專利名稱：檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片及其制作方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因芯片檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片及其制作方法，以及包括該基因芯片的試劑盒，適用于低成本2型糖尿病易感基因關(guān)聯(lián)分析。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種由胰島素分泌缺陷和/或胰島素作用障礙所致的復(fù)雜代謝性疾病， 發(fā)病率逐年上升，我國(guó)的糖尿病發(fā)病人數(shù)位居世界第二，其中90%為2型糖尿病(簡(jiǎn)稱 T2DM)，且發(fā)病年齡趨向年輕化。持續(xù)高血糖所引發(fā)的慢性并發(fā)癥已成為腎功能衰竭、失明和心腦血管疾病的主要原因，給個(gè)人、社會(huì)和國(guó)家醫(yī)療保健帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，成為全球性的社會(huì)衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。由于T2DM具有家族性特征，且不同種族間發(fā)病率存在明顯差異， 另外同卵雙生和異卵雙生個(gè)體發(fā)病率和病情也不同，因此遺傳成分在該病的發(fā)病中起重要作用。因此，通過(guò)連鎖或關(guān)聯(lián)分析確定糖尿病的易感或致病基因，對(duì)于從基因角度闡釋糖尿病發(fā)病機(jī)制有重要意義。傳統(tǒng)的糖尿病易感基因檢測(cè)方法主要包括PCR-RFLP、AS_PCR和DNA測(cè)序方法等， 這些方法在基因突變檢測(cè)中起了重要作用，但普遍存在著明顯的不足，諸如檢測(cè)基因位點(diǎn)有限、耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等，不適用于大批量、系統(tǒng)檢測(cè)，給糖尿病的臨床診斷帶來(lái)困難。其中，PCR-RFLP方法是經(jīng)典的生物學(xué)方法，但由于限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)有限，難以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)，且耗時(shí)較長(zhǎng)；AS-PCR方法雖能準(zhǔn)確檢測(cè)突變，但要求擴(kuò)增條件非常優(yōu)化，且引物要有高度的特異性，否則易出現(xiàn)假限性或假陽(yáng)性結(jié)果；DNA測(cè)序雖是目前公認(rèn)的檢測(cè)新突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其對(duì)特殊結(jié)構(gòu)DNA序列無(wú)法測(cè)序，而且只有異質(zhì)性水平> 25%時(shí)才能檢出，而臨床常用標(biāo)本外周血白細(xì)胞中異質(zhì)性水平通常都達(dá)不到這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，因此很易漏檢。因此，如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)糖尿病基因突變是糖尿病臨床診斷的主要難題之一?；蛐酒墙陙?lái)興起的一項(xiàng)重要生物技術(shù)，越來(lái)越多地應(yīng)用于基因多態(tài)性分析和診斷。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，到2007年用全基因組SNP基因芯片進(jìn)行糖尿病易感基因篩查的研究迅速增多，Diabetes Gene Discovery Group, Finland-US Investigation of NIDDM Genetics(FUSION)，deCODE Genetics，DiaGen 等研究使用 Illumina 100K 或 Illumina 300KSNP 基因芯片，Diabetes Genetics Initiative, Wellcome Trust Case Control Consortium, Pima, Starr County, Texas, Old Order Amish, Framingham Health Study 等研究使用 Affymetrix 100K 或 Affymetrix 500K 芯片，Japanese multi-disease collaborative genome scan 使用 JSNP Genome Scan 100K SNP 芯片，BioBank Japan 使用定制的SNP芯片。這些研究中或使用昂貴的商品化SNP芯片，或使用數(shù)十萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)，大規(guī)模應(yīng)用其成本過(guò)高。目前常用的SNaPshot和kquenom技術(shù)則需要購(gòu)買昂貴的專門設(shè)備。因此，應(yīng)用這些芯片雖然發(fā)現(xiàn)了多個(gè)2型糖尿病相關(guān)易感基因位點(diǎn)，但這些研究成果未能得到大規(guī)模關(guān)聯(lián)分析的檢驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片，該基因芯片只需借助常規(guī)的實(shí)驗(yàn)器具即可進(jìn)行檢測(cè)，易規(guī)?；瘧?yīng)用。基于此，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種前述基因芯片的制作方法以及包括該基因芯片的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片，包括固相載體、固定在固相載體上的用于檢測(cè)2型糖尿病易感基因的特異性寡核苷酸探針，探針的核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 14所示，所述固相載體為硝酸纖維素膜或尼龍膜。本技術(shù)方案通過(guò)對(duì)2型糖尿病易感基因位點(diǎn)突變進(jìn)行篩選，設(shè)計(jì)相關(guān)探針，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)篩選和驗(yàn)證，得到了一組雜交特異性高準(zhǔn)確度好的探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 14所示，這些探針?lè)譃橐吧吞结樅屯蛔冃吞结槪瑢?duì)下述SNP位點(diǎn)INS rs689、JAZFl rs864745、DCD rsll53188、 IGF2BP2 rsl470579、TCF7L2 rs7501939、TSPAN8，LGR5rs7961581 以及 rs9465871(具體如表1所示)。進(jìn)而，本發(fā)明采用生物軟件Primer Premier 5. 0 (PREMIER Biosoft International,CA)和 NCBI BLAST(http://www. ncbi. nlm. hi. gov/BLAST/)輔助設(shè)計(jì)和分析所需的引物和探針，使目的片段擴(kuò)增和雜交反應(yīng)能在同一條件下進(jìn)行。本技術(shù)方案的基因芯片的固相載體還可以是其他任何不影響核酸雜交，且可穩(wěn)定連接雜交探針的載體。優(yōu)選地，所述基因芯片的點(diǎn)陣布控膜芯片為96個(gè)樣點(diǎn)組成的6行X 16列的矩陣，包括質(zhì)控系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)，其中，質(zhì)控系統(tǒng)為(1)芯片陽(yáng)性對(duì)照，為SEQ ID No. 1 14探針的等量混合的25uM溶液，作為設(shè)計(jì)布控于左上、右上、右下三個(gè)角，作為陽(yáng)性對(duì)照樣點(diǎn)，共12個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣點(diǎn)；(2)芯片平行對(duì)照，采用25uM的探針溶液點(diǎn)樣，各探針平行點(diǎn)4個(gè)點(diǎn)，即每4個(gè)點(diǎn)檢測(cè)一個(gè)等位基因型，上下共8個(gè)點(diǎn)，共同構(gòu)成一個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)區(qū)；(3)芯片陰性對(duì)照，為5XSSC，共4個(gè)陰性對(duì)照樣點(diǎn)，位于每個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)區(qū)之間。優(yōu)選地，探針3’端具有15個(gè)多聚T，并經(jīng)氨基基團(tuán)修飾。本發(fā)明的一種檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片的制作方法，包括如下步驟1)對(duì)硝酸纖維素膜或尼龍膜進(jìn)行預(yù)處理，形成固相載體；2)用芯片點(diǎn)樣儀將稀釋好的用于檢測(cè)2型糖尿病易感基因的特異性寡核苷酸探針印點(diǎn)到固相載體上，探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 14所示。優(yōu)選地，步驟1)中的預(yù)處理為將硝酸纖維素膜或尼龍膜浸入滅菌雙蒸水中浸泡 8min 12min，再浸入5 X SSC 24min 34min，而后取出并風(fēng)干，4°C保存?zhèn)溆?。?yōu)選地，探針采用如下方式制備合成探針，探針在合成時(shí)3’端合成15個(gè)多聚T， 并經(jīng)氨基基團(tuán)修飾，而后用20XSSC-Buffer作為稀釋液稀釋至終濃度為15μΜ。優(yōu)選地，步驟幻具體為采用478Α芯片點(diǎn)樣儀將所述用于檢測(cè)2型糖尿病易感基因的特異性寡核苷酸探針點(diǎn)印于處理好的固相載體上，然后用紫外光照射8min，使之交聯(lián)固定，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 優(yōu)選地，探針印點(diǎn)到固相載體后，還包括對(duì)固定有探針的固相載體進(jìn)行洗滌的步驟，具體為室溫下含2XSSC-0. 1 % SDS洗滌溶液中振動(dòng)洗滌5minX2次，含 0. 5XSSC-0. 1% SDS洗滌溶液中振動(dòng)洗滌15min。本發(fā)明的一種試劑盒，包括檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片，該基因芯片包括固相載體、固定在固相載體上的用于檢測(cè)2型糖尿病易感基因的特異性寡核苷酸探針，探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 14所示，所述固相載體為硝酸纖維素膜或尼龍膜。優(yōu)選地，還包括用于擴(kuò)增易感基因位點(diǎn)所在區(qū)域的引物，引物序列為SEQ ID No. 15 28所示的寡核苷酸，所擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镾EQ ID No. 29 35所示。這些引物具有良好的擴(kuò)增效能，擴(kuò)增可以在同一個(gè)條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，還包括以下試劑中的一種或多種雜交液、封閉液、PCR緩沖液、dNTPs、 DNA 聚合酶、MgCl2。本發(fā)明的基因芯片在應(yīng)用中，7個(gè)目的DNA片段的擴(kuò)增可在同一條件下進(jìn)行PCR， 使獲得的目的片段濃度高，足以保證后續(xù)雜交反應(yīng)所需的DNA量，而且又省時(shí)并降低了實(shí)驗(yàn)成本。本發(fā)明的基因芯片在應(yīng)用中，每個(gè)位點(diǎn)的野生型探針和突變型探針退火溫度很相近，在42°C進(jìn)行雜交反應(yīng)時(shí)可獲得滿意的雜交效果，根據(jù)兩種探針雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，可判斷被檢測(cè)位點(diǎn)是否發(fā)生突變。該芯片可系統(tǒng)檢測(cè)糖尿病相關(guān)的易感基因突變位點(diǎn)，并設(shè)立了陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和片內(nèi)平行對(duì)照，便于控制和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本發(fā)明還提供采用該基因芯片進(jìn)行檢測(cè)糖尿病易感基因突變的方法，該方法包括下列步驟1)提取樣品DNA ；2)通過(guò)PCR擴(kuò)增樣品DNA和標(biāo)記目的DNA ；3)雜交反應(yīng)；4)洗滌，直接讀片。本發(fā)明采用定制基因芯片技術(shù)，通過(guò)自動(dòng)化基因芯片點(diǎn)樣儀將預(yù)先合成的探針點(diǎn)樣于固相載體(膜)上，構(gòu)成專門針對(duì)2型糖尿病大樣本關(guān)聯(lián)分析用的基因芯片，利用本發(fā)明的基因芯片對(duì)32份外周血樣本應(yīng)用該芯片進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)序驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果，芯片檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相符，所以本發(fā)明的基因芯片具有高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。具體來(lái)說(shuō)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的基因芯片具有如下優(yōu)點(diǎn)1、可以快速系統(tǒng)地檢測(cè)與糖尿病相關(guān)的基因突變；2、檢測(cè)時(shí)，操作簡(jiǎn)單，易于掌握，省時(shí)，成本低；3、可適應(yīng)不同層次醫(yī)院的臨床需求，具有很好的應(yīng)用市場(chǎng)和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明的基因芯片可快速檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變，相對(duì)于目前常用的SNaPshot和kquenom技術(shù)，利用該基因芯片的檢測(cè)方法不需要特殊的昂貴儀器，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的熒光顯微鏡即可進(jìn)行檢測(cè)。該芯片適用于大樣本低成本2型糖尿病易感基因關(guān)聯(lián)分析。應(yīng)用本發(fā)明的基因芯片，實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)單、成本低。所需引物可在同一退火溫度進(jìn)行 PCR反應(yīng)，擴(kuò)增同時(shí)完成生物素標(biāo)記，經(jīng)過(guò)1次雜交反應(yīng)，即可檢測(cè)7個(gè)基因位點(diǎn)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、快速、效率高，膜芯片可滿足不同層次醫(yī)院的要求，可用于2型糖尿病易感基因關(guān)聯(lián)分析。


圖1為2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變位點(diǎn)檢測(cè)微陣列芯片點(diǎn)樣矩陣圖，其中， 為陽(yáng)性對(duì)照；〇為陰性對(duì)照；◎?yàn)橥蛔冃吞结槪沪橐吧吞结?；圖2為生物素標(biāo)記7個(gè)突變位點(diǎn)檢測(cè)微陣列膜芯片檢測(cè)結(jié)果圖；圖3為測(cè)序驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果所得的測(cè)序峰圖。
具體實(shí)施例方式為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例所述的范圍。實(shí)施例一本實(shí)施例中的基因芯片包括固相載體及固定在固相載體上的用于檢測(cè)2型糖尿病易感基因的特異性寡核苷酸探針，該探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 14所示，固相載體為硝酸纖維素膜。其中，探針和引物設(shè)計(jì)如下通過(guò)對(duì)2型糖尿病易感基因位點(diǎn)突變進(jìn)行篩選，設(shè)計(jì)相關(guān)探針，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)篩選和驗(yàn)證，得到了一組雜交特異性高、準(zhǔn)確度好的探針，探針序列如表1所示。表1 7個(gè)位點(diǎn)野生型和突變型探針序列
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片，其特征在于，包括固相載體、固定在固相載體上的用于檢測(cè)2型糖尿病易感基因的特異性寡核苷酸探針，探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 14所示，所述固相載體為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片的點(diǎn)陣布控膜芯片為96個(gè)樣點(diǎn)組成的6行X 16列的矩陣，包括質(zhì)控系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)，其中，質(zhì)控系統(tǒng)為(1)芯片陽(yáng)性對(duì)照，為SEQID No. 1 14探針的等量混合的25uM溶液，作為設(shè)計(jì)布控于左上、右上、右下三個(gè)角，作為陽(yáng)性對(duì)照樣點(diǎn)，共12個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣點(diǎn)；(2)芯片平行對(duì)照，采用25uM的探針溶液點(diǎn)樣，各探針平行點(diǎn)4個(gè)點(diǎn)，即每4個(gè)點(diǎn)檢測(cè)一個(gè)等位基因型，上下共8個(gè)點(diǎn)，共同構(gòu)成一個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)區(qū)；(3)芯片陰性對(duì)照，為5XSSC，共4個(gè)陰性對(duì)照樣點(diǎn)，位于每個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)區(qū)之間。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片，其特征在于，探針3’端具有15個(gè)多聚T，并經(jīng)氨基基團(tuán)修飾。
4.一種檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片的制作方法，其特征在于，包括如下步驟1)對(duì)硝酸纖維素膜或尼龍膜進(jìn)行預(yù)處理，形成固相載體；2)用芯片點(diǎn)樣儀將稀釋好的用于檢測(cè)2型糖尿病易感基因的特異性寡核苷酸探針印點(diǎn)到固相載體上，探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 14所示。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片的制作方法，其特征在于，步驟1)中的預(yù)處理為將硝酸纖維素膜或尼龍膜浸入滅菌雙蒸水中浸泡 8min 12min，再浸入5 X SSC 24min 34min，而后取出并風(fēng)干，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 6.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片的制作方法，其特征在于，探針采用如下方式制備合成探針，探針在合成時(shí)3’端合成15個(gè)多聚T， 并經(jīng)氨基基團(tuán)修飾，而后用20 X SSC-Buffer作為稀釋液稀釋至終濃度為15 μ M。
7.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片的制作方法，其特征在于，步驟2、具體為采用478Α芯片點(diǎn)樣儀將所述用于檢測(cè)2型糖尿病易感基因的特異性寡核苷酸探針點(diǎn)印于處理好的固相載體上，然后用紫外光照射8min，使之交聯(lián)固定，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 8.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片的制作方法，其特征在于，探針印點(diǎn)到固相載體后，還包括對(duì)固定有探針的固相載體進(jìn)行洗滌的步驟，具體為室溫下含2XSSC-0. 1 % SDS洗滌溶液中振動(dòng)洗滌5minX2次，含 0. 5XSSC-0. 1% SDS洗滌溶液中振動(dòng)洗滌15min。
9.一種試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，還包括用于擴(kuò)增易感基因位點(diǎn)所在區(qū)域的引物，引物序列為SEQ ID No. 15 觀所示的寡核苷酸，所擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镾EQ ID No. 29 35所示。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，還包括以下試劑中的一種或多種雜交液、封閉液、PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶、MgCl20
全文摘要
本發(fā)明公開一種檢測(cè)2型糖尿病易感基因7個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片，包括固相載體、固定在固相載體上的用于檢測(cè)2型糖尿病易感基因的特異性寡核苷酸探針，探針的核苷酸序列如SEQ ID No.1～14所示，所述固相載體為硝酸纖維素膜或尼龍膜。本發(fā)明還公開該基因芯片的制作方法，以及包括該基因芯片的試劑盒。本發(fā)明的基因芯片可以快速系統(tǒng)地檢測(cè)與糖尿病相關(guān)的基因突變，易于規(guī)?；褂?；在利用本發(fā)明基因芯片檢測(cè)時(shí)，操作簡(jiǎn)單，易于掌握，省時(shí)，成本低；本發(fā)明的基因芯片可適應(yīng)不同層次醫(yī)院的臨床需求，具有很好的應(yīng)用市場(chǎng)和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102312014SQ201110308429
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月12日
發(fā)明者劉松梅, 周新, 謝焱, 鄧冠華, 鄭璇, 馬海波 申請(qǐng)人:廣州陽(yáng)普醫(yī)療科技股份有限公司