專利名稱：一種用于快速檢測華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因snp位點(diǎn)的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能用于快速檢測華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP位點(diǎn)的方法，具體說是通過抽取人外周血DNA，通過Taq man探針特異性PCR擴(kuò)增后進(jìn)行熒光信號(hào)分析，對(duì)CYP2C9*3 (1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行快速精確基因分型。該方法可以用于臨床需要服用華法林的各類患者的輔助診斷、治療，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域臨床檢測技術(shù)中的基因檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
華法林是目前廣泛應(yīng)用的香豆素類口服抗凝藥，用于預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病如:人工瓣膜置換、靜脈血栓形成(肺栓塞)、房顫等的口服抗凝治療，以及降低心肌梗死復(fù)發(fā)及心肌梗死后血栓栓塞死亡的危險(xiǎn)。但是華法林的劑量很難掌握，因?yàn)椴煌∪说乃栌昧靠梢韵嗖钍兑陨?。目前，CYP2C9和維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)基因多態(tài)性對(duì)華法林代謝的影響逐漸被認(rèn)識(shí)，其中CYP2C9*3 (1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)與華法林關(guān)系最為密切，都與代謝酶的損傷有關(guān)，從而導(dǎo)致個(gè)體間和民族間華法林用量的差異。因此，臨床上一種快速準(zhǔn)確的基因分型方法的應(yīng)用將對(duì)需華法林治療的患者提供個(gè)體化的醫(yī)療方案?，F(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)有30多種基因相互作用決定華法林代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和藥理作用?；颊卟煌乃幬锘蚪M學(xué)信息是導(dǎo)致華法林劑量差異的重要因素。與遺傳因素相關(guān)的低凝血酶原患者最常見的原因是CYP2C9代謝活性降低和藥物靶標(biāo)VKORCl (vitamin K epoxidereductase complexl)低表達(dá)。這兩種基因的遺傳多態(tài)性在全世界范圍內(nèi)可解釋15%和25%的華法林劑量變異。有研究顯示基于這兩種基因多態(tài)性的華法林使用劑量能夠有效的減少不良事件的發(fā)生和血栓性疾病的預(yù)防`[1，2]。因此美國FDA在2007年修改了華法林的使用說明，建議在使用華法林前進(jìn)行基因分型。而且CYP2C9、VKORCl基因多態(tài)性分析已經(jīng)成為國內(nèi)外有條件的臨床實(shí)驗(yàn)室重要檢測項(xiàng)目。目前檢測CYP2C9*3 (1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)遺傳多態(tài)性的最簡單的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通過應(yīng)用特異性限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并根據(jù)消化位點(diǎn)是否消失來判斷其變異存在與否。但該方法操作復(fù)雜，樣本量多時(shí)易造成PCR產(chǎn)物的交叉污染且容易出現(xiàn)酶切不充分或酶切過度而出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果，可靠性低。熒光定量PCR和多重PCR方法盡管特異性有所提高，但是這兩種方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，引物特異性以及低保真Taq酶等這些因素均可造成對(duì)結(jié)果的影響。DNA測序法價(jià)格相對(duì)昂貴且操作流程繁瑣，在人類后基因組時(shí)代突飛猛進(jìn)的今天，這幾種方法均不能滿足當(dāng)前對(duì)VKORCl (-1639G/A)和CYP2C9 (1075A/C) SNP位點(diǎn)快速準(zhǔn)確分析的要求。Taqman探針的方法采用特異性的熒光標(biāo)記的探針，特異性強(qiáng)，靈敏度高且操作方便，快速。該方法同樣被認(rèn)為是SNP分型的金標(biāo)準(zhǔn)，在臨床應(yīng)用的前景值得期待。其基本原理是:應(yīng)用一對(duì)雙熒光標(biāo)記的Taqman探針，分別針對(duì)雙等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探針擴(kuò)增出各自的基因型；用兩種熒光染料FAM，HEX (VIC)分別標(biāo)記這兩種探針，就可以在一次PCR反應(yīng)中完成對(duì)單個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型判定。所以該方法中引物長度，探針長度，引物特異性，探針特異性對(duì)檢測結(jié)果的特異性和敏感性非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的首要技術(shù)問題是提供一種能快速精確進(jìn)行華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)基因分型的方法。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種快速能精確進(jìn)行華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)基因分型的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種能快速精確進(jìn)行華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)基因分型的方法，該方法通過提取人的外周血白細(xì)胞基因組DNA，采用Taqman探針的方法測定受試者的CYP2C9*3(1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)兩個(gè)位點(diǎn)的基因型。一組能快速精確進(jìn)行華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)基因分型的引物，該引物能特異性的擴(kuò)增出CYP2C9*3 (1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，一組能快速精確進(jìn)行華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)基因分型的探針，該探針能特異性的結(jié)合在目的片段， 通過PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的倍增。其核心是利用Taq酶的3’ _5’外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。

具有序列表SEQ ID No:1到10所示的堿基序列:其中SEQ ID No:1是CYP2C9 *3 (1061 A/C)，SEQ ID No:10 是 VKORCl (-1639G/A), SEQIDNo:2 和 3 所示序列為 CYP2C9*3(1061 A/C)位點(diǎn)F和R引物序列，SEQ ID No:4和5所示序列為VKORCl (-1639G/A)位點(diǎn)F和R引物序列。SEQ ID No:6和7所示序列為CYP2C9氺3 (1061A/C)位點(diǎn)FAM和HEX探針序列，SEQ ID No:8和9所示序列為VKORCl (-1639G/A)位點(diǎn)FAM和HEX探針序列。本發(fā)明提供第一組引物，其特征在于，所述引物為下列序列所示的引物對(duì):F 引物 5，-TGCAAGACAGGAGCCACATG-3’ (SEQ ID No:2)R 引物 5，-GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3，(SEQ ID No:3)本發(fā)明還提供第一組探針，其特征在于，所述探針為下列序列所示的探針:HEX 探針 HEX-CAGAGATACCTTGACCTT-MGB ; (SEQ ID No:6)，和FAM 探針 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB (SEQ ID No:7)。進(jìn)一步，本發(fā)明的第一組探針的5，端標(biāo)記有報(bào)告基因，3，端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。優(yōu)選所述探針的5’端標(biāo)記的報(bào)告基因是FAM或VIC，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA。本發(fā)明還提供上述引物或者探針在制備檢測CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒中的應(yīng)用。所述CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點(diǎn)優(yōu)選和華法林個(gè)體化用藥相關(guān)。本發(fā)明提供第一種試劑盒，其特征在于，包括上述檢測CYP2C9*3(1061A/C)多態(tài)性位點(diǎn)的引物的核酸分子。該試劑盒優(yōu)選進(jìn)一步包括上述任一探針，更優(yōu)選的是，所述試劑盒中引物和探針的含量為F引物0.5 μ 1，R引物0.5 μ 1，F(xiàn)AM探針0.1 μ 1，HEX探針0.1 μ I。本發(fā)明還提供一種上述試劑盒在檢測CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點(diǎn)中的應(yīng)用，優(yōu)選的所述CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點(diǎn)和華法林個(gè)體化用藥相關(guān)。
本發(fā)明還提供第二組引物，其特征在于，所述引物為下列序列所示的引物對(duì):F 引物 5，-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3’ (SEQ ID No:4)R 引物 5，-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3，(SEQ ID No:5)。本發(fā)明還提供第二組探針，其特征在于，所述探針為下列序列所示的探針:HEX 探針 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ; (SEQ ID No:8)，和FAM 探針 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB (SEQ ID No:9)。進(jìn)一步，本發(fā)明的第二組探針的5，端標(biāo)記有報(bào)告基因，3，端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。優(yōu)選所述探針的5’端標(biāo)記的報(bào)告基因是FAM或VIC，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA。本發(fā)明提供一種上述第二組引物或者第二組任一探針在制備檢測VKORCl(-1639G/A)多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒中的應(yīng)用。所述VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點(diǎn)優(yōu)選和華法林個(gè)體化用藥相關(guān)。本發(fā)明還提供第二種試劑盒，其特征在于，包括第二組引物的核酸分子。優(yōu)選，所述試劑盒還包括上述任一第二組探針。進(jìn)一步，所述試劑盒中的核酸分子含量優(yōu)選F引物0.5 μ 1，R 引物 0.5 μ 1，F(xiàn)AM 探針 0.1 μ 1，HEX 探針 0.1 μ I。本發(fā)明還提供上述第二種試劑盒在檢測VK0RC1(_1639G/A)多態(tài)性位點(diǎn)中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點(diǎn)和華法林個(gè)體化用藥相關(guān)。本發(fā)明還提供第三組引物，其特征在于，所述引物為第一組和第二組引物對(duì):F 引物 5，-TGCAAGACAGGAGCCACATG-3’ (SEQ ID No:2)R 引物 5，-GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3，(SEQ ID No:3)，和F 引物 5，-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3’(SEQ ID No:4)R 引物 5，-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3，(SEQ ID No:5)本發(fā)明還提供第三組探針，其特征在于，所述探針為第一組和第二組探針:HEX 探針 HEX-CAGAGATACCTTGACCTT-MGB ; (SEQ ID No:6)，F(xiàn)AM 探針 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB (SEQ ID No:7)，和HEX 探針 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ; (SEQ ID No:8)，F(xiàn)AM 探針 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB (SEQ I D No:9)。進(jìn)一步，本發(fā)明的第三組探針的5，端標(biāo)記有報(bào)告基因，3，端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。優(yōu)選所述探針的5’端標(biāo)記的報(bào)告基因是FAM或VIC，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA。本發(fā)明還提供上述第三組引物或者任一探針在制備聯(lián)合檢測CYP2C9*3(1061A/C)多態(tài)性位點(diǎn)和VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒中的應(yīng)用。所述CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點(diǎn)和VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點(diǎn)優(yōu)選和華法林個(gè)體化用藥相關(guān)。本發(fā)明提供第三種試劑盒，其特征在于，包括上述第三組引物的核酸分子。該試劑盒優(yōu)選進(jìn)一步包括上述第三組任一探針，更優(yōu)選的是，所述試劑盒中每對(duì)引物和探針的含量為 F 引物 0.5 μ 1，R 引物 0.5 μ 1，F(xiàn)AM 探針 0.1 μ 1，HEX 探針 0.1 μ I。本發(fā)明還提供一種上述第三組試劑盒在聯(lián)合檢測CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點(diǎn)和VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點(diǎn)中的應(yīng)用，優(yōu)選的所述CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點(diǎn)和VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點(diǎn)和華法林個(gè)體化用藥相關(guān)。進(jìn)一步，一種能快速精確進(jìn)行華法林個(gè)體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)基因分型的試劑盒(10人份)，由以下試劑組成:
TaqMan* Genotyping Master Mix28 μ I, F 引物 0.5 μ 1，R 引物 0.5 μ 1，F(xiàn)AM 探針
0.1 μ 1，HEX探針0.1 μ 1，余量為超純水，總體積為50μ I。F和R引物是序列表SEQ ID No:2和3，或SEQ ID No:4和5所示的堿基序列。FAM和HEX探針是序列表SEQ ID No:6和7，或SEQID No:8和9所示的堿基序列。試劑盒保存溫度為-20度。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):使用了目前國際上普遍認(rèn)同的TaqMan探針技術(shù)對(duì)CYP2C9*3 (1061 A/C)和VKORCl (-1639G/A)進(jìn)行基因分型，其原理主要是，在TaqMan探針法的PCR反應(yīng)體系中，包括一對(duì)PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告基因，如FAM，VIC等，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基因所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3’ _5’外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。



圖1CYP2C9*3 (1061 A/C)和 VKORCl (-1639G/A)各基因型的 TaqMan 基因分型圖譜。圖中紅點(diǎn)代表等位基因X，綠點(diǎn)代表等位基因XY，藍(lán)點(diǎn)代表等位基因Y。A圖為CYP2C9*3(1075 A/C)(rsl057910)探針分型結(jié)果，綠點(diǎn)為 CYP2C9*l/*3，紅點(diǎn)為 CYP2C9*1/*1 ;B 圖為VKORCl (-1639A/G) (rs9923231)探針分型結(jié)果，紅點(diǎn)為 VKORCl (-1639A/A)，藍(lán)點(diǎn)為 VKORCl(-1639G/G)，綠點(diǎn)為 VKORCl (-1639A/G)圖2CYP2C9*3 (1061 A/C)和 VKORCl (-1639G/A)各基因型的 DNA 測序圖譜。a圖為VKORCl (-1639G/A)位點(diǎn)的DNA測序圖，共有三種基因型分別是-1639A/A, -1639G/A和-1639G/G ；b圖為CYP2C9*l/*3位點(diǎn)的DNA測序圖，共有兩種基因型分別是CYP2C9*1/*1和 CYP2C9*l/*3。下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并非對(duì)發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一種能用于快速精確華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP位點(diǎn)基因分型的試劑盒一、試劑盒成分、使用方法及結(jié)果1.PCR擴(kuò)增試劑:10人份量
權(quán)利要求
1.一種引物，其特征在于，所述引物為下列序列所示的一對(duì)或者兩對(duì)引物對(duì):F 引物 5' -TGCAAGACAGGAGCCACATG-3' (SEQ ID No:2),R 引物 5' -GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3' (SEQ ID No: 3 )和 / 或F 引物 5' -AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3' (SEQ ID No:4),R 引物 5' -TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3' (SEQ ID No:5)。
2.一種探針，其特征在于，所述探針為下列序列所示的一組或者兩組探針:HEX 探針 HEX-CAGAGATACCTTGACCTT-MGB ;(SEQ ID No:6), FAM 探針 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB (SEQ ID 吣:7)，和/或HEX 探針 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ;(SEQ ID No:8), FAM 探針 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB (SEQ ID No:9)。
3.如權(quán)利要求2所述的探針，其中所述探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告基因，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，優(yōu)選所述探針的5’端標(biāo)記的報(bào)告基因是FAM或VIC，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是 TAMRA。
4.權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2-3的任一探針在制備檢測CYP2C9*3(1061A/C)和/或VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒中的應(yīng)用。
如權(quán)利要求4的應(yīng)用，所述CYP2C9*3 (1061A/C)和/或VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點(diǎn)和華法林個(gè)體化用藥相關(guān)。
5.一種試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的引物。
6.如權(quán)利要求6的試劑盒，其進(jìn)一步包括如權(quán)利要求2-3的任一探針。
7.如權(quán)利要求7的試劑盒，所述每個(gè)引物和探針的含量為:F引物0.5μ 1，R引物·0.5 μ 1，F(xiàn)AM 探針 0.1 μ I, HEX 探針 0.1 μ I。
8.權(quán)利要求6-8任一所述的試劑盒在檢測CYP2C9*3(1061A/C)和/或VKORCl(-1639G/A)多態(tài)性位點(diǎn)中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求10的應(yīng)用，所述CYP2C9*3(1061A/C)和/或VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點(diǎn)和華法林個(gè)體化用藥相關(guān)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于快速檢測華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP位點(diǎn)的試劑盒及其檢測方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域臨床檢測技術(shù)中的基因檢測技術(shù)。本發(fā)明通過抽取人外周血DNA，通過Taq man探針特異性PCR擴(kuò)增后進(jìn)行熒光信號(hào)分析，對(duì)CYP2C9*3(1061A/C)和VKORC1(-1639G/A)兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行快速精確基因分型。本發(fā)明提供檢測上述多態(tài)性位點(diǎn)的引物、探針和試劑盒，以及該引物和探針制備試劑盒中的用途，以及根據(jù)上述多態(tài)性位點(diǎn)檢測結(jié)果確定患者的華法林用量的用途，該用途能夠有效的減少華法林用量相關(guān)不良事件的發(fā)生和血栓性疾病的預(yù)防?？梢杂糜谂R床需要服用華法林的各類患者的輔助診斷、治療。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103146692SQ20131005512
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者丁虎, 汪道文 申請(qǐng)人:丁虎, 汪道文