專利名稱：一種廣東蟲(chóng)草胞外多糖的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蟲(chóng)草多糖的生產(chǎn)方法，具體來(lái)說(shuō)涉及一種廣東蟲(chóng)草胞外多糖的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
蟲(chóng)草屬(Cordyc印s)隸屬于子囊菌門(Ascomycota)、肉座菌目(Hypocreales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)，是最值得研究的真菌類群之一?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，蟲(chóng)草屬真菌是一類極具應(yīng)用價(jià)值的藥食同源的大型真菌，其中尤以冬蟲(chóng)夏草最為著名，其他種類如蛹蟲(chóng)草(C. militarist. :Fr.)Link.)、蟬花(C. sobolifer (Hill)Berk, et Br.)、古尼蟲(chóng)草 (C. gunnii (BerL)Berk.)等都有類似于冬蟲(chóng)夏草的作用，部分種類的活性成份甚至比冬蟲(chóng)夏草還要高。其中的蟲(chóng)草多糖具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化和提高免疫力等多種功效，是重要的活性成分。廣東蟲(chóng)草(Cordycepsguangdongensis T. H. Li, Q.Y.Lin & B. Song)是中國(guó)特有蟲(chóng)草新品種，目前已實(shí)現(xiàn)了人工培育，包括子實(shí)體和菌絲體的培育。研究證明，廣東蟲(chóng)草多糖具有明顯的抗氧化功效，是可開(kāi)發(fā)利用的理想材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開(kāi)發(fā)出廣東蟲(chóng)草胞外多糖的生產(chǎn)方法。我們通過(guò)將廣東蟲(chóng)草母種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到斜面菌種，然后將斜面菌種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)成一級(jí)菌種或進(jìn)一步將一級(jí)菌種培養(yǎng)成二級(jí)菌種，再在生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至析出胞外多糖，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的廣東蟲(chóng)草胞外多糖的生產(chǎn)方法，其特征包括以下步驟(1)將廣東蟲(chóng)草(Cordyceps guangdongensis T. H. Li, Q.Y.Lin & B. Song)母種接種在PDA培養(yǎng)基上，20 25°C下暗培養(yǎng)20 30天，菌落直徑長(zhǎng)至4 5cm時(shí)，得到斜面菌種；(2)將步驟(1)得到的斜面菌種按每250mL培養(yǎng)基接入8 12塊黃豆大小菌塊的比例接種至液體培養(yǎng)基，20 下，搖床轉(zhuǎn)速為120 180r/min，振蕩培養(yǎng)7 8天，至菌絲球充滿液體培養(yǎng)基，得到一級(jí)菌種，所述的液體培養(yǎng)基PH6. O 6. 5，每升培養(yǎng)基由葡萄糖7 10g，蛋白胨3 6g，麥芽浸出物3 6g，酵母浸膏3 5g和余量的水組成；(3)將步驟( 得到的一級(jí)菌種按培養(yǎng)基體積5% 15%的接種量接種至生產(chǎn)液體培養(yǎng)基中，20 下，搖床轉(zhuǎn)速為120 180r/min，通氣量10 25L/min，振蕩培養(yǎng) 2 4天，至菌絲球充滿全部培養(yǎng)基，分離菌絲體和培養(yǎng)殘液，所述的生產(chǎn)液體培養(yǎng)基PH4 9，每升生產(chǎn)培養(yǎng)基由碳源10 40g、氮源6 14g和余量的水組成，所述的碳源是葡萄糖和 /或麥芽浸出物，氮源是酵母浸膏和/或黃豆；(4)在將步驟C3)得到的培養(yǎng)殘液中加入3 5倍體積的酒精，使酒精的終濃度為體積分?jǐn)?shù)70%以上，4 6°C下靜置至析出胞外多糖，分離、干燥則可。
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步驟(1)所述的廣東蟲(chóng)草(Cordyc印 S guangdongensis T. H. Li, Q.Y.Lin & B. Song)艮口 El 本蟲(chóng)草廣東變型(Cordyceps japonica f. guangdongensisT. H. Li, Q.Y.Lin et B. Song)GDIM_C050423 CCTCC No.M206051。該蟲(chóng)草菌株分離自廣東蟲(chóng)草標(biāo)本(GDGM 24020)，已于2006年5月16日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，保藏號(hào)為CCTCC No. M206051。該蟲(chóng)草菌株首先公開(kāi)在中國(guó)專利ZL200610035774. 3中。日本蟲(chóng)草廣東變型(Cordyceps japonica f. guangdongensis Τ. H. Li, Q.Y.Lin et B. Song)GDIM_ C050423于2008年發(fā)表的文獻(xiàn)中更名為廣東蟲(chóng)草(Cordyceps guangdongensis T. H. Li, Q. Y. Lin &B. Song)(見(jiàn)文獻(xiàn):Lin Q Y, Li T H, Song B. Mycotaxon, 2008，103 :371-376.)。步驟(1)所述的PDA培養(yǎng)基即馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，是食用菌領(lǐng)域常使用的培養(yǎng)基。步驟( 所述的一級(jí)菌種還可以進(jìn)一步按培養(yǎng)基體積5% 15%的接種量在步驟 (2)所述的液體培養(yǎng)基中以同樣的培養(yǎng)條件培養(yǎng)4 7天，至菌絲球充滿全部培養(yǎng)基，形成二級(jí)液體菌種，步驟C3)所述的一級(jí)菌種替換為二級(jí)菌種。步驟C3)所述的葡萄糖、麥芽浸出物、酵母浸膏等購(gòu)自廣東省環(huán)凱微生物科技有限公司；黃豆購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。步驟(4)所述的分離胞外多糖可以采用常規(guī)的方法如離心法或過(guò)濾法等，胞外多糖干燥是于40 60°C下烘干或進(jìn)行凍干。將胞外多糖干品進(jìn)行稱重，按照苯酚-硫酸法 (閆文娟，李泰輝，唐芳勇，鄭必勝，姜子德.廣東蟲(chóng)草多糖的提取及含量測(cè)定.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，3(K4) :53-56.)測(cè)定廣東蟲(chóng)草多糖產(chǎn)率。本發(fā)明的廣東蟲(chóng)草胞外多糖產(chǎn)率可達(dá)到1. 4 1. 7g/L。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水IOOOmL煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過(guò)濾，再加 10 20g葡萄糖和17 20g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過(guò)濾，分裝試管，視試管大小而定每試管約5 10mL，15磅蒸氣121°C滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面，得到PDA培養(yǎng)基，冷卻貯存?zhèn)溆?。將葡萄?0g，蛋白胨5g，麥芽浸出物3g，酵母浸膏3g加水混合，定容至IOOOmL, 調(diào)節(jié)PH6.0，得到液體培養(yǎng)基。將葡萄糖10g，黃豆10g，酵母浸膏4g加水混合，定容至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH至9.0，得
到生產(chǎn)液體培養(yǎng)基。將廣東蟲(chóng)草母種一塊黃豆大小的菌塊(約0. 5cm2大小)接種在PDA培養(yǎng)基上， 20°C下暗培養(yǎng)30天，菌落直徑長(zhǎng)至4 5cm時(shí)，得到斜面菌種。將斜面菌種按250mL培養(yǎng)基接入10塊黃豆大小的菌塊的比例接至液體培養(yǎng)基中， 20°C下，振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，培養(yǎng)8天，菌絲球充滿液體培養(yǎng)基，菌絲球平均直徑約2 3mm，且大小均勻，得到一級(jí)菌種。將25mL —級(jí)菌種接種至250mL生產(chǎn)液體培養(yǎng)基中，25°C，振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為 120r/min,通氣量lOL/min，培養(yǎng)4天，至菌絲球充滿全部培養(yǎng)基。離心法分離菌絲體和培養(yǎng)殘液，往培養(yǎng)殘液加入3倍體積的酒精，使酒精的終濃度為體積分?jǐn)?shù)70%，4°C下靜置過(guò)夜， 析出胞外多糖。通過(guò)離心法收集胞外多糖，40°C下烘干，稱重，按照苯酚-硫酸法測(cè)得胞外多糖產(chǎn)率為1. 7g/L。實(shí)施例2 PDA培養(yǎng)基制備同實(shí)施例1。將葡萄糖7g，蛋白胨6g，麥芽浸出物6g，酵母浸膏3g加水混合，定容至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH6. 5，得到液體培養(yǎng)基。將葡萄糖30g，麥芽浸出物10g，酵母浸膏8g加水混合，定容至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH至 4.0，得到生產(chǎn)液體培養(yǎng)基。將廣東蟲(chóng)草母種一塊黃豆大小的菌塊接種在PDA培養(yǎng)基上，25°C下暗培養(yǎng)20天， 菌落直徑長(zhǎng)至4 5cm時(shí)，得到斜面菌種。將斜面菌種按250mL培養(yǎng)基接入12塊黃豆大小的菌塊的比例接至液體培養(yǎng)基中， 下，振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)7天，菌絲球充滿液體培養(yǎng)基，菌絲球平均直
徑約2 3mm，且大小均勻，得到一級(jí)菌種。將一級(jí)菌種12. 5mL接入250mL液體培養(yǎng)基，25°C下，振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為140r/ min，培養(yǎng)5天，菌絲球充滿液體培養(yǎng)基，菌絲球平均直徑約2 3mm，且大小均勻，得到二級(jí)菌種。將1. 25L 二級(jí)液體菌種接種至25L生產(chǎn)液體培養(yǎng)基中，攪拌速度為180r/min，通氣量為25L/min，培養(yǎng)2天，至菌絲球充滿全部培養(yǎng)基，過(guò)濾法分離菌絲體和培養(yǎng)殘液，往培養(yǎng)殘液加入3倍體積的酒精，使酒精的終濃度為體積分?jǐn)?shù)70%，4°C下靜置過(guò)夜，析出胞外多糖，過(guò)濾法收集胞外多糖，40°C下烘干，胞外多糖產(chǎn)率為1. 5g/L。實(shí)施例3 PDA培養(yǎng)基制備同實(shí)施例1。將葡萄糖8g，蛋白胨3g，麥芽浸出物3g，酵母浸膏5g加水混合，定容至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH6. 5，得到液體培養(yǎng)基。將葡萄糖20g，麥芽浸出物15g，酵母浸膏6g加水混合，定容至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH至
4.0，得到生產(chǎn)液體培養(yǎng)基。將廣東蟲(chóng)草母種一塊黃豆大小的菌塊接種在PDA培養(yǎng)基上，25°C下暗培養(yǎng)20天， 菌落直徑長(zhǎng)至4 5cm時(shí)，得到斜面菌種。將斜面菌種按250mL培養(yǎng)基接入10塊黃豆大小的菌塊的比例接至液體培養(yǎng)基中， 下，振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)7天，菌絲球充滿液體培養(yǎng)基，菌絲球平均直
徑約2 3mm，且大小均勻，得到一級(jí)菌種。將一級(jí)菌種45L接入300mL液體培養(yǎng)基，25°C下，振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為140r/min， 培養(yǎng)5天，菌絲球充滿液體培養(yǎng)基，菌絲球平均直徑約2 3mm，且大小均勻，得到二級(jí)菌種。將9L 二級(jí)液體菌種接種至60L生產(chǎn)液體培養(yǎng)基中，攪拌速度為180r/min，通氣量為25L/min，培養(yǎng)2天，至菌絲球充滿全部培養(yǎng)基，過(guò)濾法分離菌絲體和培養(yǎng)殘液，往培養(yǎng)殘液加入5倍體積的酒精，使酒精的終濃度為體積分?jǐn)?shù)83%，4°C下靜置過(guò)夜，析出胞外多糖， 過(guò)濾法收集胞外多糖，40°C下烘干，胞外多糖產(chǎn)率為1. 4g/L。
權(quán)利要求
1.一種廣東蟲(chóng)草胞外多糖的生產(chǎn)方法，其特征包括以下步驟(1)將廣東蟲(chóng)草(Cordycepsguangdongensis T. H. Li，Q. Y. Lin & B. Song)母種接種在 PDA培養(yǎng)基上，20 25°C下暗培養(yǎng)20 30天，菌落直徑長(zhǎng)至4 5cm時(shí)，得到斜面菌種；(2)將步驟⑴得到的斜面菌種按每250mL培養(yǎng)基接入8 12塊黃豆大小菌塊的比例接種至液體培養(yǎng)基，20 下，搖床轉(zhuǎn)速為120 180r/min，振蕩培養(yǎng)7 8天，至菌絲球充滿液體培養(yǎng)基，得到一級(jí)菌種，所述的液體培養(yǎng)基PH6. 0 6. 5，每升培養(yǎng)基由葡萄糖 7 10g，蛋白胨3 6g，麥芽浸出物3 6g，酵母浸膏3 5g和余量的水組成；(3)將步驟( 得到的一級(jí)菌種按培養(yǎng)基體積5% 15%的接種量接種至生產(chǎn)液體培養(yǎng)基中，20 下，搖床轉(zhuǎn)速為120 180r/min，通氣量10 25L/min，振蕩培養(yǎng)2 4 天，至菌絲球充滿全部培養(yǎng)基，分離菌絲體和培養(yǎng)殘液，所述的生產(chǎn)液體培養(yǎng)基pH4 9，每升生產(chǎn)培養(yǎng)基由碳源10 40g、氮源6 14g和余量的水組成，所述的碳源是葡萄糖和/或麥芽浸出物，氮源是酵母浸膏和/或黃豆；(4)在將步驟C3)得到的培養(yǎng)殘液中加入3 5倍體積的酒精，使酒精的終濃度為體積分?jǐn)?shù)70%以上，4 6°C下靜置至析出胞外多糖，分離胞外多糖，干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種廣東蟲(chóng)草胞外多糖的生產(chǎn)方法，其特征是步驟O)中所述的一級(jí)菌種進(jìn)一步按培養(yǎng)基體積5% 15%的接種量在步驟( 所述的液體培養(yǎng)基中以同樣的培養(yǎng)條件培養(yǎng)4 7天，至菌絲球充滿全部培養(yǎng)基，形成二級(jí)液體菌種，步驟(3)所述的一級(jí)菌種替換為二級(jí)菌種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種廣東蟲(chóng)草胞外多糖的生產(chǎn)方法，其特征是將廣東蟲(chóng)草(Cordyceps guangdongensis T.H.Li，Q.Y.Lin & B.Song)母種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到斜面菌種，然后將斜面菌種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)成一級(jí)菌種或進(jìn)一步培養(yǎng)成二級(jí)菌種，再將一級(jí)菌種或二級(jí)菌種在生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至菌絲球充滿全部培養(yǎng)基，分離菌絲體和培養(yǎng)殘液，最后在得到的培養(yǎng)殘液中加入3～5倍體積的酒精，使酒精的終濃度為體積分?jǐn)?shù)70％以上，4～6℃下靜置至析出胞外多糖，分離胞外多糖，干燥即可。本發(fā)明的胞外多糖產(chǎn)率可達(dá)到1.4～1.7g/L。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102277397SQ20111021093
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月26日
發(fā)明者宋斌, 李泰輝, 林群英, 黃浩 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所