專(zhuān)利名稱(chēng)：一種fgfr1基因突變檢測(cè)特異性引物和液相芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及ー種FGFRl基因突變檢測(cè)特異性引物和液相芯片。
背景技術(shù)：
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors, FGFs)是一組結(jié)構(gòu)相似的多肽類(lèi)家族，并通過(guò)跨膜高親和カ的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fibroblast growth factorreceptors, FGFRs)發(fā)揮作用。FGFR屬于受體型蛋白酪氨酸激酶，該家族主要包括FGFRl、FGFR2、FGFR3和FGFR4四位成員。FGFR參與調(diào)節(jié)細(xì)胞増殖、凋亡、遷移、新生血管生成等多個(gè)過(guò)程。由于作用廣泛，F(xiàn)GFR及其他RTK在正常情況下受到嚴(yán)格調(diào)控。在腫瘤中，如在乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等，F(xiàn)GFR激活突變或者配體/受體過(guò)表達(dá)導(dǎo)致其持續(xù)激活，不僅與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、不良預(yù)后等密切相關(guān)，并且在腫瘤新生血管生成、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體I (Fibroblast Growth Factor ReceptorLFGFRl)在創(chuàng)傷愈合、血管形成、組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，本發(fā)明針對(duì)FGFRl基因的C374T和C754A等兩個(gè)位點(diǎn)的野生型和突變型，提供了能夠單獨(dú)或并行檢測(cè)的液相芯片。目前，對(duì)FGFRl基因突變進(jìn)行檢測(cè)和分析的方法很少，主要有直接測(cè)序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突變?cè)斐傻南拗菩詢(xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變，如位點(diǎn)丟失或產(chǎn)生新位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增某一特定片段，再用限制性?xún)?nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測(cè)酶切位點(diǎn)改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒(méi)有產(chǎn)生新酶切位點(diǎn)的基因突變檢測(cè)。再次，以上這些方法都存在著檢測(cè)通量的局限性，毎次只能檢測(cè)ー種突變類(lèi)型，不能滿(mǎn)足實(shí)際應(yīng)用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー是提供FGFRl基因突變檢測(cè)液相芯片，該液相芯片可用于單獨(dú)或并行檢測(cè)FGFRl基因兩種常見(jiàn)基因型C374T和C754A的野生型和突變型。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下ー種FGFRl基因突變檢測(cè)液相芯片，包括有(A).針對(duì)FGFRl基因不同突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為針對(duì)C374T位點(diǎn)的SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 6 ;和/或針對(duì)C754A位點(diǎn)的 SEQ IDN0. 7 及 SEQ ID NO. 8 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 4 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 12，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對(duì)；(C).用于擴(kuò)增出需要檢測(cè)的、具有相應(yīng)突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。
優(yōu)選地，所述擴(kuò)增引物為針對(duì)C374T位點(diǎn)的SEQ ID NO. 13及SEQ ID NO. 14 ;和/或針對(duì) C754A 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16。優(yōu)選地，所述ASPE引物為針對(duì)C374T位點(diǎn)的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 5組成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 6組成的序列；和/或針對(duì)C754A位點(diǎn)的由SEQID NO. 3和SEQ ID NO. 7組成的序列以及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 8組成的序列。本發(fā)明的另一目的是提供用于FGFRl基因突變檢測(cè)的特異性引物。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下用于FGFRl基因突變檢測(cè)的特異性引物，其為針對(duì)C374T位點(diǎn)的SEQ ID NO. 5及SEQ IDN0. 6 ;和 / 或針對(duì) C754A 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法與測(cè)序法的吻合率高達(dá)100%。且檢測(cè)所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測(cè)序技術(shù)，特別符合實(shí)際應(yīng)用需要。所制備的FGFRl基因突變檢測(cè)液相芯片具有非常好的信號(hào)-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、ant1-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)的并行檢測(cè)。2.本發(fā)明通過(guò)發(fā)明人長(zhǎng)期積累的設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)和大量的實(shí)驗(yàn)操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合。本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識(shí)別目標(biāo)檢測(cè)的突變位點(diǎn)，準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個(gè)反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標(biāo)檢測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，檢測(cè)特異性好，交叉反應(yīng)率低于3% ;除了能夠檢測(cè)單個(gè)位點(diǎn)突變情況，也能夠同時(shí)并行檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)的突變情況，檢測(cè)效果一致。3.本發(fā)明的檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)單，2種突變位點(diǎn)檢測(cè)可通過(guò)一步PCR即可完成2條含有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過(guò)程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時(shí)定性、定量分析特征。4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時(shí)對(duì)現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測(cè)項(xiàng)目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測(cè)的熒光信號(hào)值大大提高，從而使得檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1FGFRl基因突變檢測(cè)液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對(duì)FGFRl基因兩種常見(jiàn)基因型C374T和C754A的野生型和突變型，分別設(shè)計(jì)特異性引物序列。ASPE引物由“ tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE弓丨物序列如下表所示表IFGFRl基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特異性引物序列)
權(quán)利要求
1.一種FGFRl基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征是，包括有 (A).針對(duì)FGFRl基因不同突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為針對(duì)C374T位點(diǎn)的SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 6 ;和/或針對(duì)C754A位點(diǎn)的 SEQ IDNO. 7 及 SEQ ID NO. 8 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 4 ； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 12，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對(duì)； (C).用于擴(kuò)增出需要檢測(cè)的、具有相應(yīng)突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FGFRl基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述擴(kuò)增引物為針對(duì) C374T 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14 ;和 / 或針對(duì) C754A 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 15及 SEQ IDNO. 16。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FGFRl基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述ASPE引物為針對(duì)C374T位點(diǎn)的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 5組成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQID NO. 6組成的序列；和/或針對(duì)C754A位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 7組成的序列以及由SEQID NO. 4和SEQ ID NO. 8組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FGFRl基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征是， (A)所述ASPE引物為:針對(duì)C374T位點(diǎn)的由SEQIDNO.1和SEQ IDNO. 5組成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 6組成的序列；和針對(duì)C754A位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 3和SEQIDNO. 7組成的序列以及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 8組成的序列； (B)有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 12，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對(duì)； (C)所述擴(kuò)增引物為:針對(duì)C374T位點(diǎn)的SEQID NO. 13及SEQ ID NO. 14 ;和針對(duì)C754A位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的FGFRl基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5-10個(gè)T。
6.用于FGFRl基因突變檢測(cè)的特異性引物，其特征是，所述特異性引物序列為針對(duì)C374T 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 5 及 SEQ ID NO. 6 ;和 / 或針對(duì) C754A 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 7 及 SEQID NO. 8。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種FGFR1基因檢測(cè)特異性引物和液相芯片，該液相芯片主要包括有每種由5’端的tag序列和3’端針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為針對(duì)C374T位點(diǎn)的SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6；和/或針對(duì)C754A位點(diǎn)的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；有anti-tag序列包被的微球；擴(kuò)增引物。本發(fā)明所提供的檢測(cè)液相芯片的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序法的吻合率高達(dá)100％，實(shí)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)的野生型和突變型并行檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103031368SQ20111030088
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者許嘉森, 吳詩(shī)揚(yáng) 申請(qǐng)人:廣州益善生物技術(shù)有限公司