專利名稱：胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
^^ ^STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)基因的胃癌的基因治療藥物，具體涉及靶向胃癌STAT3基因的siRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建、 篩選及其用途，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胃癌是常見的癌癥之一，全世界每年新診斷病例約930000例，每年死于胃癌的患者約700000人。雖然手術(shù)治療和輔助化療技術(shù)不斷改進(jìn)，胃癌患者的生存率仍然不能令人
兩意。近年來，信號傳導(dǎo)途經(jīng)在腫瘤的發(fā)病機(jī)制和防治手段的研究中越來越受到人們的重視。其中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子家族(STATs)信號傳導(dǎo)途經(jīng)的研究尤為突出。JAK/ STATs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡密切相關(guān)，該通路異?；罨蓪?dǎo)致細(xì)胞異常增殖與惡性轉(zhuǎn)化。STAT 由 STATl、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 及 STAT6 等 7 個(gè)成員組成，其中STAT3與腫瘤的關(guān)系最為密切。研究顯示，STAT3過度激活后將生成同源二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核，識別并結(jié)合到靶基因DNA特異的反應(yīng)元件上，進(jìn)而調(diào)控抗凋亡基因Bcl-XL、Survivin和細(xì)胞周期控制基因 c-Myc和cyclinDl以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等的表達(dá)，從而有利于腫瘤細(xì)胞的生長。 有研究發(fā)現(xiàn)，STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號匯聚的焦點(diǎn)，因此理論上阻斷腫瘤細(xì)胞STAT3信號傳導(dǎo)通路就有可能起到治療腫瘤的作用。盡管STAT3也參與正常細(xì)胞因子信號的調(diào)節(jié)，但是在正常細(xì)胞中阻斷STAT3信號通路后并不影響正常細(xì)胞的增殖和存活。因而阻斷STAT3途徑可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長而對正常細(xì)胞呈現(xiàn)出低毒性的損害，這使STAT3成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明STAT3與胃癌的關(guān)系十分密切。Jackson等證實(shí)胃癌細(xì)胞胞漿和胞核中都存在STAT3的過表達(dá)。Kim等也發(fā)現(xiàn)STAT3的表達(dá)與胃癌局域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 Bronte-Tinkew DM等發(fā)現(xiàn)STAT3信號路徑的異常活化促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展。Deng J等人認(rèn)為STAT3與胃癌發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，是預(yù)測胃癌預(yù)后的一個(gè)重要的分子生物學(xué)指標(biāo)。 我們的前期工作也證實(shí)胃癌組織中存在STAT3高表達(dá)，并與胃癌的 Μ分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分級密切相關(guān)。RNA干擾是由雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)的在植物、動(dòng)物和許多真菌中均存在的序列特異性基因沉默現(xiàn)象。RNA干擾具有高度特異性，在RNAi過程中，dsRNA能夠特異性誘導(dǎo)其同源基因mRNA的降解，形成21 23個(gè)核苷酸(21 23nts)的小核苷酸片段，再在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步降解，其他基因幾乎不受影響。此外，RNA干擾具有高效性，研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞僅需要幾個(gè)分子的小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)，即可產(chǎn)生類似于缺失突變體表型的RNAi效應(yīng)。RNAi可能的作用機(jī)制如下不同來源的dsRNA通過各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入植物或線蟲細(xì)胞內(nèi)，與Dicer的C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合產(chǎn)生21 23nt siRNAs片段。每個(gè)片段的3'端都有2nt核苷酸突出；Dicer通過PAZ結(jié)構(gòu)域與含有PAZ結(jié)構(gòu)域的Argonaute蛋白互相作用，核酸內(nèi)外切酶、解旋酶與Argonaute蛋白相連進(jìn)而與siRNA —起形成具有多個(gè)亞單元的核糖核苷酸蛋白復(fù)合物(RNA-inducing silencing complex，RISC)。RISC中的解旋酶應(yīng)用ATP解開siRNA雙鏈，使其反義鏈互補(bǔ)結(jié)合到靶向mRNA上與之相匹配的特異性序列， RISC中的核酸酶降解mRNA，降解的mRNA隨后迅速的被細(xì)胞其他的RNA酶所降解。從而使目的基因沉默，產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。Brummelkamp等發(fā)現(xiàn)通過向細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)入可以表達(dá)siRNA的質(zhì)粒，可以使RNA干擾穩(wěn)定地維持2個(gè)月。腫瘤是多基因疾病，在基因治療領(lǐng)域RNA干擾特別適合用于某個(gè)基因過度表達(dá)或由于體內(nèi)突變基因表達(dá)所致的疾病。利用RNA干擾相關(guān)技術(shù)可以針對在細(xì)胞癌變過程中發(fā)揮重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相關(guān)基因、生長因子及其受體以及部分關(guān)鍵酶等， 在不影響正?；蚬δ艿那疤嵯乱种仆蛔兓虮磉_(dá)或基因的過量表達(dá)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表達(dá)載體構(gòu)建、篩選及其用途。術(shù)語說明STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子禾口轉(zhuǎn)錄激活子3。本發(fā)明以利用RNA干涉技術(shù)為主，針對STAT3基因的不同靶序列，構(gòu)建了兩個(gè)能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)siRNA的表達(dá)質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vectorl/2，以下簡稱STAT3-siRNAl/2。其示意圖譜見

圖1，能高效的特異性的抑制STAT3基因表達(dá)，可用于制備治療高表達(dá)STAT3基因的胃癌的基因藥物。本發(fā)明的技術(shù)方案如下靶向STAT3基因的siRNAs表達(dá)載體，其特征是，以pGPU6/GFP/Neo siRNA ExpressionVector為載體，針對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3 (STAT3)編碼區(qū)上游、中游的兩段序列，在可較高表達(dá)STAT3胃癌細(xì)胞系HGC-27中發(fā)揮RNA干擾作用。這兩段 STAT3特異性RNA干涉靴序列分別為①5，-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3，，起始于956位； ②5，-GCGTCCAGTTCACTACTAAAG-3，，起始于1M3位，是用于STAT3基因相關(guān)性胃癌的治療性物質(zhì)，由以下方法制得(I)RNA干涉靶序列的選擇及插入序列的設(shè)計(jì)與合成選擇STAT3 基因編碼區(qū)的兩段序列① 5，-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3，② 5，-GCGTC CAGTTCACTACTAAAG-3’，設(shè)計(jì)并分別體外合成兩對互補(bǔ)的寡核苷酸序列，序列如下①STAT3寡核苷酸序列1 :正義鏈5 ’ -CACCGCAACAGATTGCCTGCATTGGTTCAAGAGACCAATGCAGGCAATCTGTTGCTTTTTTG-3’反義鏈5’ -GATCCAAAAAAGCAACAGATTGCCTGCATTGGTCTCTTGAACCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3’
②STAT3寡核苷酸序列2
正義鏈5’ -CACCGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTTCAAGAGACTTTAGTAGTGAACTGGACGCTTTTTTG-3’反義鏈5’ -GATCCAAAAAAGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTCTCTTGAACTTTAGTAGTGAACTGGACGC-3’(2)合成的寡核苷酸分別與線性載體 PGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector 連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取。首先將步驟(1)合成的兩對寡核苷酸等量混勻，95°C作用3分鐘后緩慢冷卻至室溫，然后將結(jié)合的雙鏈寡核苷酸與線性化的pGPTO/GFP/Neo siRNA Expression Vector質(zhì)粒載體連接，最后轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌，經(jīng)卡那霉素篩選，挑選單個(gè)菌落大量培養(yǎng)。用質(zhì)粒提取試劑盒提取純化質(zhì)粒DNA ；質(zhì)粒的提取純化按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。(3)質(zhì)粒的鑒定將步驟( 提取的質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計(jì)分析測定質(zhì)粒DNA 的濃度和純度，并進(jìn)行插入片斷測序，以確定合成的寡核苷酸是否已正確轉(zhuǎn)入pGPTO/GFP/ Neo siRNAExpression Vector 質(zhì)粒中。本發(fā)明的胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表達(dá)載體在制備治療表達(dá)STAT3的胃癌的基因藥物中的應(yīng)用。為了對STAT3基因siRNAs表達(dá)質(zhì)粒對STAT3基因的抑制效果及對胃癌細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行鑒定，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取總RNA，RT-PCR法測定對STAT3mRNA表達(dá)水平的抑制作用，western blotting測定抑制STAT3后對STAT3蛋白表達(dá)水平的影響，MTT法檢測抑制STAT3基因后對腫瘤細(xì)胞生長的影響。本發(fā)明針對STAT3基因構(gòu)建的兩種siRNAs表達(dá)質(zhì)粒是可用于高表達(dá)STAT3的胃癌的治療物質(zhì)，其中STAT3-siRNAl抑制胃癌細(xì)胞STAT3表達(dá)的效率較高，可用于進(jìn)一步研究STAT3基因的功能及在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行基因治療研究。下面詳細(xì)說明本發(fā)明制備方法中各步驟的具體操作方法(1) RNA干涉靶序列的選擇及插入模板的設(shè)計(jì)與合成沿mRNA序列尋找連續(xù)兩個(gè)AA 及后面的19個(gè)核苷酸，通過同源性比較，選擇與其他任何基因無同源性的序列即作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)(靶位點(diǎn)不含有3個(gè)以上的相同序列，GC含量在30% -50%左右)。按照載體試劑盒說明，針對STAT3基因的編碼序列，為找到具有最佳沉默效果的靶位點(diǎn)，選取兩段靶序列，分別從中上游選擇兩個(gè)符合條件的靶位點(diǎn)，分別為①STAT3-1 956 GCAACAGATTGCCTGCATTGG②STAT3-2 1243 GCGTCCAGTTCACTACTAAAG設(shè)計(jì)并合成兩對互補(bǔ)的寡核苷酸序列，每一正向單鏈寡核苷酸內(nèi)，21nt的寡核苷酸以正反向組合，以UUCAAGAGA為發(fā)夾環(huán)序列間隔，使寡核苷酸形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，每對寡核苷酸的核心序列反向互補(bǔ)；每對寡核苷酸兩端分別帶有與線性化載體(pGPTO/GFP/Neo siRNAExpression Vector)上相互補(bǔ)BamH I和BbsI限制性酶切位點(diǎn)，這是連接線性化載體所必需的。按以上所述，兩個(gè)靶序列設(shè)計(jì)后的寡核苷酸序列如前所述。(2)合成的寡核苷酸分別與線性載體 pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector 連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取。首先將合成的兩對寡核苷酸等量混勻，95°C作用3分鐘后慢慢冷卻至室溫，然后將結(jié)合的雙鏈寡核苷酸與線性化的pGPTO/GFP/Neo siRNA Expression Vector質(zhì)粒載體連接，最后轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌，經(jīng)卡那霉素篩選，挑選單個(gè)菌落大量培養(yǎng)。質(zhì)粒的提取純化按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。連接反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.靶向STAT3基因的siRNAs表達(dá)載體，其特征是，以pGPTO/GFP/Neo si RNA ExpressionVector為載體，針對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3 (STAT3)編碼區(qū)上、中游的兩段序列，在較高表達(dá)STAT3的胃癌細(xì)胞系HGC-27中發(fā)揮RNA干擾作用；這兩段STAT3 特異性RNA干涉靶序列分別為①5’ -GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3’，起始于956位； ②5，-GCGTCCAGTTCACTACTAAAG-3，，起始于1M3位，是用于STAT3基因相關(guān)性胃癌的治療性物質(zhì)，由以下方法制得(1)RNA干涉靶序列的選擇及插入序列的設(shè)計(jì)與合成選擇 STAT3 基因編碼區(qū)的兩段序列① 5，-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3，② 5，-GCGTCCAGT TCACTACTAAAG-3’，設(shè)計(jì)并分別體外合成兩對互補(bǔ)的寡核苷酸序列，序列如下①STAT3寡核苷酸序列1:正義鏈5 ’ -CACCGCAACAGATTGCCTGCATTGGTTCAAGAGACCAATGCAGGCAATCTGTTGCTTTTTTG-3’反義鏈5 ’ -GATCCAAAAAAGCAACAGATTGCCTGCATTGGTCTCTTGAACCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3’②STAT3寡核苷酸序列2正義鏈5’ -CACCGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTTCAAGAGACTTTAGTAGTGAACTGGACGCTTTTTTG-3’反義鏈5 ’ -GATCCAAAAAAGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTCTCTTGAACTTTAGTAGTGAACTGGACGC-3’(2)合成的寡核苷酸分別與線性載體pGPTO/GFP/NeosiRNA Expression Vector連接、 轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取將步驟(1)合成的兩對寡核苷酸等量混勻，95°C作用3分鐘后緩慢冷卻至室溫，然后將結(jié)合的雙鏈寡核苷酸與線性化的pGPTO/GFP/Neo siRNA Expression Vector質(zhì)粒載體連接，最后轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌，經(jīng)卡那霉素篩選，挑選單個(gè)菌落大量培養(yǎng)；用質(zhì)粒提取試劑盒提取純化質(zhì)粒DNA ；(3)質(zhì)粒的鑒定將步驟( 提取的質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計(jì)分析測定質(zhì)粒DNA的濃度和純度，并進(jìn)行插入片斷測序，以確定合成的寡核苷酸是否已正確轉(zhuǎn)入pGPTO/GFP/Neo siRNAExpression Vector 質(zhì)粒中。
2.權(quán)利要求1的靶向STAT3基因的siRNAs表達(dá)載體在制備治療表達(dá)STAT3的胃癌的基因藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及胃癌靶向STAT3基因的siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其用途。本發(fā)明利用RNA干擾技術(shù)為主，針對STAT3基因的不同靶序列，構(gòu)建了兩個(gè)能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)siRNA的表達(dá)質(zhì)粒STAT3-siRNA1/2。本發(fā)明胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表達(dá)載體能高效的特異性的抑制STAT3基因表達(dá)，可用于制備治療高表達(dá)STAT3基因的胃癌的基因藥物。
文檔編號C12N15/63GK102304538SQ20111022432
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者汪運(yùn)山, 童書青, 肖東杰, 郟雁飛, 鄭燕, 馬曉麗 申請人:汪運(yùn)山