專利名稱：一種利用橋式鏈接結(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種利用橋式鏈接結(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)作為分子生物學(xué)里程碑式的技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各個學(xué)科。與此同時，由于新的目的與要求，這項(xiàng)傳統(tǒng)的技術(shù)也在日新月異的發(fā)展之中。在高通量測序技術(shù)領(lǐng)域，已經(jīng)出現(xiàn)了乳液PCR(emulsion PCR, ePCR)技術(shù)，通過各自獨(dú)立的乳濁液擴(kuò)增反應(yīng)空間，能夠在大規(guī)模擴(kuò)增基因的同時，保持?jǐn)U增產(chǎn)物的各自分離。 該技術(shù)的要點(diǎn)包含(1)將帶有雙生物素標(biāo)記的一端引物與固相載體(微球、玻片表面)連接；(2)按照一定的油相與水相比例制備乳濁液反應(yīng)體系；(3)設(shè)定PCR程序，進(jìn)行ePCR，實(shí)現(xiàn)單分子大規(guī)模擴(kuò)增；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物的釋放與富集；( 基因測序檢測擴(kuò)增產(chǎn)物信號。此項(xiàng)技術(shù)雖然已經(jīng)滿足一定量的大規(guī)?；驍U(kuò)增，但是對于目前快速發(fā)展的測序需求，依然存在擴(kuò)增測序片段偏短的問題，限制了測序效率的提高。此外，擴(kuò)增產(chǎn)物仍需要進(jìn)一步的富集操作，擴(kuò)增效率較低，同時也使操作變得更加繁瑣，生產(chǎn)成本過高。針對上述缺陷，急需一種更加高效的擴(kuò)增方法來提高擴(kuò)增測序片段的長度，同時不需再通過另外的富集手段就能得到足夠的檢測信號，簡化操作，降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種在微乳液中利用微珠表面形成橋式鏈接結(jié)構(gòu)來對單分子片段進(jìn)行基因擴(kuò)增大量富集的技術(shù)方法，旨在解決擴(kuò)增測序片段偏短的問題，同時可以簡化操作，降低生產(chǎn)成本。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述利用橋式鏈接結(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法步驟包括A.將上、下游兩端引物分別與微珠進(jìn)行結(jié)合固定，得到帶引物的微珠；B.利用帶引物的微珠制備乳濁液反應(yīng)體系；C.利用乳濁液反應(yīng)體系進(jìn)行橋式ePCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；D.擴(kuò)增產(chǎn)物的釋放與回收，得到擴(kuò)增的單分子片段庫。其中，所述步驟A包括Al.設(shè)計(jì)與擴(kuò)增模板匹配并帶有加長堿基序列的上、下游兩端引物；A2.上、下游兩端引物與微珠表面分別進(jìn)行修飾，得到修飾后的引物與微珠；A3.將修飾后的引物結(jié)合固定于修飾后的微珠表面，得到帶引物的微珠。進(jìn)一步的，上述步驟A或Al中的引物可以采用通用引物或是與模板特異性互補(bǔ)的基因片段。上述微珠表面采用聚丙烯酰胺修飾、羧基修飾、醛基修飾和鏈霉親和生物素修飾，而引物相應(yīng)的修飾則采用丙烯酰胺修飾、氨基修飾或生物素修飾。其中，步驟B包括Bl制備包含帶引物的微珠在內(nèi)的水相體系；B2制備包含多種油脂混合在內(nèi)的油相體系；B3將水相體系和油相體系混合制備乳濁液反應(yīng)體系。其中，步驟Bl和B2之間無先后順序。其中，上述Bl步驟中的水相體系除包含帶引物的微珠和PCR反應(yīng)所必須的試劑外，還加入一堆能加速反應(yīng)啟動的小引物。其中，上述步驟B2中油相體系由符合熱穩(wěn)定性以及密度要求的多種油脂混合而成。其中，上述步驟B3中制備乳濁液反應(yīng)體系時，還加入輔助微固體材料。進(jìn)一步的，上述輔助微固體材料包括但不限于鋼珠、玻璃珠或塑料珠。其中，上述步驟B3中制備乳濁液體系，根據(jù)反應(yīng)擴(kuò)增模板的大小，通過控制水、油兩相的混合比例以及振蕩條件來控制乳濁液中液滴的尺寸大小。其中，水相體系、油相體系及輔助微固體材料三者的混合順序可以調(diào)整，采取不同的方式。進(jìn)一步的，乳濁液制備儀制備乳液的條件為震動頻率13HZ，13s。其中，步驟C中橋式ePCR擴(kuò)增，包括預(yù)變性，變性，退火，延伸，再變性，退火，延伸幾個步驟，反應(yīng)過程中之前擴(kuò)增延伸得到的子鏈與母鏈分離，兩條子鏈通過互補(bǔ)配對作用形成橋式鏈接結(jié)構(gòu)。其中，步驟D包括Dl.擴(kuò)增產(chǎn)物加入異丙醇進(jìn)行震蕩破乳，得到釋放產(chǎn)物；D2.釋放產(chǎn)物之后采用提取緩沖液進(jìn)行清洗，離心分離得到分離產(chǎn)物；D3.分離產(chǎn)物經(jīng)TE重復(fù)清洗，得到擴(kuò)增的單分子片段庫。其中，TE為IOmM Tris-HCl中加入ImM EDTA，然后調(diào)節(jié)pH = 8.0配制而成的清洗
緩沖液。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了一種利用橋式鏈接結(jié)構(gòu)擴(kuò)增出來的單分子片段庫進(jìn)行基因測序的方法，該方法還包括步驟E 通過基因測序的方法對單分子片段庫進(jìn)行序列信號檢測并推算其擴(kuò)增效率。其中，在所述步驟E之前還包含對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切處理。其中，步驟E所述基因測序方法是指利用堿基序列互補(bǔ)原則測定片段的堿基，包括但不限于合成測序法和連接測序法。由上可知，本發(fā)明通過在橋式ePCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后形成的橋式鏈接結(jié)構(gòu)，使擴(kuò)增產(chǎn)物更加穩(wěn)定而且均一，其長度均等于模板DNA與引物長度之和，達(dá)到了提高擴(kuò)增效率而使得擴(kuò)增長度增加。同時，通過異丙醇進(jìn)行釋放，簡化了操作過程。而由于擴(kuò)增效率的提高，可以不必加入過多的微珠，而且釋放之后不需再進(jìn)行富集，既降低了生產(chǎn)成本，也進(jìn)一步簡化了操作。


圖1是本發(fā)明一個實(shí)施例中利用橋式鏈接結(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法流程圖。
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圖2是本發(fā)明中制備乳濁液反應(yīng)體系的方法流程圖。圖3是本發(fā)明中擴(kuò)增產(chǎn)物釋放回收的方法流程圖。圖4是本發(fā)明一個實(shí)施例中基于橋式鏈接結(jié)構(gòu)進(jìn)行基因擴(kuò)增并用于測序的方法流程圖。圖5是本發(fā)明一個實(shí)施例中基于橋式鏈接結(jié)構(gòu)進(jìn)行基因擴(kuò)增并用于測序的方法示意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是本發(fā)明一個實(shí)施例中利用橋式鏈接結(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法流程。該方法包括在所有步驟開始之前，將要結(jié)合的引物進(jìn)行生物素化修飾。上、下游引物優(yōu)選與模板DNA特異性結(jié)合的引物，同時優(yōu)先處理成粘性末端。但不限于以上優(yōu)選方案，通用引物以及平末端也可使用。在步驟SlOl中，生物素化的上、下游兩端引物經(jīng)鏈霉親和作用分別與微珠進(jìn)行連接，大量固定在微珠表面，得到帶引物的微珠。在步驟S102中，利用帶引物的微珠制備一定的乳濁液反應(yīng)體系。關(guān)于步驟S102 的具體過程，將在圖2中詳細(xì)闡述。在步驟S103中，利用乳濁液反應(yīng)體系進(jìn)行橋式ePCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。在反應(yīng)的最后階段，擴(kuò)增出來的子鏈通過互補(bǔ)配對形成橋式結(jié)構(gòu)，能夠使得擴(kuò)增產(chǎn)物的長度更加均一穩(wěn)定，其長度均等于上、下游兩端引物與加入的模板DNA的長度之和。在步驟S104中，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行破乳釋放回收，得到擴(kuò)增的單分子片段庫。關(guān)于 S104步驟的具體過程，將在圖3中詳細(xì)闡述。圖2給出了圖1中步驟S 102利用修飾后的微珠制備一定的乳濁液反應(yīng)體系的方法流程。其中包括在步驟S1021中，制備包含帶引物的微珠在內(nèi)的水相體系。制備如下水相體系 (I)IOXPCR buffer，15yL ；⑵dNTP，3yL ;(3)DNA 模板，2yL ；⑷引物結(jié)合后的微珠， 5 μ L ； (5) Taq 酶，9 μ L ； (6) Mg2+，3 μ L ； (7) ddH20，114 μ L ； (8)在水相體系中優(yōu)選加入能夠加速反應(yīng)啟動速度的一對小引物，上、下游兩端各0. 75 μ L0在步驟S1022中，制備包含多種油脂混合的油相體系。選擇制備油相體系的各種油在熱穩(wěn)定性以及密度上具有一定的要求，它們按照一定比例混合之后要使得形成的油相體系的熱穩(wěn)定性可以保證制備出來的乳濁液擴(kuò)增體系在反應(yīng)過程中不會破裂，而且它們的混合密度要能使放入的輔助材料如鋼珠等可以懸浮于乳濁液擴(kuò)增體系中。在步驟S1023中，制備乳濁液反應(yīng)體系。輔助材料優(yōu)選鋼珠，水相體系注入到油相體系，放置于乳濁液制備儀上震蕩混勻。其中，制備乳濁液反應(yīng)體系的條件為乳濁液制備儀的震蕩頻率13ΗΖ，時間為13s。圖3給出了圖1中步驟S 104擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行破乳釋放回收得到單分子片段庫的方法流程。具體包括
步驟S1041中，擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量異丙醇，螺旋震蕩混勻后4000rpm，;3min離心分離去上清，擴(kuò)增產(chǎn)物以磁鐵吸附。步驟S1042中，擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量的抽提緩沖液(Extraction buffer)，螺旋振蕩混勻后4000rpm離心^iin分層，用磁鐵吸附磁珠，將液體清除；重復(fù)此操作數(shù)次。步驟S1043中，加入適量TE，重復(fù)清洗數(shù)遍擴(kuò)增產(chǎn)物，最后以適量的TE重懸磁珠。圖4是本發(fā)明一個實(shí)施例中基于橋式鏈接結(jié)構(gòu)進(jìn)行單分子片段擴(kuò)增處理的方法， 該實(shí)施例是在一個具體的應(yīng)用場景中，基于單分子片段擴(kuò)增之后進(jìn)行基因測序。在所有步驟之前，對引物先進(jìn)行生物素化修飾。步驟S201中，將生物素化后的上、下游引物經(jīng)過鏈霉親和作用分別結(jié)合固定于微珠表面，得到帶引物的微珠。步驟S202中，利用帶引物的微珠制備乳濁液反應(yīng)體系。關(guān)于步驟S102的具體過程，與上述圖2所述內(nèi)容一致。步驟S203中，利用乳濁液反應(yīng)體系進(jìn)行橋式ePCR擴(kuò)增反應(yīng)。本實(shí)施例中橋式ePCR 反應(yīng)程序?yàn)?40C 2min, 90°C 15s, 56°C 2min, 72°C 45s，然后進(jìn)行 100 個循環(huán)數(shù)；90°C 15s，61°C 5min，循環(huán)數(shù)為 20 ；72°C，5min ;10°C 保溫。步驟S204中，擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行破乳釋放與回收，得到單分子片段庫。關(guān)于步驟 S204的具體過程，與上述圖3中所述內(nèi)容一致。步驟S205中，通過基因測序的方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物信號。在本發(fā)明中，在采用測序方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的信號時，可以選擇不同的測序方法。具體方法的選擇，可以根據(jù)實(shí)際條件，選擇采用連接測序法或者是合成測序法。在本實(shí)施例中采用連接測序法，具體測序過程可參照現(xiàn)有技術(shù)，在此不再贅述。圖5是本發(fā)明一個實(shí)施例中基于橋式鏈接結(jié)構(gòu)進(jìn)行單分子片段擴(kuò)增處理的方法示意圖。該圖直觀的展現(xiàn)了基于橋式鏈接結(jié)構(gòu)進(jìn)行單分子片段擴(kuò)增后進(jìn)行基因測序檢測信號的過程1、生物素化的上下游引物鏈霉親和作用結(jié)合固定到微珠表面，得到帶引物的微珠。2、利用帶引物的微珠先制備如同圖2中步驟S1021的水相體系，然后再利用四種油混合制備如圖2中步驟S1022的油相體系，將兩者混合，加入輔助微固體材料如鋼珠、玻璃珠、塑料珠等，然后通過乳濁液制備儀震蕩混勻，制備成乳濁液反應(yīng)體系。3、通過設(shè)定如圖4中步驟S103的PCR反應(yīng)程序進(jìn)行橋式ePCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到橋式擴(kuò)增產(chǎn)物。4、利用異丙醇和抽提緩沖液以及離心分離的方法對擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行釋放與回收。5、通過連接測序或者是合成測序法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物信號。應(yīng)當(dāng)說明的是，本發(fā)明一種利用橋式鏈接結(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法典型的應(yīng)用于擴(kuò)增，但不限于擴(kuò)增，任何其他類似的應(yīng)用均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種利用橋式鏈接結(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A.將上、下游兩端引物分別與微珠進(jìn)行結(jié)合固定，得到帶引物的微珠；B.利用帶引物的微珠制備乳濁液反應(yīng)體系；C.利用乳濁液反應(yīng)體系進(jìn)行橋式ePCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；D.擴(kuò)增產(chǎn)物的釋放與回收，得到擴(kuò)增的單分子片段庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用橋式鏈接結(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法，其特征在于，步驟A包括Al.設(shè)計(jì)與擴(kuò)增模板匹配并帶有加長堿基序列的上、下游兩端引物；A2.上、下游兩端引物與微珠表面分別進(jìn)行修飾，得到修飾后的引物與微珠；A3.將修飾后的引物結(jié)合固定于修飾后的微珠表面，得到帶引物的微珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法，其特征在于，步驟 A或Al中所述引物采用通用引物或是與模板特異性互補(bǔ)的基因片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法，其特征在于，步驟A2 中微珠表面采用聚丙烯酰胺修飾、羧基修飾、醛基修飾和鏈霉親和生物素修飾，而引物相應(yīng)的修飾則采用丙烯酰胺修飾、氨基修飾或生物素修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法，其特征在于，所述步驟B包括Bi.制備包含帶引物的微珠在內(nèi)的水相體系； B2.制備包含多種油脂混合在內(nèi)的油相體系； B3.將水相體系與油相體系混合制備乳濁液反應(yīng)體系； 其中，步驟Bl與B2之間無先后順序。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法，其特征在于，所述步驟Bl中水相體系中除包含帶引物的微珠、擴(kuò)增反應(yīng)體系必需試劑外，還加入一對加速啟動反應(yīng)的小引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法，其特征在于，所述步驟B2中油相體系由符合熱穩(wěn)定性以及密度要求的多種油脂混合而成。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法，其特征在于，所述步驟B3中制備乳濁液體系時，放入輔助微固體材料。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法，其特征在于，所述步驟B3中制備乳濁液體系，根據(jù)反應(yīng)擴(kuò)增模板的大小，通過控制水、油兩相的混合比例以及振蕩條件來控制乳濁液中液滴的尺寸大小。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法，其特征在于，所述步驟D包括Dl.擴(kuò)增產(chǎn)物加入異丙醇進(jìn)行震蕩破乳，得到釋放產(chǎn)物；D2.釋放產(chǎn)物之后采用提取緩沖液進(jìn)行清洗，離心分離得到分離產(chǎn)物；D3.分離產(chǎn)物經(jīng)TE重復(fù)清洗，得到擴(kuò)增的單分子片段庫。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，提供了一種利用橋式鏈接結(jié)構(gòu)擴(kuò)增單分子片段的方法。所述方法包括以下步驟A.將上、下游兩端的引物分別與微珠進(jìn)行結(jié)合固定，得到帶引物的微珠；B.利用帶引物的微珠制備乳濁液反應(yīng)體系；C.利用乳濁液反應(yīng)體系進(jìn)行橋式ePCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；D.擴(kuò)增產(chǎn)物的釋放與回收，得到擴(kuò)增的單分子片段庫。本發(fā)明中利用結(jié)合在固相表面并且?guī)в屑娱L堿基序列的上、下游兩端引物進(jìn)行擴(kuò)增，使其產(chǎn)物互補(bǔ)形成橋式鏈接結(jié)構(gòu)，從而使擴(kuò)增產(chǎn)物更加穩(wěn)定均一，提高了擴(kuò)增效率，從而使得擴(kuò)增出來的測序片段能夠更長。
文檔編號C12N15/10GK102304509SQ20111025891
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者盛司潼 申請人:盛司潼