專(zhuān)利名稱(chēng)：蘇云金芽孢桿菌gl-1及在土壤解磷防病方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物及其應(yīng)用，具體涉及一種蘇云金芽孢桿菌(feciB^s thuringiensis)GL-l及其在土壤解磷防病(香蕉枯萎病和番茄青枯病)和改善土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，作物吸收磷量與其生物量(r=0. 97)和產(chǎn)量(r=0. 75)呈顯著的正相關(guān)。然而由于磷固定的存在形式使得土壤缺磷在世界范圍內(nèi)廣泛存在，磷供給不足是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的限制因素之一。從我國(guó)的情況來(lái)看，全國(guó)有74%耕地土壤缺磷。解決這一問(wèn)題主要有兩條途徑一是增加磷源投入，二是提高難溶性磷的利用率。第一條途徑存在一定的問(wèn)題，首先，磷是一個(gè)不可再生資源，根據(jù)目前已探明的磷礦儲(chǔ)量和開(kāi)采速度，世界現(xiàn)有磷礦資源只能維持100年左右，而且我國(guó)磷礦資源并不豐富， 且品位較低，大量的磷肥依賴(lài)進(jìn)口。其次，磷肥生產(chǎn)需要大量的硫酸或磷酸，能源消耗大，增加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的成本。再次，高水溶性磷肥施入固磷強(qiáng)的石灰性土壤中，土壤中95%以上的磷為難溶形態(tài)，植物難以吸收利用。并且磷肥施入土壤后極易被化學(xué)固定，形成溶解性極低的磷酸鈣、鐵、鋁等化合物，作物的當(dāng)季利用率一般只有59TlO%，加上作物的后效，也不超過(guò) 25%。因此，大部分磷肥作為無(wú)效態(tài)(難溶態(tài))在土壤中積累。據(jù)報(bào)道，至少有709Γ90%的磷進(jìn)入土壤而成為難以被作物吸收利用的固定形態(tài)。在這些土壤中，土壤有效磷含量很低而全磷含量較高，如據(jù)黃土高原7省區(qū)的調(diào)查，土壤全磷平均較有效磷高250倍；黃淮海平原黃潮土與風(fēng)沙土全磷較有效磷高13(Γ500倍。我國(guó)自20世紀(jì)50年代施用化學(xué)磷肥以來(lái)， 儲(chǔ)存累積在土壤中的難溶性磷高達(dá)6000萬(wàn)噸，超過(guò)目前全國(guó)磷肥10年消費(fèi)量的總和。增施磷肥是一種“高投入，低產(chǎn)出”的途徑。同時(shí)，我國(guó)的磷肥資源匾乏，生產(chǎn)能力難以滿(mǎn)足需求。因此，提高磷肥利用效率，增強(qiáng)土壤磷素的活化與利用成為科學(xué)研究的重要任務(wù)。第二條途徑的潛力則很大，包括三方面的內(nèi)容一是發(fā)揮植物的自身潛力，通過(guò)育種技術(shù)的創(chuàng)新，定向地篩選培育磷高效植物品種來(lái)開(kāi)發(fā)利用土壤難溶性磷素資源；二是在研究磷在土壤中的形態(tài)分布特征和作物吸磷特性的基礎(chǔ)上，通過(guò)改進(jìn)磷肥的施用技術(shù)等方式提高磷的潛在有效性；三是從土壤中篩選高效解磷微生物，研制成解磷菌劑拌種或直接施入土壤，將土壤中難溶性磷活化出來(lái)。溶磷微生物廣泛分布于土壤，是一類(lèi)能改進(jìn)磷肥固定、提高磷肥利用率和溶解土壤難溶磷的微生物群，已經(jīng)被世界公認(rèn)為是一種廉價(jià)高效的環(huán)保型土壤磷活化生物措施。利用溶磷微生物對(duì)提高磷肥的有效性和土壤難溶磷的利用率、減少磷肥投入、發(fā)揮我國(guó)有限磷礦的增產(chǎn)作用和農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展意義重大。鑒于不同種類(lèi)的溶磷菌或不同菌株之間的溶磷能力有較大差異，高效溶磷菌的篩選工作尤為重要。香蕉枯萎病(Banana Wilt Disease)又名香蕉巴拿馬病、黃葉病，是由尖孢鐮刀菌 (.Fusarium oxysporum)侵染而引起的維管束壞死的一種毀滅性香蕉真菌病害和典型的土傳病害。該病是目前香蕉產(chǎn)業(yè)的最大威脅，近年來(lái)在我國(guó)香蕉主產(chǎn)區(qū)持續(xù)暴發(fā)，造成嚴(yán)重?fù)p失。香蕉枯萎病菌根據(jù)鑒別寄主的不同分為4個(gè)生理小種，當(dāng)今香蕉栽培品種Carvebdish 雖可抗1號(hào)及2號(hào)生理小種，然而4號(hào)生理小種幾乎對(duì)所有香蕉栽培種均致病，嚴(yán)重威脅香蕉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。因此，加強(qiáng)香蕉枯萎病的防治研究迫在眉睫。目前對(duì)香蕉枯萎病的防治主要是通過(guò)抗、耐病品種的選育、藥劑防治、水旱輪作等方法和措施進(jìn)行防治。雖然很多學(xué)者都針對(duì)香蕉枯萎病進(jìn)行化學(xué)藥劑的篩選，室內(nèi)有些藥劑對(duì)枯萎病菌有很好的抑制效果，然而化學(xué)藥劑不但防治成本高，殘留期較長(zhǎng)，容易對(duì)環(huán)境中的其他非靶標(biāo)生物產(chǎn)生不良影響，造成對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染和破壞，且田間防治效果也不理想。利用微生物及其代謝產(chǎn)物、植物提取物等生物農(nóng)藥進(jìn)行防治，使用對(duì)人體和生態(tài)環(huán)境無(wú)害的生防菌劑替代化學(xué)農(nóng)藥已成為世界范圍內(nèi)的研究發(fā)展方向。番茄青枯病(iTomatoBacterial Wilt)是由青枯假單胞 i、Ralstonia Solanacearum^引起的一種毀滅性土傳病害。該菌菌系復(fù)雜，寄主廣泛，高溫高濕環(huán)境下生命力頑強(qiáng)，能侵染50多個(gè)科的450多種植物，防治難度大。雖然在抗病品種選育、化學(xué)防治、 農(nóng)業(yè)防治等方面進(jìn)行了大量的研究，但至今效果均不理想。生物防治一直是解決土傳病害的重要途經(jīng)，并且符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求，已經(jīng)成為防治該病害的重點(diǎn)發(fā)展方向。我國(guó)從60年代初就已開(kāi)始研究青枯病的生物防治。目前，青枯病拮抗菌集中在無(wú)致病力青枯菌和內(nèi)生菌的研究。迄今為止，篩選出的生防菌株主要有芽孢桿菌、假單胞菌、菌根真菌及鏈霉菌等少數(shù)放線菌。龍良鯤等和黎起秦等從番茄根內(nèi)分離出青枯病的內(nèi)生拮抗菌，有一定的防效；Lemessa F.通過(guò)根際微生物的篩選，得到效果較好的拮抗菌株APFl和B2G。這些進(jìn)展為番茄青枯病的生物防治奠定了重要基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)解磷菌、香蕉枯萎病和番茄青枯病拮抗菌的研究穩(wěn)步開(kāi)展，但這些研究大多局限于解磷菌單一的解磷能力、或者單一的枯萎病和青枯病拮抗功能。而在具有高效解磷作用的同時(shí)，并對(duì)香蕉枯萎病菌和番茄青枯病菌產(chǎn)生拮抗作用的多功能菌株卻未曾報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題，提供一種兼具解磷與防病功能的蘇云金芽孢桿菌。本發(fā)明的另一目的是提供上述菌株的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
一種蘇云金芽孢桿菌(Macillus thuringiensis )GL_1，簡(jiǎn)稱(chēng)GL-I菌。該菌株于2011年 6月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)CGMCC No. 4923，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。該GL-I菌是在廣西壯族自治區(qū)興安縣漠川鄉(xiāng)石灰?guī)r母質(zhì)發(fā)育的土壤中進(jìn)行分離、純化所得，屬革蘭氏陽(yáng)性菌，有芽孢；菌體為桿狀，有運(yùn)動(dòng)性，好養(yǎng)；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后形成的菌落為圓形或不規(guī)則狀，4 后菌落全部為圓形，乳白色，直徑約為2 3mm，邊緣不整齊，扁平濕潤(rùn)。經(jīng)過(guò)序列測(cè)定，該GL-I菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。GL-I菌的保藏方法，其保藏培養(yǎng)基的成分為牛肉膏3. 0g，蛋白胨5. Og,氯化鈉 5. 0g，瓊脂18. 0g，蒸餾水1000ml，或按照此比例配制成的培養(yǎng)基，pH值為7. (Γ7. 2。按常規(guī)菌種保藏溫度保藏。一種生物肥，含有本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌GL-I或其發(fā)酵產(chǎn)物。所述發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為麥麩5g，蛋白胨5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml， 或按照此比例配制而成的培養(yǎng)基，PH值為7. (Γ7. 2。本發(fā)明所述蘇云金芽孢桿菌GL-1，或上述生物肥，在分解難溶性磷中的應(yīng)用。本發(fā)明所述蘇云金芽孢桿菌GL-1，或上述生物肥，在增加土壤中微生物多樣性和微生物豐度中的應(yīng)用。本發(fā)明所述蘇云金芽孢桿菌GL-1，或上述生物肥，在防治香蕉枯萎病和/或番茄青枯病中的應(yīng)用。所述香蕉枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌(/^sari oxysporum).所述番茄青枯病的病原菌為青枯假單胞菌、Ralstonia Solanacearum)0與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，篩選出一株蘇云金芽孢桿菌(feciBM thuringiensis ) GL-1。此菌株在提高土壤中難溶磷的有效性和磷肥利用率的同時(shí)，還可以對(duì)香蕉枯萎病菌和番茄青枯病菌均有較好的拮抗效果。


圖1. GL-I菌革蘭氏染色顯微照片，菌體被染成深藍(lán)色； 圖2. GL-I菌芽孢染色顯微照片，其中藍(lán)色部分為芽孢；
圖3.不同菌株在難溶無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基下產(chǎn)水溶性磷濃度的對(duì)比圖； 圖4.不同菌株在難溶無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基下產(chǎn)微生物磷濃度的對(duì)比圖； 圖5. GL-I菌對(duì)番茄青枯病菌的拮抗效果圖，其中A為培養(yǎng)基平板上顯示的番茄青枯病病原菌，B為加入GL-I菌片后對(duì)番茄青枯病菌形成抑菌圈；
圖6. GL-I菌對(duì)香蕉枯萎病菌的拮抗效果圖，其中A為培養(yǎng)基平板上顯示的香蕉枯萎病病原菌，B為加入GL-I菌片后對(duì)香蕉枯萎病菌形成抑菌圈； 圖7. GL-I菌促進(jìn)玉米生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)照片；
圖8.不同處理土壤微生物群落代謝活性AWCD值變化的曲線圖，n=3，CK為未施菌土壤，B為GL-I菌株處理土壤。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中除特別說(shuō)明外，均為本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法和操作步驟。實(shí)施例1菌株的分離、純化 (1)分離
配制難溶無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基葡萄糖lO.Og，硫酸銨0.5g，氯化鈉0.3g，氯化鉀0.3g，七水硫酸亞鐵0. 03g，硫酸錳0. 03g,酵母膏0. 4g，磷酸鈣5g，蒸餾水IOOOml，PH 7. 0 7· 5。以廣西壯族自治區(qū)桂林市興安縣漠川鄉(xiāng)石灰?guī)r母質(zhì)發(fā)育的土壤為篩選土樣，采用平板涂布法準(zhǔn)確稱(chēng)取篩選土樣10. Og,放入裝有90ml無(wú)菌水的250ml三角瓶中(加玻璃珠)，搖床振蕩30min，使細(xì)胞充分分散，靜置2(T30s，取上清液進(jìn)行10倍遞減稀釋?zhuān)捎?0，105稀釋度，用移液槍分別移取稀釋液0. lmL，涂布在難溶無(wú)機(jī)磷平板上，28°C倒置培養(yǎng)7d，逐日觀察溶磷圈，記錄溶磷菌菌落(d)和溶磷圈直徑(D)。篩選出有解磷圈的細(xì)菌菌株編號(hào)為a-3, a-4, a~5, a~7, a~15, a~16, b_17和B，其中B的解磷效果最強(qiáng)，d/D值為5。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定和生理生化鑒定后，確定B菌株為蘇云金芽孢桿菌imcillus iAtfriZ^ieesis)，本發(fā)明中簡(jiǎn)稱(chēng)GL-I菌。(2)純化
營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏3. 0g，蛋白胨5. Og,氯化鈉5. Og,瓊脂18. Og,蒸餾水1000ml， pH值7. (Γ7. 2。將篩選出的GL-I菌利用平板劃線法純化后，保存于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上。實(shí)施例2特性鑒定 (1)菌體形態(tài)特性
革蘭氏陽(yáng)性菌，有芽孢。菌體為桿狀，有運(yùn)動(dòng)性，專(zhuān)性需氧。菌體革蘭氏染色顯微照片見(jiàn)圖1，芽孢染色照片見(jiàn)圖2。(2)菌落形態(tài)特性
在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后形成的菌落為圓形或不規(guī)則狀，4 后菌落全部為圓形，乳白色，直徑約為2 3mm，邊緣不整齊，扁平濕潤(rùn)。(3)生長(zhǎng)特性
在牛肉膏5g，蛋白胨5g，氯化鈉5g，水IL的液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速113 rpm，溫度30°C， 起始PH值為7. 0的條件下，培養(yǎng)18小時(shí)，測(cè)得活菌數(shù)為2. 91 士0. 60 X 108cfu/ml。(4)生理、生化特性
采用Biolog Ecoplate微平板培養(yǎng)方法，分析此菌株在好氧條件下對(duì)31種不同碳源的利用情況，結(jié)果見(jiàn)表1。表1 GL-I菌對(duì)31種不同碳源的利用情況
權(quán)利要求
1.蘇云金芽孢桿菌GL-I，保藏編號(hào)CGMCCNo. 4923，于2011年6月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述蘇云金芽孢桿菌GL-1，其特征在于其16SrDNA核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 所示。
3.權(quán)利要求1或2所述蘇云金芽孢桿菌GL-I的保藏方法，其特征在于保藏培養(yǎng)基的成分為牛肉膏3. Og,蛋白胨5. Og,氯化鈉5. Og,瓊脂18. Og,蒸餾水IOOOml，或按照此比例配制成的培養(yǎng)基，PH值為7. (Γ7.2。
4.一種生物肥，其特征在于含有權(quán)利要求1或2所述蘇云金芽孢桿菌GL-I或其發(fā)酵產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述生物肥，其特征在于所述發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為麥麩5g，蛋白胨5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml，或按照此比例配制而成的培養(yǎng)基，pH值為 7. 0 7· 2。
6.權(quán)利要求1或2所述蘇云金芽孢桿菌GL-I在分解難溶性磷中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1或2所述蘇云金芽孢桿菌GL-I在增加土壤微生物群落多樣性和增加微生物豐度中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2所述蘇云金芽孢桿菌GL-I在防治香蕉枯萎病和/或番茄青枯病中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述番茄青枯病是由青枯假單胞菌引起的。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了蘇云金芽孢桿菌GL-1及在土壤解磷防病方面的應(yīng)用。該菌株保藏編號(hào)為CGMCCNo.4923，于2011年6月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌GL-1能夠提高土壤中難溶磷的有效性和磷肥利用率，在減少磷肥施用的同時(shí)能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)。另外，該菌株對(duì)香蕉枯萎病和番茄青枯病的病原菌均具有很好的拮抗效果，可有效抑制病原菌尖孢鐮刀菌和青枯假單胞菌的生長(zhǎng)繁殖，作為生物農(nóng)藥加以利用。而且，該菌株還能夠增加土壤中微生物多樣性和增加微生物豐度。利用該菌株制備的生物肥，既可以防土傳病害又能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102321551SQ20111022402
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者孔德穎, 李永濤, 蔡燕飛, 藺中 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)