野生型2 X擴(kuò)增緩沖混合液，突變型2 X擴(kuò)增緩沖混合液，高保真聚合酶，液體石蠟油本試劑盒共40人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果(1)本發(fā)明采用多重PCR擴(kuò)增技術(shù)，在一次PCR反應(yīng)中對(duì)4個(gè)包含SNP位點(diǎn)的DNA 片段和1個(gè)內(nèi)參片段同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，提高檢測(cè)效率降低檢測(cè)成本。(2)本發(fā)明采用SNP敏感性分子開關(guān)技術(shù)，使3’端不能與模板互補(bǔ)的引物所引發(fā)的擴(kuò)增非成熟性終止，無法形成產(chǎn)物，避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。(3)引入內(nèi)參，為陰性結(jié)果的判讀提供依據(jù)，避免假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。(4)本發(fā)明擴(kuò)增后只需通過DNA凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)即可完成檢測(cè)，不需添置貴重設(shè)備，快速，準(zhǔn)確，靈敏，特異，重復(fù)性好，大幅降低了檢測(cè)成本和操作復(fù)雜程度，適合臨床和科研使用。(5)無需DNA提取，只需裂解全血細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后的懸液加入反應(yīng)體系即可完成擴(kuò)增，免去DNA提取的步驟和成本并避免氣溶膠污染。(6)本發(fā)明的試劑盒，分別提供野生型和突變型的2X擴(kuò)增緩沖液，使用者只要全血裂解懸液和聚合酶即可進(jìn)行擴(kuò)增，減少了操作步驟，提高勞動(dòng)速率，可以實(shí)現(xiàn)高效率檢測(cè)。(7)本發(fā)明的試劑盒所提供的野生型和突變型2X擴(kuò)增緩沖液，使用了不同顏色的擴(kuò)增指示染料，方便加樣時(shí)區(qū)分，擴(kuò)增后即可直接進(jìn)行凝膠電泳，無需加入loading buffer，避免人為錯(cuò)誤。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒，所述試劑盒包括檢測(cè)基因 VKORCl rs9934438 SNP位點(diǎn)的引物、檢測(cè)基因 CYP2C9 rsl799853 和rsl057910 SNP位點(diǎn)的引物及檢測(cè)基因CYP4F2 rs2108622 SNP位點(diǎn)的引物。所述試劑盒包括檢測(cè)基因VKORCl rs9934438 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物、檢測(cè)基因CYP2C9 rsl799853 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物、檢測(cè)基因CYP2C9 rsl057910 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物和檢測(cè)基因CYP4F2 rs2108622 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物。所述檢測(cè)基因VKORCl rs9934438位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示(SEQ ID NO. 1-12)正向野生型引物CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACT
正向突變型引物CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACC反向共用引物GGAACCAGGTTAGGACTGTCAACCC所述檢測(cè)基因CYP2C9 rsl799853位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示正向野生型引物GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACC正向突變型引物GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACT反向共用引物ATTTCACAGAATTATGCTACAGGATGTATT所述檢測(cè)基因CYP2C9 rsl057910位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示正向野生型弓丨物AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAT正向突變型弓丨物AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAG反向共用引物ACCATCCTCTCTTTAAGTTTGCATATA所述檢測(cè)基因CYP4F2 rs2108622位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示正向野生型引物CGGAACCCATCACAACCCAGCTA正向突變型引物CGGAACCCATCACAACCCAGCTG反向共用引物ACCAACCCAACCGTACTCTATGGACCT。所述的檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒所采用的檢測(cè)方法對(duì)受檢樣本DNA分別用野生型和突變擴(kuò)增緩沖液進(jìn)行擴(kuò)增，在每個(gè)反擴(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)對(duì)4個(gè)目的片段和1個(gè)內(nèi)參片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段由大到小依次是內(nèi)對(duì)照1086bp，CYP2C9 rsl799853 766bp，CYP4F2 rs2108622 463bp，CYP2C9 rsl799853 290bp,VKORCl rs9934438 136bp ；擴(kuò)增后經(jīng)凝膠電泳即可在紫外光下見到根據(jù)片段大小區(qū)分開的產(chǎn)物條帶，根據(jù)條帶的有無判斷4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。所述的檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒多重PCR擴(kuò)增方法預(yù)變性由1次循環(huán)構(gòu)成，其條件為溫度為94°C，時(shí)間為1分鐘；PCR擴(kuò)增由第一階段和第二階段構(gòu)成第一階段有32次循環(huán)構(gòu)成，其條件為變性溫度為94 °C，時(shí)間為30秒；退火溫度為58°C，時(shí)間為30秒；延伸溫度為72°C，時(shí)間為90秒；第一階段有32次循環(huán)構(gòu)成，其條件為延伸溫度為72°C，時(shí)間為7分鐘；保存溫度為4°C。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例一步驟1 全血細(xì)胞裂解液的制備取受檢者外周靜脈血300 μ 1，加入700 μ 1細(xì)胞裂解液，顛倒混勻5次，12000rpm 離心1分鐘，倒去上清，并將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留2分鐘，確保沉淀在管中，加入300 μ 1雙蒸水，渦旋震蕩混勻成細(xì)胞裂解懸液。步驟2:PCR擴(kuò)增反應(yīng)1、配置野生型反應(yīng)體系PCR管內(nèi)加入細(xì)胞裂解懸液4.8μ 1、加入5μ 12Χ野生型擴(kuò)增緩沖液和0. 2μ 1聚合酶(2. 5υ/μ 1)混合構(gòu)成獨(dú)立的反應(yīng)體系，加樣后充分混勻，短暫離心，最后沿管壁輕輕加入20 μ 1液體石蠟油封閉體系，具體見下表
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測(cè)基因 VKORCl rs9934438 SNP 位點(diǎn)的引物、檢測(cè)基因 CYP2C9 rsl799853 和 rsl057910 SNP位點(diǎn)的引物及檢測(cè)基因CYP4F2 rs2108622 SNP位點(diǎn)的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于， 所述試劑盒包括檢測(cè)基因VKORCl rs9934438 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物、 檢測(cè)基因CYP2C9 rsl799853 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物、檢測(cè)基因CYP2C9 rsl057910 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物和檢測(cè)基因CYP4F2 rs2108622 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于， 所述檢測(cè)基因VKORCl rs9934438位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示正向野生型引物CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACT正向突變型引物CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACC反向共用引物GGAACCAGGTTAGGACTGTCAACCC所述檢測(cè)基因CYP2C9 rsl799853位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示正向野生型引物GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACC正向突變型引物GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACT反向共用弓丨物ATTTCACAGAATTATGCTACAGGATGTATT所述檢測(cè)基因CYP2C9 rsl057910位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示正向野生型弓丨物AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAT正向突變型弓丨物AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAG反向共用引物ACCATCCTCTCTTTAAGTTTGCATATA所述檢測(cè)基因CYP4F2 rs2108622位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示正向野生型引物CGGAACCCATCACAACCCAGCTA正向突變型引物CGGAACCCATCACAACCCAGCTG反向共用引物ACCAACCCAACCGTACTCTATGGACCT。
4.一種權(quán)利要求1所述的檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒所采用的檢測(cè)方法，其特征在于，對(duì)受檢樣本DNA分別用野生型和突變擴(kuò)增緩沖液進(jìn)行擴(kuò)增，在每個(gè)反擴(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)對(duì)4個(gè)目的片段和1個(gè)內(nèi)參片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段由大到小依次是內(nèi)對(duì)照 1086bp, CYP2C9 rsl799853 766bp, CYP4F2 rs2108622 463bp, CYP2C9 rsl799853 290bp, VKORCl rs9934438 136bp ；擴(kuò)增后經(jīng)凝膠電泳即可在紫外光下見到根據(jù)片段大小區(qū)分開的產(chǎn)物條帶，根據(jù)條帶的有無判斷4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。
5.一種采用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒多重PCR 擴(kuò)增方法，其特征在于，預(yù)變性由1次循環(huán)構(gòu)成，其條件為溫度為94°C，時(shí)間為1分鐘；PCR擴(kuò)增由第一階段和第二階段構(gòu)成第一階段有32次循環(huán)構(gòu)成，其條件為變性溫度為94°C，時(shí)間為30秒；退火溫度為58°C，時(shí)間為30秒；延伸溫度為72°C，時(shí)間為90秒；第一階段有32次循環(huán)構(gòu)成，其條件為 延伸溫度為72°C，時(shí)間為7分鐘； 保存溫度為4°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用多重PCR技術(shù)結(jié)合SNP敏感性分子開關(guān)技術(shù)檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。所述試劑盒對(duì)華法林用藥相關(guān)的四個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，包括VKORC1基因上的rs9934438 SNP位點(diǎn)、CYP2C9基因上的rs1799853和rs1057910 SNP位點(diǎn)及CYP4F2基因上的rs2108622 SNP位點(diǎn)。試劑盒包含野生型2×擴(kuò)增緩沖液、突變型2×擴(kuò)增緩沖液、聚合酶、細(xì)胞裂解液和甘油，兩種緩沖液中分別含有對(duì)應(yīng)SNP野生型和突變型表型的序列特異性引物和內(nèi)參引物，可在兩個(gè)多重PCR反應(yīng)中完成對(duì)上述四個(gè)SNP位點(diǎn)的分型，從而達(dá)到對(duì)華法林合理用藥提供分子生物學(xué)依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102251043SQ20111021112
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月27日
發(fā)明者周毓玲, 崔麗娟, 杜宏偉, 韓俊領(lǐng) 申請(qǐng)人:協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司, 天津?yàn)I海協(xié)和基因科技有限公司