專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)byd病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)BYD病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
BYD病毒，以其分離地白洋淀(Bai Yang Dian)首字母命名，屬黃病毒屬成員，與Tembusu病毒親緣關(guān)系較近，該病毒感染鴨后可導(dǎo)致鴨產(chǎn)蛋下降綜合征(Duck Egg-DropSyndrome，DEDS)。該病于2010年首次發(fā)現(xiàn)，傳染性非常強(qiáng)。病鴨主要病癥為高熱、食欲廢絕、產(chǎn)蛋下降甚至停止，發(fā)病較重的鴨禽甚至喪失行動(dòng)能力，剖檢可見(jiàn)卵巢發(fā)生出血、萎縮、破裂等嚴(yán)重病變。我國(guó)沿海鴨禽養(yǎng)殖省區(qū)包括北京、安徽、河北、福建、廣東，廣西、江蘇、江西、山東、浙江均有流行，無(wú)論肉鴨還是蛋鴨均可被該病毒感染，死亡率為5 15%，給各地鴨禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
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該病尚無(wú)有效的檢測(cè)手段，血清學(xué)上與我國(guó)常見(jiàn)黃病毒如登革病毒、日本腦炎病毒等存在一定的血清學(xué)交叉反應(yīng)，目前僅有文獻(xiàn)報(bào)道采用普通逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)該病原。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)法具有在等溫條件下即可高速、快速、高特異、高靈敏的擴(kuò)增靶序列的特點(diǎn)。該方法利用特異引物在高活性鏈置換DNA聚合酶作用下，不斷大量復(fù)制擴(kuò)增核酸。核酸大量合成時(shí)，dNTP會(huì)析出大量的焦磷酸根離子，焦磷酸根離子與LAMP體系中的Mg2+(或Mn2+)結(jié)合，產(chǎn)生焦磷酸鎂或焦磷酸錳沉淀，從而引起反應(yīng)液的濁度變化，非常易于判斷。此外，利用一些熒光燃料，如SYBRgreen I染料或者鈣黃綠素指示LAMP反應(yīng)。SYBR green I染料可與雙鏈DNA產(chǎn)物結(jié)合，當(dāng)有產(chǎn)物大量擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系呈現(xiàn)顯著的熒光信號(hào)變化。鈣黃綠素在反應(yīng)初始時(shí)與Mn2+結(jié)合，反應(yīng)液顯示透明的橙色，當(dāng)有核酸產(chǎn)物大量合成時(shí)，會(huì)生成副產(chǎn)物焦磷酸根，使Mg2+游離出來(lái)，與鈣黃綠素結(jié)合，最終使反應(yīng)液顯示微濁的黃綠色。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)BYD病毒的專(zhuān)用引物。本發(fā)明提供的專(zhuān)用引物，包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。所述專(zhuān)用引物還包括引物5，所述引物5的核苷酸序列為序列表的序列5。所述專(zhuān)用引物由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5組成。所述BYD病毒具體為BYD病毒Bydl株。所述專(zhuān)用引物中，F(xiàn)3(引物1)、B3(引物2)、FIP(引物3)、BIP(引物4)和LB(弓I物5)還可進(jìn)行堿基的替換和/或取代，保持3’末端序列6個(gè)堿基100%的同源性即可。FIP和BIP中TTTT (下劃線者)為連接序列，其長(zhǎng)度一般為4個(gè)，數(shù)目可相應(yīng)縮短和延長(zhǎng)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種檢測(cè)BYD病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)試劑。本發(fā)明提供的試劑，包括RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、所述的專(zhuān)用引物。所述擴(kuò)增試劑還包括鈣黃綠素；所述擴(kuò)增試劑由RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、所述的專(zhuān)用引物和鈣黃綠素組成；所述的專(zhuān)用引物中的引物I和引物2在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為5pmol/L ;所述的專(zhuān)用引物中的引物3和引物4在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為40pmol/L ;所述的專(zhuān)用引物中的引物5在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為20pmol/·L ；所述的引物5可與莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動(dòng)鏈置換合成，提高擴(kuò)增效率。擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度DNA的混合物，其產(chǎn)量可達(dá)10 μ g以上，是普通PCR反應(yīng)DNA產(chǎn)率的至少50倍。所述RNA逆轉(zhuǎn)錄酶在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為O. 004U/ μ L ；所述RNA逆轉(zhuǎn)錄酶具體為AMV逆轉(zhuǎn)錄酶；所述Bst DNA聚合酶在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為O. 32U/ μ L ；所述鈣黃綠素在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為50 μ mol/L ；所述2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液按照如下方法制備將氯化鉀(KCl)、硫酸鎂(MgSO4)、硫酸銨((NH4)2SO4)、吐溫 20 (Tween-20)、甜菜堿(Betaine)、氯化錳(MnCl2)和dNTPs (脫氧核苷三磷酸混合物dATP、dCTP、dGTP和dTTP)溶于濃度為40mmol/L、PH值為
8.8的Tris鹽酸鹽緩沖液得到；在所述2 X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液中，所述氯化鉀的濃度為20mmol/L，所述硫酸鎂的濃度為16mmol/L，所述硫酸銨的濃度為20mmol/L，所述吐溫20的濃度為O. 2% (質(zhì)量百分含量)，所述甜菜堿的濃度為I. 6mol/L，所述氯化錳的濃度為lmmol/L，每種所述dNTP的濃度均為2. 8mmol/L0所述BYD病毒為BYD病毒Bydl株。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)BYD病毒的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑；所述BYD病毒具體為BYD病毒Bydl株。所述專(zhuān)用引物或所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或所述的試劑盒在鑒定和/或輔助鑒定BYD病毒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述BYD病毒具體為BYD病毒Bydl株。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種鑒定和/或輔助鑒定待測(cè)樣品中BYD病毒的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用所述專(zhuān)用引物或所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或所述的試劑盒中的所述專(zhuān)用引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增中，以待測(cè)樣品的RNA為模板；
所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為先60°C -65°C反應(yīng)30-60min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為先63°C反應(yīng)35min，然后75°C 2min終止反應(yīng)；所述待測(cè)樣本為鴨的肝；
本發(fā)明的檢測(cè)對(duì)象不局限于鴨的肝，還可涉及鴨的各種臟器，血液標(biāo)本，糞便標(biāo)本，以及密切接觸者(人)的相關(guān)樣本。所述BYD病毒為BYD病毒Bydl株。所述檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的方法為如下I)-4)中的至少一種I)觀察所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，若所述產(chǎn)物在自然光下為黃綠色，且在紫外光下有熒光(黃綠色熒光)，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有BYD病毒；若所述產(chǎn)物在自然光下為橙黃色，且在紫外光下無(wú)熒光，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有BYD病毒；2)用實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，若有特異擴(kuò)增曲線，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有BYD病毒；若無(wú)特異擴(kuò)增曲線，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有BYD病毒；3)電泳檢測(cè)所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，得到梯度樣條帶的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有BYD病毒；若環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物不為梯度樣條帶，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有BYD病毒；所述梯度樣條帶的大小為200bp_2000bp，所述梯度樣條帶的大小主要分布在200bp-2000bp 間；4)用Xho I酶切所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，電泳檢測(cè)所述酶切產(chǎn)物，若所述酶切產(chǎn)物為318bp產(chǎn)物和206bp產(chǎn)物，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有BYD病毒；若所述酶切產(chǎn)物不為318bp產(chǎn)物和206bp產(chǎn)物，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有BYD病毒。所述檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物采用肉眼觀察濁度變化、肉眼觀察熒光染料變化或?qū)崟r(shí)濁度儀檢測(cè)，具體如下I)肉眼觀察濁度若肉眼觀察濁度增大，則環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)為陽(yáng)性，表明樣本中含有或者候選含有BYD病毒；反之為陰性。具體為核酸大量合成時(shí)，dNTP會(huì)析出大量的焦磷酸根離子，焦磷酸根離子與LAMP體系中的Mg2+(或Mn2+)結(jié)合，產(chǎn)生焦磷酸鎂或焦磷酸錳沉淀，從而引起反應(yīng)液的濁度變化；基于該原理，可以直接肉眼觀測(cè)，根據(jù)反應(yīng)液的濁度變化判斷是否有特異性擴(kuò)增發(fā)生和特異核酸大量合成，從而判斷模板是否為靶序列。2)肉眼觀察熒光染料變化當(dāng)采用鈣黃綠素?zé)晒馊玖线M(jìn)行反應(yīng)時(shí)，若LAMP反應(yīng)產(chǎn)物在自然光下由開(kāi)始的橙色變?yōu)辄S綠色且在紫外光下顯熒光，則LAMP反應(yīng)陽(yáng)性，即表明待測(cè)樣本含有或候選含有BYD病毒。具體為應(yīng)用熒光染料顏色變化進(jìn)行判定時(shí)，可采用SYBR green I染料或鈣黃綠素。SYBR green I染料可與雙鏈DNA結(jié)合，但反應(yīng)中有大量產(chǎn)物產(chǎn)生時(shí)，反應(yīng)體系顏色變?yōu)辄S綠色。核酸大量合成時(shí)，會(huì)生成副產(chǎn)物焦磷酸根，焦磷酸根離子的存在，使得Mg2+游離出來(lái)，鈣黃綠素和Mg2+結(jié)合，反應(yīng)液呈現(xiàn)微濁的黃綠色?；谠撛恚梢愿鶕?jù)反應(yīng)液的顏色變化判斷是否有核酸大量合成，從而判斷模板是否為靶序列。也可根據(jù)反應(yīng)原理，選擇本領(lǐng)域其他熒光染料進(jìn)行LAMP反應(yīng)的判定。3)實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)采用實(shí)時(shí)濁度儀及其配套程序軟件實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)液的濁度變化，若實(shí)時(shí)濁度儀上觀察到典型的擴(kuò)增曲線，則LAMP反應(yīng)陽(yáng)性，即表明待測(cè)樣本含有或候選含有BYD病毒。還可以用如下方法進(jìn)行檢測(cè)4)電泳將LAMP反應(yīng)產(chǎn)物用Xho I酶切，得到酶切產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物；若LAMP反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)梯狀帶型(范圍約在200bp至2000bp之間)，且酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)雙條帶的帶型(318bp和206bp)，則LAMP反應(yīng)陽(yáng)性，即表明待測(cè)樣本含有或候選含 有BYD病毒。5)當(dāng)采用SYBR green I染料時(shí)，可通過(guò)實(shí)時(shí)PCR儀及其配套程序軟件實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)液的熒光進(jìn)行判定，當(dāng)檢測(cè)到熒光信號(hào)時(shí)，表明LAMP反應(yīng)為陽(yáng)性。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的專(zhuān)用引物和方法，用于對(duì)BYD病毒進(jìn)行特異性檢測(cè)和定量分析，其優(yōu)點(diǎn)如下(I)只需在恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊設(shè)備；(2)特異性高；(3)快速高效，擴(kuò)增反應(yīng)在35分鐘內(nèi)即可完成；(4)靈敏度高；(5)鑒定方便簡(jiǎn)單。基于上述優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明特別適用于基層單位開(kāi)展鴨禽疫情的快速檢測(cè)，適宜基層進(jìn)行BYD病毒的排查，及時(shí)開(kāi)展的動(dòng)物衛(wèi)生防控工作。


圖I為在自然光㈧和紫外燈⑶下各個(gè)樣本的顏色比較結(jié)果圖2為電泳結(jié)果圖3為實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線
圖4為L(zhǎng)AMP特異性檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果圖5為鴨組織樣本的LAMP擴(kuò)增結(jié)果(自然光和紫外光下)圖6為鴨組織樣本的LAMP實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線圖7為鴨組織樣本的普通RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。所用無(wú)機(jī)化學(xué)試劑和有機(jī)試劑均符合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。引物由上海英駿技術(shù)公司合成。AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Avian Myeloblastosis VirusReverse Transcriptase):普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司(Promega), cat. No. M5101。脫氧核苷三磷酸混合物(dNTPs):普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司(Promega)，cat.No. U1515。Bst DNA 聚合酶:NEB (北京)有限公司，cat. No. M0275。RNA 提取試劑盒=RNeasyMini Kit, QIAgen 公司產(chǎn)品，Cat No. 74014。RNA 酶抑制劑(Ribonuclease inhibitor):大連寶生物(TAKARA)公司產(chǎn)品，cat. No. D2310。Tris 鹽酸鹽(Tris-HCl)pH8. 8 :Sigma 公司，cat. No. T9443。氯化鉀(KCl) :Sigma 公司，cat. No. P9514。硫酸鎂(MgSO4) :Sigma 公司，cat. No. M3409、硫酸銨((NH4) 2S04) :Sigma 公司，cat. No. A4418。吐溫 20 (Tween-20) Sigma公司，cat. No. P9416。舌甘菜喊(Betaine) Sigma 公司，cat. No. B0300。氯化猛(MnCl2) Sigma公司，cat.No.M3634。鈣黃綠素:Sigma公司，cat. No. 17783。LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀，日本榮研公司。下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。BYD病毒Bydl 株記載在 SuJ, LiS, HuX, YuX, WangY, et al. Duck Egg-Drop SyndromeCaused by BYD Virus,a New Tembusu-Related Flavivirus. PLoSONE. 2011. 6(3) el8106,公眾可從中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所保證可在符合國(guó)家和軍隊(duì)有關(guān)生物安全管理規(guī)定且經(jīng)相關(guān)部門(mén)批準(zhǔn)后向有資質(zhì)從事第二類(lèi)病毒病原體以上的單位提供；其核酸數(shù)據(jù)庫(kù)登陸號(hào)(Genbank Accession No)為 JF312912。實(shí)施例I、LAMP反應(yīng)鑒定BYD病毒
一、專(zhuān)用弓丨物的設(shè)計(jì)以及各個(gè)專(zhuān)用引物的制備根據(jù)BYD病毒基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物序列如下，人工合成F3 (序列 I，引物 I) TGTGGACAAGGCATGTTTGTB3 (序列 2，引物 2) :AGTCAAGTCAATGGCGTTGTFIP (序列 3，引物 3) GGCAAGTCTCCTTGGTGTGGATTTTCGATGTTGAGGCTTGGAAGGBIP (序列 4，引物 4) TACGATCAGTCAGCAGGCTCGATTTTTCCAAGATCGCGTTCAACTCLB (序列 5，引物 5) GCACAACATGTGGGTAAGCA二、病毒樣本的制備I、病毒樣本的制備BYD病毒Bydl株的病毒液，通過(guò)蝕斑試驗(yàn)計(jì)算病毒滴度(PFU/ml)。使用DMEM培養(yǎng)基將病毒液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)玫?種不同濃度的病毒液(濃度分別為1000PFU/ml、100PFU/ml、10PFU/ml、lPFU/ml、0. lPFU/ml、0. 01PFU/ml、0. OOlPFU/ml 和 0. OOOlPFU/ml)。2、病毒基因組RNA的提取(采用RNA提取試劑盒)將210 μ I病毒液樣本加入I. 5ml離心管中，補(bǔ)加700 μ I裂解緩沖液(RLTbuffer)和7 μ I β -巰基乙醇，振蕩混勻后加入490 μ I無(wú)水乙醇，劇烈振蕩后分兩次加至硅膠柱中，進(jìn)行硅膠柱過(guò)濾。硅膠柱過(guò)濾將加樣后的硅膠柱10，OOOg離心15s ;加700 μ I μ IRWl緩沖液，10，OOOg離心15s ;用RPE緩沖液離心洗硅膠柱兩次(每次500 μ I);將硅膠柱轉(zhuǎn)至新的離心管中，10，OOOg離心2min ;將硅膠柱轉(zhuǎn)至新的離心管中，加入50 μ I無(wú)核酸酶水，室溫靜置2min，然后10，OOOg離心2min，收集洗脫液；在洗脫液中加入I μ I RNA酶抑制劑，-80°C保存，即為待測(cè)RNA。將得到的8種病毒RNA作為八個(gè)樣本，用于下述檢測(cè)。樣本I :自濃度為1000PFU/ml的Bydl病毒液提取的RNA。樣本2 自濃度為100PFU/ml的Bydl病毒液提取的RNA。樣本3 自濃度為10PFU/ml的Bydl病毒液提取的RNA。樣本4 自濃度為lPFU/ml的Bydl病毒液提取的RNA。樣本5 自濃度為0. lPFU/ml的Bydl病毒液提取的RNA。樣本6 自濃度為0. 01PFU/ml的Bydl病毒液提取的RNA。
樣本7 自濃度為O. 001PFU/ml的Bydl病毒液提取的RNA。樣本8 自濃度為O. 0001PFU/ml的Bydl病毒液提取的RNA。三、專(zhuān)用引物應(yīng)用于BYD病毒的檢測(cè)(肉眼觀測(cè))用步驟一得到的專(zhuān)用引物檢測(cè)步驟二得到的待測(cè)RNA樣品，分別在8個(gè)0. 2mLPCR反應(yīng)管中進(jìn)行LAMP反應(yīng)。每管中的LAMP反應(yīng)體系25 μ I F3和B3的濃度均為5pmol/L，BIP和FIP的濃度均為 40pmol/L，LB 的濃度為 20pmol/L，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0. 004U/ μ L, Bst DNA 聚合酶 0. 32U/μ L，鈣黃綠素50 μ mol/L, 12. 5ul的2 X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩 沖液，2. 5 μ I待測(cè)RNA，無(wú)核酸酶和脫氧核酶的去離子水補(bǔ)足25 μ I ;以上濃度均為體系中的終濃度。2 X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液按照如下方法制備將氯化鉀(KCl)、硫酸鎂(MgSO4)、硫酸銨((NH4) 2S04)、吐溫20 (Tween-20)、甜菜堿(Betaine)、氯化錳(MnCl2)和脫氧核苷三磷酸混合物(dNTPs :dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP)溶于濃度為 40mmol/L、PH 值為 8. 8 的 Tris鹽酸鹽緩沖液得到；在所述2 X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液中，所述氯化鉀的濃度為20mmol/L，所述硫酸鎂的濃度為16mmol/L，所述硫酸銨的濃度為20mmol/L，所述吐溫20的濃度為0. 2% (質(zhì)量百分含量)，所述甜菜堿的濃度為1.6mol/L，所述氯化錳的濃度為lmmol/L，每種所述脫氧核苷三磷酸的濃度均為2. 8mmol/LoLAMP反應(yīng)體系在63°C反應(yīng)35min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。終止反應(yīng)后，采用肉眼觀察或紫外燈下觀察自然光下PCR反應(yīng)管的照片見(jiàn)圖1A，I至8依次為樣本I至樣本8，陽(yáng)性為黃綠色，陰性為橙黃色；可以看出，管I至管6 (即樣品I至樣品6)為陽(yáng)性(黃綠色)，管7至管8(即樣品7至樣品8)為陰性(橙黃色)。終止反應(yīng)后紫外燈照射下試管的照片見(jiàn)圖1B，I至8依次為樣本I至樣本8，陽(yáng)性為有黃綠色熒光，陰性無(wú)熒光；可以看出，管I至管6 (即樣品I至樣品6)為陽(yáng)性(有黃綠色熒光)，管7至管8(即樣品7至樣品8)為陰性(無(wú)熒光)。說(shuō)明，檢測(cè)方法的靈敏度為0.01 PFU/ml。四、專(zhuān)用引物應(yīng)用于BYD病毒的檢測(cè)(瓊脂糖電泳觀察)用步驟一得到的專(zhuān)業(yè)引物檢測(cè)步驟二得到的樣品I和樣品8待測(cè)RNA。LAMP反應(yīng)體系中可不加入鈣黃綠素，其它同步驟三的LAMP反應(yīng)體系。LAMP反應(yīng)體系在63°C反應(yīng)35min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。終止反應(yīng)后，取產(chǎn)物5μ I以Xho I限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切。取LAMP反應(yīng)產(chǎn)物
0.5μ I和酶切產(chǎn)物5μ I進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為2. 5%，電泳緩沖液為IXTris-硼酸(TBE)緩沖液，100V電泳40分鐘，紫外光源下觀察電泳結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)圖2，泳道I和泳道2分別為樣品I的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物及其酶切產(chǎn)物，為陽(yáng)性，LAMP產(chǎn)物可見(jiàn)典型梯度樣的條帶帶型(200bp-2000bp),經(jīng)酶切后僅可見(jiàn)2條條帶(318bp和206bp);泳道3和4分別為樣品8的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物及其酶切產(chǎn)物，為陰性，無(wú)典型梯度樣帶型。五、用專(zhuān)用引物檢測(cè)BYD病毒(實(shí)時(shí)濁度儀)LAMP反應(yīng)體系同步驟三的LAMP反應(yīng)體系。將LAMP反應(yīng)體系置于LA320C實(shí)時(shí)濁度儀，63°C反應(yīng)35min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。反應(yīng)體系中可不加入鈣黃綠素。實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖3，1至8依次為樣本I至樣本8，可以看出，樣本I至樣本6為陽(yáng)性(有明顯的S曲線)，樣本7至樣本8為陰性。以實(shí)時(shí)濁度儀結(jié)果判讀的靈敏度為O. 01PFU/ml。六、LAMP反應(yīng)特異性檢測(cè)用步驟一得到的專(zhuān)用引物檢測(cè)步驟二得到的樣本I (BYD病毒Bydl株)，以黃熱病毒17D株、登革病毒2型43株、日本腦炎病毒(或稱(chēng)流行性乙型腦炎病毒)SA14-14-2株、西尼羅病毒Chin-Ol株、蜱傳腦炎病毒(或稱(chēng)森林腦炎病毒)Senzhang株為對(duì)照，分別在6個(gè)試管中進(jìn)行LAMP反應(yīng)(編號(hào)為1-6分別對(duì)應(yīng)步驟二得到的樣本I、黃熱病毒17D株、登革病毒2型43株、日本腦炎病毒SA14-14-2株、西尼羅病毒Chin-Ol株、牌傳腦炎病毒Senzhang 株)。黃熱病毒17D 株記載在 Co MD, Kilpatrick ED, Rothman AL. Dynamics ofthe CD8T_cell response following yellow fever virus 17D immunization.Immunology. 2009. 128 (ISuppl) :e718_27 ;核酸數(shù)據(jù)庫(kù)登陸號(hào) X03700。登革病毒2型43株記載在魏雁，姜濤，李曉峰，等?；诘歉?型病毒PrM基因的新型脫氧核酶對(duì)病毒RNA降解作用的初步觀察.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊.2007. 31 (I) =16-19,23 ;核酸數(shù)據(jù)庫(kù)登陸號(hào)AF204178。日本腦炎病毒SA14-14-2株記載在李玉華，李海玲，吳永林，等。流行性乙型腦炎病毒活疫苗株SA14-14-2基因穩(wěn)定性研究。中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志。2003.23(11):858-861 ;核酸數(shù)據(jù)庫(kù)登陸號(hào)AF315119。西尼羅病毒Chin-Ol株姜濤，鄧永強(qiáng)，范寶昌，等。西尼羅病毒Chin-Ol株基因組編碼區(qū)序列測(cè)定及分析。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊。2003.27(6) :401-403 ;核酸數(shù)據(jù)庫(kù)登陸號(hào)AY490240。蜱傳腦炎病毒Senzhang株記載在馬新英，司炳銀，高軒，等。我國(guó)森林腦炎病毒森張株編碼區(qū)序列測(cè)定。中國(guó)病毒學(xué)。2003.18(4) :322-325 ;核酸數(shù)據(jù)庫(kù)登陸號(hào)AY182009。上述病毒公眾均可從中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所保證，可在符合國(guó)家和軍隊(duì)有關(guān)生物安全管理規(guī)定且經(jīng)相關(guān)部門(mén)批準(zhǔn)后向有資質(zhì)從事第二類(lèi)病毒病原體以上的單位提供。上述病毒均屬黃病毒屬，與BYD病毒為同科屬成員。采用步驟五的方法檢測(cè)，在實(shí)時(shí)濁度儀上的結(jié)果見(jiàn)圖4，只有樣本I (BYD病毒Bydl株)有特異擴(kuò)增曲線，而其他病毒株均無(wú)明顯擴(kuò)增曲線為陰性，表明本發(fā)明所述引物有良好的特異性。實(shí)施例2、臨床樣本檢測(cè)采用由實(shí)施例I步驟一獲得的專(zhuān)用引物分別對(duì)采集自河北白洋淀地區(qū)不同鴨禽養(yǎng)殖場(chǎng)病鴨肝組織樣本(編號(hào)為1-22)進(jìn)行檢測(cè)。分別將離體的病鴨肝組織樣本充分研磨后，用Iml DMEM培養(yǎng)基重懸，5000g離心10分鐘，取上清210 μ I，提取上清液的RNA (提取方法同實(shí)施例I的步驟二)，環(huán)等溫?cái)U(kuò)增方法同實(shí)施例I的步驟三，以實(shí)施例I步驟二的樣本2為陽(yáng)性對(duì)照(+)，以樣本8為陰性對(duì)照(-)
檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5，#1至#22為鴨肝樣本I至樣本22，“ + ”為陽(yáng)性對(duì)照，為陰性對(duì)照。a，c和e為自然光下LAMP產(chǎn)物，b，d和f為紫外光下LAMP產(chǎn)物。可以看出，#1，#2，#4, #5, #6, #7, #8, #9, #13, #14，#16, #17, #19, #20, #21 和 #22 為陽(yáng)性，自然光下 LAMP 產(chǎn)物為黃綠色，紫外光源下為有熒光為亮黃色；而#3，#10，#11，#12, #15，#18，為陰性，自然光下LAMP產(chǎn)物為橙黃色，與反應(yīng)前相同，紫外光源下無(wú)熒光。同時(shí)實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖6，有明顯曲線變化的為陽(yáng)性，結(jié)果與上述一致，#1, #2, #4, #5, #6, #7, #8, #9, #13, #14，#16, #17, #19, #20, #21 和 #22 為陽(yáng)性。米用文獻(xiàn)(SuJ,LiS, HuX, YuX, WangY, et al. Duck Egg-Drop Syndrome Causedby BYD Virus, a New Tembusu-Related Flavivirus. PLoSONE. 2011. 6 (3) el8106)的普通RT-PCR方法(BYD病毒Bydl株的特異引物對(duì)上游引物5’ -GCCACGGAATTAGCGGTTGT-3’ ；下游引物5’ -TAATCCTCCATCTCAGCGGTGTAG-3’ ；退火溫度為55°C )進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7，得至IJ 400bp左右的特異擴(kuò)增條帶的為陽(yáng)性，可以看出，#1，#2，#5，#6，#7，#8, #9, #13，#14, #16，#17，#19，#20，#21和#22為陽(yáng)性，#4為弱陽(yáng)性，存在400bp左右的特異擴(kuò)增條帶；·而#3, #10，#11, #12，#15，#18，為陰性，無(wú)特異擴(kuò)增產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)BYD病毒的專(zhuān)用引物，包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.如權(quán)利要求I所述的專(zhuān)用引物，其特征在于所述專(zhuān)用引物還包括引物5，所述引物5的核苷酸序列為序列表的序列5。
3.如權(quán)利要求I或2所述的專(zhuān)用引物，其特征在于所述專(zhuān)用引物由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5組成； 所述BYD病毒具體為BYD病毒Bydl株。
4.一種檢測(cè)BYD病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，包括RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶、2 X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、權(quán)利要求1-3所述的專(zhuān)用引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，其特征在于 所述擴(kuò)增試劑還包括鈣黃綠素； 所述擴(kuò)增試劑由RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、權(quán)利要求1-3所述的專(zhuān)用引物和鈣黃綠素組成； 所述的專(zhuān)用引物中的引物I和引物2在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為5pmol/L ;所述的專(zhuān)用引物中的引物3和引物4在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為40pmo I/L ;所述的專(zhuān)用引物中的引物5在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為20pmol/L ； 所述RNA逆轉(zhuǎn)錄酶在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為O. 004U/y L ； 所述RNA逆轉(zhuǎn)錄酶具體為AMV逆轉(zhuǎn)錄酶； 所述Bst DNA聚合酶在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為O. 32U/ μ L ； 所述鈣黃綠素在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為50 μ mol/L ； 所述2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液按照如下方法制備將氯化鉀、硫酸鎂、硫酸銨、吐溫20、甜菜堿、氯化錳和dNTPs溶于濃度為40mmol/L、PH值為8. 8的Tris鹽酸鹽緩沖液得到；在所述2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液中，所述氯化鉀的濃度為20mmol/L，所述硫酸鎂的濃度為16mmol/L，所述硫酸銨的濃度為20mmol/L，所述吐溫20的濃度為O. 2% (質(zhì)量百分含量)，所述甜菜堿的濃度為I. 6mol/L，所述氯化錳的濃度為lmmol/L，每種所述dNTP的濃度均為 2. 8mmol/L0 所述BYD病毒為BYD病毒Bydl株。
6.一種檢測(cè)BYD病毒的試劑盒，包括權(quán)利要求4或5所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑； 所述BYD病毒具體為BYD病毒Bydl株。
7.權(quán)利要求1-3中任一所述專(zhuān)用引物或權(quán)利要求4或5所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或權(quán)利要求6所述的試劑盒在鑒定和/或輔助鑒定BYD病毒中的應(yīng)用； 所述BYD病毒具體為BYD病毒Bydl株。
8.一種鑒定和/或輔助鑒定待測(cè)樣品中BYD病毒的方法，包括如下步驟 用權(quán)利要求1-3中任一所述專(zhuān)用引物或權(quán)利要求4或5所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或權(quán)利要求6所述的試劑盒中的所述專(zhuān)用引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物； 所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增中，以待測(cè)樣品的RNA為模板； 所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為先60°C -65°C反應(yīng)30-60min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于 所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為先63°C反應(yīng)35min，然后75°C 2min終止反應(yīng)； 所述待測(cè)樣本為鴨的肝； 所述BYD病毒為BYD病毒Bydl株。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于 所述檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的方法為如下I)-4)中的至少一種 1)觀察所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，若所述產(chǎn)物在自然光下為黃綠色，且在紫外光下有熒光，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有BYD病毒；若所述產(chǎn)物在自然光下為橙黃色，且在紫外光下無(wú)熒光，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有BYD病毒； 2)用實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，若有特異擴(kuò)增曲線，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有BYD病毒；若無(wú)特異擴(kuò)增曲線，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有BYD病毒； 3)電泳檢測(cè)所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，得到梯度樣條帶的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有BYD病毒；若環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物不為梯度樣條帶，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有BYD病毒； 所述梯度樣條帶的大小為200bp-2000bp ； 4)用XhoI酶切所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，電泳檢測(cè)所述酶切產(chǎn)物，若所述酶切產(chǎn)物為318bp產(chǎn)物和206bp產(chǎn)物，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有BYD病毒；若所述酶切產(chǎn)物不為318bp產(chǎn)物和206bp產(chǎn)物，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有BYD病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)BYD病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的專(zhuān)用引物，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。本發(fā)明的專(zhuān)用引物適用于對(duì)BYD病毒進(jìn)行特異性檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)只需在恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊設(shè)備；(2)特異性高；(3)快速高效，擴(kuò)增反應(yīng)在35分鐘內(nèi)即可完成；(4)靈敏度高；(5)鑒定方便簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102952891SQ20111024120
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月22日
發(fā)明者秦成峰, 姜濤, 劉娟, 鄧永強(qiáng), 秦鄂德 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所