專利名稱：一種產(chǎn)角蛋白酶的單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)角蛋白酶的單胞菌及其應(yīng)用，尤其是一種產(chǎn)角蛋白酶的的單胞菌的篩選和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
角蛋白酶(Keratinase)是一種可以特異性降解角蛋白的酶類，可以由細(xì)菌、放線菌和真菌等多種微生物產(chǎn)生。常見的角蛋白為動(dòng)物的毛發(fā)，如牛毛、羊毛和人發(fā)等，羽毛作為家禽飼養(yǎng)和屠宰工業(yè)的副產(chǎn)物每年產(chǎn)量巨大，且蛋白質(zhì)和氨基酸含量豐富，是潛在的優(yōu)良蛋白質(zhì)資源。在傳統(tǒng)利用羽毛過程中主要采用酸堿水解。熱降解等方法，前者存在污染環(huán)境問題，后者對(duì)能源消耗比較大，且可以破壞部分氨基酸，降低了產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值。羽毛的合理利用一方面可以減少廢棄物對(duì)環(huán)境的污染，同時(shí)可以作為一種飼科蛋白質(zhì)應(yīng)用于畜禽的飼養(yǎng)。在紡織工業(yè)中，羊毛有時(shí)候會(huì)發(fā)生氈縮現(xiàn)象。目前處理羊毛鱗片多采用氯化法等化學(xué)方法，或采用雙氧水進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)環(huán)境造成了污染。而在應(yīng)用生物處理法時(shí)采用蛋白酶進(jìn)行單一處理對(duì)羊毛質(zhì)地?fù)p害較大。采用角蛋白酶和蛋白酶共同處理可以達(dá)到既可以減少羊毛鱗片又可以不損害羊毛自身質(zhì)地的效果。此外，角蛋白酶可“消化”導(dǎo)致瘋牛病和人類克雅氏癥的毒蛋白，從而可應(yīng)用于醫(yī)療和實(shí)驗(yàn)儀器的凈化；它還可用于皮革脫毛鞣制，配制潤膚露、浴皂、洗發(fā)水和脫毛膏等美
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)角蛋白酶的單胞菌，該菌株為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Gtenotrophomonas maltophilia)BBEll_l，于2011年6月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No =M 2011193，以其16SrDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹如說明書附圖1所示。所述嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌發(fā)酵用培養(yǎng)基組成如下葡萄糖lOgL—1，酵母粉5gL_i，羽毛 SgL—1，磷酸二氫鉀lgL—1，磷酸氫二鉀SgL-1PH 9 ；發(fā)酵條件為發(fā)酵條件優(yōu)選為pH 9、培養(yǎng)溫度25°C。本發(fā)明具有如下有益效果1)本發(fā)明提供的菌株，具有在Mh內(nèi)高效降解羽毛的優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)于國內(nèi)外所報(bào)道的可以降解羽毛角蛋白的菌株；2)采用本發(fā)明所篩選的菌株對(duì)單一羽毛培養(yǎng)基進(jìn)行降解，經(jīng)分析后可以產(chǎn)生17 種氨基酸，并含有動(dòng)物自身不能合成的稀有氨基酸，可以代替大豆?jié)M足家禽所用飼料。3)采用本發(fā)明篩選的菌株所產(chǎn)角蛋白酶的粗酶液，與蛋白酶共同處理，在蛋白酶濃度一定的情況下增加角蛋白酶粗酶液的濃度可以對(duì)羊毛鱗片得到較好的處理，可應(yīng)用于紡織行業(yè)。


圖 1 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 Gtenotrophomonas maltophilia)BBEll-I 的系統(tǒng)發(fā)育樹圖2 采用所篩菌株對(duì)單一羽毛培養(yǎng)基進(jìn)行降解Mh的效果培養(yǎng)基為羽毛含量為2(^171的單一羽毛無機(jī)鹽培養(yǎng)基，A三角瓶為未處理羽毛，B三角瓶為單胞菌處理Mh的效果。圖3 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌發(fā)酵上清液對(duì)羊毛去鱗的處理效果A 未處理羊毛纖維B 蛋白酶用量2% owf，角蛋白酶用量10% owfC:蛋白酶用量2% owf，角蛋白酶用量30% owfD 蛋白酶用量2% owf，角蛋白酶用量80% owf
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1產(chǎn)角蛋白酶菌株的篩選方法1.采樣地點(diǎn)為當(dāng)?shù)丶仪蒿曫B(yǎng)場，將采樣所得土壤或污泥樣品，分別加入到盛有 20mL滅菌水和玻璃珠的三角瓶中，置37°C搖床混勻、打碎做成菌懸液；2.將菌懸液加入到初篩培養(yǎng)基中，37°C 200轉(zhuǎn)，直至羽毛降解為止，傳代三次。初篩培養(yǎng)基羽毛10，K2HPO4,1. 4，KH2PO4 0. 7，NaCLO. 5，MgSO4 · 7H20 0. 1， ρΗ7·0-7·2。(g/1)3.吸取上清液進(jìn)行梯度稀釋，取10_4、10_6、10_6 3個(gè)稀釋度涂布脫脂牛奶平板。涂布后37 °C倒置培養(yǎng)48h ；4.選取透明圈較大的點(diǎn)種于脫脂牛奶培養(yǎng)基中。從形態(tài)上分辨及透明圈大小可以篩選出6株菌。5.將以上牛奶平板中透明圈較大的在LB培養(yǎng)基上劃線純化并保藏于甘油管中。6.將以上菌株接種到含有完整羽毛的三角瓶中進(jìn)行進(jìn)一步篩選。選出降解較強(qiáng)時(shí)間較快的菌株，后進(jìn)行菌種鑒定。將以上6株菌分別接種于羽毛無機(jī)鹽培養(yǎng)基中觀察羽毛降解情況，其中有兩株菌可以降解羽毛，但有一株菌降解速度較慢。另一株菌在M小時(shí)內(nèi)可以對(duì)羽毛實(shí)現(xiàn)大部分降解，確定此株菌為最終篩選菌株，并測序鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。實(shí)施例2產(chǎn)角蛋白酶菌株的初步發(fā)酵條件確定選取不同的溫度、pH、氮源、碳源和無機(jī)鹽，對(duì)所篩菌發(fā)酵條件進(jìn)行初步確定，發(fā)酵時(shí)間定為40h，結(jié)果見表1。酶活測定吸取ImL適當(dāng)稀釋的酶液，加入ImL 0. 05mol/LTtis-Hcl緩沖液 (PH7.5)及底物(羽毛粉)5mg，40°C培養(yǎng)60min，加入2mL 4M TCA溶液以終止反應(yīng)，放置 20min后過濾掉不溶物。離心5min，吸取0. 5mL上清液移入到新的試管中，后依此加入0. 5mL 福林酚試劑和anL 0. 5M Na2CO3后40°C顯色20min，在660nm處檢測吸光值，吸光值每增加 0.01定義為一個(gè)酶活單位。
表1產(chǎn)角蛋白酶菌株的初步發(fā)酵條件確定
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)角蛋白酶的單胞菌，為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) BBE11-1，于2011年6月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No =M 2011193。
2.權(quán)利要求1所述的單胞菌應(yīng)用于紡織原料加工。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌發(fā)酵上清粗酶液與羊毛進(jìn)行反應(yīng)處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌發(fā)酵用培養(yǎng)基組成如下葡萄糖lOgL—1，酵母粉5β Λ羽毛SgL—1，磷酸二氫鉀lgL—1，磷酸氫二鉀Sgr1pH 9。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于發(fā)酵條件優(yōu)選為pH9、培養(yǎng)溫度25°C。
6.權(quán)利要求1所述的單胞菌應(yīng)用于飼料添加劑制備。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)角蛋白酶的單胞菌及其應(yīng)用，所篩產(chǎn)角蛋白酶菌株可以在24h以內(nèi)高效降解羽毛，經(jīng)發(fā)酵初步優(yōu)化后角蛋白酶活力可以達(dá)到150U/mL。對(duì)所降解羽毛經(jīng)過氨基酸分析后發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)多種氨基酸，可以代替大豆等糧食作物作為飼料的主要氮源。同時(shí)，該菌發(fā)酵酶液對(duì)羊毛也具有較好的處理效果。本發(fā)明篩選的產(chǎn)角蛋白酶單胞菌在飼料及紡織行業(yè)均具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102329751SQ20111028165
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者劉柏宏, 堵國成, 張娟, 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)