專利名稱：以海水白點蟲制動抗原互補脫氧核糖核酸生產(chǎn)的疫苗及其制造方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一優(yōu)化的海水白點蟲制動抗原互補脫氧核糖核酸(cDNA)，及包含其之載體、以其生產(chǎn)的疫苗及其制造方法及用途。
背景技術(shù)：
周纖毛蟲類原生動物寄生蟲海水白點蟲(Cryptocaryon irritans)是造成多種海水魚類感染海水白點病的致病生物，野生魚類、觀賞魚類或養(yǎng)殖魚類都有可能遭受感染。目 前海水白點蟲已是魚類養(yǎng)殖場常見的寄生蟲，其被認為是造成最嚴重漁業(yè)經(jīng)濟損害的寄生蟲的一，不只亞洲養(yǎng)殖漁業(yè)(包括中國、臺灣、日本、韓國、印度及其他亞洲國家)受到海水白點蟲的威脅，澳洲、波斯灣、以色列紅海、加勒比海等地亦有海水白點蟲的蹤跡，造成海水養(yǎng)殖漁業(yè)巨大的經(jīng)濟損失。雖然可使用化學藥劑預(yù)防或治療受海水白點蟲感染的魚類，但其會造成嚴重的海洋污染，且對人類健康有危害。海水白點蟲的生命周期以四個階段組成營養(yǎng)體(toophont)期、原分裂前體(protomont)期、分裂囊胞體(tomonts cyst)期及纖毛幼蟲(theront)期，早期有關(guān)與海水白點蟲分屬動物分類學上不同門(phylum)的淡水白點蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)的研究顯示體液免疫可藉由制動(immobilize)纖毛幼蟲達到預(yù)防感染的效果。有許多研究指出魚類血液免疫及皮膚黏膜免疫在對抗海水白點蟲上扮演重要角色，對海水白點蟲的細胞免疫可由自然受感染魚體的感染部位上的白血球滲入(Infiltration)及海水白點蟲營養(yǎng)體上⑶8+白血球定位(localization)窺知，而對海水白點蟲的非專一細胞免疫反應(yīng)如外圍血的嗜酸性白血球(eosinophil)數(shù)量降低及表皮層的黏膜細胞增生也在石斑魚中被發(fā)現(xiàn)。許多研究指出對于海水白點蟲營養(yǎng)體、原分裂前體及纖毛幼蟲的免疫作用可在受感染魚體中誘發(fā)更強的保護免疫力(protective immunity),其中纖毛幼蟲期可提供較強的保護免疫力。由于海水白點蟲是一絕對寄生蟲，作為疫苗的纖毛幼蟲僅能從受感染魚體中得到，因此要搜集到足夠量的活體纖毛幼蟲用于生產(chǎn)疫苗相當費時費力且不切實際，且截至目前為止，并無技術(shù)可以利用離體方式使海水白點蟲完成完整的生命周期。制動現(xiàn)象(immobilization phenomenon)是在離體實驗中，由經(jīng)免疫過后的魚體的血漿及黏膜制動活體纖毛幼蟲，此現(xiàn)象可于魚體內(nèi)發(fā)生并提供魚體保護，其是抗體結(jié)合寄生蟲細胞及纖毛表面抗原造成該寄生蟲無法移動。制動現(xiàn)象的目標抗原稱為致動抗原(immbolization antigens, iAg),其特征在于錨定大量糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol,GPI)的表面膜蛋白。文獻中指出，從淡水白點蟲中分離出的制動抗原在誘發(fā)保護免疫力上扮演重要角色，該致動抗原的重組基因片段已被揭露可于金魚體內(nèi)產(chǎn)生對抗淡水白點蟲的免疫反應(yīng)，并有效提供保護免疫力。此外，有研究者曾利用受感染魚體及產(chǎn)生免疫反應(yīng)的兔子的抗血清和海水白點蟲的營養(yǎng)體及纖毛幼蟲，萃取出箝入性膜蛋白(integral membrane protein)與大量的表面抗原，并從血清型(serotype)G37的海水白點蟲純化及選殖出此發(fā)生表面凝集/制動現(xiàn)象的抗原。然而因細菌及真核生物無法使用該寄生蟲的密碼子，使該制動抗原DNA序列在大腸桿菌及真核細胞中難以表達，再者，經(jīng)優(yōu)化的制動抗原(CISA-32)亞克隆至PHSG299構(gòu)筑的密碼子僅能在細菌中表達，無法于哺乳類動物細胞、昆蟲細胞或酵母菌細胞中表達。于本發(fā)明中，該制動抗原的密碼子經(jīng)修飾過后可順利于大腸桿菌及魚類細胞中表達該制動抗原重組蛋白，并且其具有免疫原性(immunogenic)。而本發(fā)明經(jīng)由免疫測試證實該密碼子經(jīng)修飾后的制動蛋白可做為預(yù)防點帶石斑魚(E. coioides)或其他海水魚類遭海水白點蟲感染的疫苗。脫氧核糖核酸(DNA)疫苗是指注射經(jīng)基因工程改造的DNA進入生物體引發(fā)免疫反應(yīng)以達到預(yù)防感染疾病的效果的技術(shù)，核酸疫苗可應(yīng)用于預(yù)防細菌、病毒及寄生蟲感染，甚至可用來治療腫瘤，但目前大部分仍處于實驗階段。相較于傳統(tǒng)疫苗，DNA疫苗有許多優(yōu)點，例如可同時誘發(fā)多種免疫反應(yīng)。以人類而言，疫苗對現(xiàn)代醫(yī)學有相當大的貢獻，例如使天花、小兒麻痹、傷寒(typhus)、輪狀病毒(TOtavirus)、A型肝炎、B型肝炎等疾病都藉由疫苗達到良好的控制。 然而，傳統(tǒng)疫苗僅能對抗有限數(shù)量的疾病，目前仍有許多疾病缺乏有效疫苗防治，例如人類后天免疫不全癥候群(AIDS)、C型肝炎、瘧疾(malaria)等病癥，仍待開發(fā)有效疫苗。對動物而言，疫苗及其預(yù)防接種是控制動物病原疾病、保障養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要手段。魚類疫苗可分為滅活疫苗、減毒活疫苗、重組活疫苗、次單位疫苗以及DNA疫苗五大類；十年前已有一些細菌疫苗商品化，但病毒疫苗還很少，而寄生蟲疫苗完全沒有。因為魚類疫苗存在免疫原力、生產(chǎn)成本和安全性等問題，大部分疫苗停留在實驗室使用階段，還未商品化生產(chǎn)。在開發(fā)疫苗過程中，所謂第一代疫苗是指全生物體疫苗(who I e-organ ismvaccine),其可能是活體、經(jīng)弱化過的活體或死亡狀態(tài)的生物,滅活疫苗或減毒活疫苗,例如天花及小兒麻痹疫苗，其可誘發(fā)細胞毒殺T淋巴球(T。或CTL)、輔助T細胞(Th)活化及抗體產(chǎn)生，但其存在毒性回復(fù)(reversion to virulence)的風險，滅活疫苗(killedvaccine)雖不具有此風險，但其無法誘發(fā)細胞毒殺T淋巴球活化，且生產(chǎn)上有其對應(yīng)疾病的限制。為最小化上述風險，第二代疫苗應(yīng)運而生，例如次單元疫苗(subunit vaccine),其是以已知蛋白質(zhì)抗原(defined protein antigen)或重組蛋白組成，前者如破傷風(tetanus)疫苗及白喉(diphtheria toxoid)疫苗,后者如B型肝炎疫苗。第二代疫苗可誘發(fā)輔助T細胞及抗體產(chǎn)生，但仍然無法誘發(fā)細胞毒殺T淋巴球活化。DNA疫苗即第三代疫苗，其是以質(zhì)粒透過基因工程技術(shù)處理，使其可產(chǎn)生一至兩個屬于病原體的特定抗原或蛋白質(zhì)，當該DNA被送進體內(nèi)細胞后，透過該質(zhì)粒宿主細胞本身機制即可讀取該DNA并轉(zhuǎn)譯出病原體的特定蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)會被認定為外來蛋白質(zhì),便會被宿主細胞呈現(xiàn)至其表面，誘發(fā)免疫系統(tǒng)辨認并產(chǎn)生多種免疫反應(yīng)。1993年以來，DNA疫苗以其高免疫保護率受到了廣泛關(guān)注。DNA疫苗是指直接把帶有目標抗原基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或注射到動物體內(nèi)，使的表達出天然抗原物質(zhì)。與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗的制作相對簡單，成本低廉，運輸保存容易，不存在毒力回復(fù)的現(xiàn)象。與滅活疫苗和次單位疫苗相比，DNA疫苗的效果更好。1996年，Anderson等首次將魚傳染性造血器官壞死癥病毒(IPNV)的糖蛋白基因插入真核表達質(zhì)粒以制成DNA疫苗，并免疫虹鱒魚，發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)其產(chǎn)生強烈的保護性免疫反應(yīng)，抵抗IPNV病毒的攻擊。迄今為止，學者仍陸續(xù)進行魚類DNA疫苗相關(guān)研究，并有突破性的發(fā)展。本發(fā)明即提供一種以海水白點蟲制動抗原互補脫氧核糖核酸(cDNA)生產(chǎn)的疫苗及其制造方法及用途，該疫苗即為魚類抗寄生蟲的DNA疫苗，其可用于預(yù)防魚類感染海水白點蟲，是于該領(lǐng)域極具新穎性及進步性的發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種優(yōu)化(optimize)海水白點蟲制動抗原互補脫氧核糖核酸(cDNA)序列的方法，其包含a.取得海水白點蟲制動抗原的mRNA序列；b.將該mRNA序列轉(zhuǎn)換為cDNA序列；c.根據(jù)該cDNA序列中終止碼(stop codon)周圍的密碼子(codons)對應(yīng)的氨 基酸殘基的特定特征推測出終止碼特定氨基酸，使該終止碼以能轉(zhuǎn)譯出該特定氨基酸的密碼子取代后，轉(zhuǎn)譯出的蛋白與從該海水白點蟲纖毛幼蟲純化出的制動抗原兩者的免疫原性(immunogenicity)相近；及d.將該終止碼(stop codon)以能轉(zhuǎn)譯出該特定氨基酸的密碼子取代，產(chǎn)生優(yōu)化的(optimized) cDNA 序列；其中該特定特征是選自終止碼周圍密碼子所對應(yīng)的氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)特性、疏水性、電荷分布所組成的群組。本發(fā)明所提供的優(yōu)化(optimize)海水白點蟲制動抗原互補脫氧核糖核酸(cDNA)序列的方法,其中該特定氨基酸為精氨酸(Arginine)、甘胺酸(Glycine)或丙胺酸(Alanine),以甘胺酸(glycine)置換疏水性端(hydrophobicity alteration)、丙胺酸(alanine)置換可最小化結(jié)構(gòu)改變、精胺酸(arginine)可用以置換帶電部分(regionalcharge)。本發(fā)明進一步提供一優(yōu)化的海水白點蟲制動抗原互補脫氧核糖核酸(cDNA)序列，其包含SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列,及一載體,其包該優(yōu)化的海水白點蟲制動抗原cDNA 序列，該載體為 pGex2T_iAg 或 pcDNA3. 1-iAg。本發(fā)明進一步提供一種核酸疫苗，其包括該優(yōu)化的海水白點蟲制動抗原cDNA序列，其進一步可以利用幾丁聚糖納米顆粒包裹。本發(fā)明進一步提供一種優(yōu)化的海水白點蟲制動抗原cDNA序列用于制備針對海水白點蟲的抗體的用途，其特征在于將包含SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的cDNA序列的載體使用于一宿主(host)，促使該宿主產(chǎn)生抗體對該cDNA序列轉(zhuǎn)譯出的蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)后，取得該針對海水白點蟲的抗體，其中該載體可為為pGex2T-iAg或pcDNA3. 1-iAg，并可以幾丁聚糖包裹成納米顆粒，而其中使用于該宿主的方式可為混入飼料或食餌中、混入水中浸泡該宿主或注射該宿主；而其中該宿主為水生生物，尤其是魚類，例如黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)、異臂花鯧(Caprodon schlegelii)、紅點九刺鯧(Cephalopholis aurantia)、青星九刺鯧(Cephalopholis miniata)、細點牙鯛(Dentex dentex)、歐洲海魚盧(Dicentrarchus Iabrax)、尖吻重牙鯛(Diploduspuntazzo)、單斑重牙鯛(Diplodus sargus)、青石斑(Epinephelus awoara)、點帶石斑(Epinephelus coioides)、革安帶石斑(Epinephelus Ianceolatus)、三斑石斑(Epinephelus trimaculatus)、黑毛瓜子臘(Girella leonina)、臀斑髭鯛(Hapalogenysmucronatus)、棘箱純(Kentrocapros aculeatus)、大黃魚(Larimichthys crocea)、尖吻魚盧(Lates calcarifer)、銀紋笛鯛(Lutianus argentimaculatus)、赤鰭笛鯛(Lutjanuserythopterus)、白星笛鯛(Lutjanus stellatus)、角鱗飩(Melichthys vidua)、真鯛(Pagrus major)、花軟唇(Plectorhynchus cinctus)、茉莉花鎌(Poecilia Iatipinna)、魔鬼養(yǎng)魚由(Pterois volitans)、黃錫鯛(Rhabdosargus sarba)、金錢魚(Scatophagusargus)、紅甘錄(Seriola dumerili)、銀籃子魚(Siganus oramin)、金頭鯛(Sparusaurata)、布氏鯧錄(Trachinotus blochii)、海鱺(Rachycentron canadum)、青甘錄(Seriola quinqueradiata)、克氏?？~(Amphiprion clarkii)、白條?？~(Amphiprionfrenatus)、鞍斑?？~(Amphiprion polymnus)或眼斑?？~(Amphiprion ocellaris)。


圖I是Chiayi品系海水白點蟲的制動抗原核苷酸序列(GenBank FJ167511)及其對應(yīng)的氨基酸序列。預(yù)測的信號肽以方框表示，終止密碼子以深灰底表示，預(yù)測穿膜片段以淺灰底表示，以灰底方框表示者為糖基化磷脂酰肌醇固定位置(第302個氨基酸絲氨酸)， 左側(cè)數(shù)字為核苷酸序列、右側(cè)數(shù)字為氨基酸序列。圖2是以RT-PCR偵測制動蛋白轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(受轉(zhuǎn)染24小時、48小時及72小時后的GF-I轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)，泳道(Lane)M為DNA marker ;泳道24、48、72分別為受轉(zhuǎn)染24小時、48小時及72小時后的結(jié)果。圖3是以RT-PCR偵測制動蛋白轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(受注射的魚體肌肉細胞的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)，泳道M為DNA marker ;泳道1、2、3分別為注射質(zhì)粒模板(plasmid template)、對照組質(zhì)粒(mock plasmid)及制動抗原質(zhì)粒(iAg plasmid)的結(jié)果。圖4是以西方墨點法偵測大腸桿菌表達重組制動抗原蛋白。泳道I為Marker ;泳道2為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌；泳道3為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌以小鼠抗GST抗體辨認，其中55kDa箭頭指示處為GST融合制動抗原蛋白、25kDa箭頭指示處為GST蛋白。圖5是以西方墨點法偵測大腸桿菌表達重組制動抗原蛋白。泳道I為Marker ;泳道2箭頭指示處為GST融合制動抗原蛋白以兔子抗海水白點蟲纖毛幼蟲抗體辨認。圖6為透過共軛焦雷射掃描顯微鏡觀察以兔子抗海水白點蟲纖毛幼蟲免疫球蛋白的(A)白光(bright) ; (B)DAPI染色部份；(C)FITC染色部份；(D)前兩者重迭的石斑魚GF-I細胞(a至d為以pcDNA3. 1-optiAg轉(zhuǎn)染的GF-1細胞；e至h為以pcDNA3. I轉(zhuǎn)染的GF-I細胞；i至I為未經(jīng)轉(zhuǎn)染的GF-I細胞；Bar = 50微米)。圖7以Kaplan-Meier存活曲線表達經(jīng)制動抗原刺激免疫反應(yīng)的實驗魚體只存活率，其中經(jīng)制動抗原刺激免疫反應(yīng)的對數(shù)等級(log rank)的顯著性為0. 008。圖8以Kaplan-Meier存活曲線表達經(jīng)重組制動抗原刺激免疫反應(yīng)的實驗魚體只存活率，其中經(jīng)重組制動抗原蛋白加強(boost)的對數(shù)等級(log rank)的顯著性為0.008。
具體實施例方式寄生蟲體收集與培養(yǎng)于臺北地區(qū)的魚市場收集受海水白點蟲(Cryptocaryon irritans)感染的魚類后培養(yǎng)于水槽中，從該水槽底部收集囊胞體(tomont)后，培養(yǎng)于從臺灣南部地區(qū)購買的點帶石斑魚(grouper Epinephelus coioides)幼魚(平均每尾重量2. 6公克)上。本發(fā)明所使用的寄生蟲體培養(yǎng)的流程如下利用小型油漆刷從該水槽底部輕輕地掃取并收集海水白點蟲的囊胞體，并利用海水洗去多余的殘渣或黏膜后，將該囊胞體利用過濾過的海水培養(yǎng)于培養(yǎng)皿(petri plates)上，并于室溫培養(yǎng)三至七天。海水白點蟲的纖毛幼蟲(theront)會從囊胞體中產(chǎn)生，此時于攝氏4度以1500g離心含有該纖毛幼蟲的溶液10分鐘后即可收集活體的纖毛幼蟲， 將該活體纖毛幼蟲感染未被海水白點蟲感染過的成魚(每尾平均重量300公克，從魚市場中采買而得)，隨后可得約六百萬只活體纖毛幼蟲提供后續(xù)以水為媒介的人工感染試驗。DNA 萃取與基因型鑒定(genotype differentiation)利用Bio-Rad 36897CHELEX 100樹脂抽取囊胞體的DNA，一次約使用20至30顆囊胞體，完成后，以聚合酶連鎖反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)及核糖體DNA (rDNA)的18S、ITS-I與5. 8S區(qū)域的特定引物(Primers I and 2 ；Table I)放大特測序列片段，以初步變性溫度攝氏95度進行3分鐘后，再以溫度循環(huán)變性溫度攝氏94度60秒、結(jié)合溫度攝氏55度30秒，及延長溫度攝氏72度60秒進行30個循環(huán)，放大完成的序列交由明欣生物科技有限公司(Mission Biotech Co. ,Ltd.)測序，再將測序成果，即海水白點蟲的部分18S、全部的ITS-I以及部分5. 8S序列以多重序列比對軟件CLUSTAL W(版本I. 83)鑒別其基因型。從兩種品系(isolates)的海水白點蟲中得到部分18S、整段ITS-1的DNA序列，及部分5. 8S rDNA,其核苷酸序列已公開于GenBank,即Chiayi (AF490381)與AusC(AY029271)。制動抗原(immobilizationAntigen, iAg) cDNA 選殖(cloning)利用Trizol (Invitrogen)及所提供的程序抽取全RNA后,利用Primer 3軟件在GeneBank數(shù)據(jù)庫中記錄的制動抗原序列AB262047設(shè)計目標制動抗原的特定引物；而部分抗原的基因序列是分離自ChiayU即嘉義，此品系海水白點蟲采集自嘉義)海水白點蟲，并以含有25微升(yl)的2X反應(yīng)混合液(2X Reaction Mix)、10微微摩爾濃度(pM)的引物(primers 3 and 4, Table I)、2 微升反轉(zhuǎn)錄酶 SuperScript III RT/ Platinum Taq Mix、0.5微克(U g) RNA模板的試劑盒，50微升的總反應(yīng)體積于SuperScript IIIOne-Step RT-PCR系統(tǒng)放大之，上述進行方式為以攝氏50度30分鐘進行cDNA合成后，以溫度循環(huán)為初期變性溫度攝氏94度進行2分鐘，再以溫度循環(huán)變性溫度攝氏94度15秒、結(jié)合溫度攝氏55度30秒，及延長溫度攝氏68度60秒進行40個循環(huán)，最后以溫度攝氏68度5分鐘進行最終延長,放大后的產(chǎn)物亞克隆(subclone)至pGEM-TEasy Vector (Promega)并對其測序。5' and 3'末端選殖技術(shù)利用末端選殖試劑盒(5'and 3' rapid amplification of cDNA ends, RACE)(Invitrogen & Clontech)產(chǎn)出Chiayi海水白點蟲的制動抗原的完整cDNA序列。3'末端選殖是以包含2微升的10倍PCR緩沖液、2. 5毫摩爾濃度(mM)的氯化鎂、0. 5毫摩爾濃度的 dNTP、5 毫摩爾濃度的 DTT、200U 的反轉(zhuǎn)錄酶(Superscrip II Reverse transcriptase)及 oligo (dT)-containing Adaptor Primer (AP ； Invitrogen)共 20 微升的反應(yīng)溶液(Invitrogen)，于攝氏42度下反應(yīng)50分鐘后加溫至攝氏70度反應(yīng)10分鐘，進行反轉(zhuǎn)錄以合成第一股 cDNA(First Strand cDNA)。再將此含有3'端結(jié)尾的cDNA作為模板加入2微升至包含5微升的10倍PCR緩沖液、5毫摩爾濃度的氯化鎂、0. 5毫摩爾濃度的dNTP、5毫摩爾濃度的DTT、5U Taq (Genemark)及 10 微微摩爾濃度的 AUAP 引物(Abridged Universal Amplification Primer)(Invitrogen)，總量50微升的反應(yīng)液，于初期變性溫度攝氏94度進行2分鐘，再以溫度循環(huán)變性溫度攝氏94度30秒、結(jié)合溫度攝氏58度30秒，及延長溫度攝氏72度60秒進行35個循環(huán)，最后以溫度攝氏72度10分鐘進行最終延長，放大后的產(chǎn)物亞克隆至pGEM-T EasyVector并對其測序。至于5'端末端選殖，其第一股 cDNA 是利用 SMARTTM RACE cDNAAmplif icationKit(Clotnech)5WS'端 RACE CDS 引物 A 與 SMART II A寡核苷酸(oligonucle-otide)于攝氏42度反應(yīng)I. 5小時后稀釋10倍，再將2毫升含有5'端結(jié)尾的cDNA作為模板，加入至包含通用引物A Mix (universal Primer A Mix, UPM) (Clontech)及反轉(zhuǎn)高基因?qū)Ｒ恍砸?reverse gene specific primer) (primer 6, Table I)的 PCR 反應(yīng)溶液，此反應(yīng)以初期 變性溫度攝氏94度進行2分鐘，再以溫度循環(huán)變性溫度攝氏94度30秒、結(jié)合溫度攝氏55度30秒，及延長溫度攝氏72度60秒進行35個循環(huán)，最后以及溫度攝氏72度10分鐘進行最終延長。隨后利用巢式聚合酶連鎖反應(yīng)(Nested PCR)以稀釋50至100倍的第一次PCR產(chǎn)物為模板,與巢式通用引物(nested universal Primer A, NUP) Clontech)及巢式反轉(zhuǎn)高基因?qū)Ｒ恍砸?nested reverse gene specific primer) (primer 7,Table I)于上述相同情況下進行，放大后的產(chǎn)物亞克隆至pGemTeasy plasmid(Promega)并對其測序。最后以SignalP 3. 0測試Chiayi海水白點蟲的全長制動抗原的信號肽(signalpeptide)、SMART program 預(yù)測跨膜(transmembrane)片段，及 big-PI Predictorprogram預(yù)測肽裂解(propeptide cleavage)的可能omega (w) site及糖基化磷脂酰肌醇(glycosy lphosphat idyl inositol, GPI)的固定位置(anchor site)。密碼子置換(Codonreplacement)該制動抗原的原始序列(GenBank :FJ167511)是以軟件DNASTAR Lasergene 6進行分析，并依據(jù)氨基酸的結(jié)構(gòu)特性、疏水性及電荷分布等特性以適當?shù)陌被嶂脫Q終止密碼子，例如以甘胺酸(glycine)置換疏水性端(hydrophobicity alteration)、丙胺酸(alanine)置換可最小化結(jié)構(gòu)改變、精胺酸(arginine)可用以置換帶電部分(regionalcharge)。本實施例選定的置換殘基為核苷酸序列第309至311、393至395、468至470、519至521、540至542、657至659、及897至899個核苷酸。置換過終止密碼子的該制動抗原核酸序列以軟件GENEART Gene optimizer Sequence Analysis (Prisma Biotech Co.)分析，評斷標準包含GC含量及密碼子質(zhì)量評估(codon quality assessment),為使該序列在大腸桿菌(E.coli)、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母菌系統(tǒng)中有穩(wěn)定的高表達量，序列中的GC含量由原始序列的37%提升至47%。制動抗原質(zhì)粒(iAg plasmid)構(gòu)筑及包覆(encapsulation)本實施例構(gòu)筑兩個質(zhì)粒能表達于大腸桿菌的pGex-2t_iAg及能表達于石斑魚魚鰭細胞(grouper fin-1 ;GF_1)與經(jīng)接種過后的石斑魚活體上的pcDNA3. 1-optiAg,pGEX_2T 是米用 GE Healthcare (前 Amersham Biosciences)生產(chǎn)的產(chǎn)品，目錄編號27-4801-01 ；pcDNA3. 1(+)是采用 Invitrogen Life technologies 生產(chǎn)的產(chǎn)品,目錄編號V790-20。pGex-2T-iAg的構(gòu)筑方式為利用已置換的制動抗原DNA作為模板，設(shè)計一對引物(引物8 (SEQ ID NO 8)及引物9 (SEQ ID NO 9)，如表I及序列表所示)進行PCR以確認成熟蛋白質(zhì)(mature protein)是否含有該制動蛋白DNA片段,其PCR的溫度循環(huán)為初期變性溫度攝氏94度進行2分鐘，再以溫度循環(huán)變性溫度攝氏94度30秒、結(jié)合溫度攝氏58度30秒,及延長溫度攝氏72度60秒進行35個循環(huán),其后以膠體萃取試劑盒(gel extractionkit) (BIOMAN)將該放大后的DNA從瓊脂糖(agarose)分離(elute)出，并以限制酶BamHI及EcoRI (Invitrogen)切割后選殖至pGex_2T的BamHI及EcoRI限制酶切割位置。pcDNA3. 1-iAg的構(gòu)筑方式為利用已置換的制動抗原DNA作為模板，設(shè)計一對引物(引物8 (SEQ ID NO 8)及引物9 (SEQ ID NO 9)，如表I及序列表所示)進行PCR以確認成熟蛋白質(zhì)(mature protein)是否含有該制動蛋白DNA片段,其PCR的溫度循環(huán)為初期變性溫度攝氏94度進行2分鐘，再以溫度循環(huán)變性溫度攝氏94度30秒、結(jié)合溫度攝氏58度30秒，及延長溫度攝氏72度60秒進行35個循環(huán)，其后以膠體萃取試劑盒(gelextraction kit) (BIOMAN)將該放大后的DNA從瓊脂糖(agarose)分離(elute)出，并以限制酶BamHI及EcoRI (Invitrogen)切割后選殖至pGex_2T的BamHI及EcoRI限制酶切割位置。為達到DNA疫苗的功效，在本實施例中，該優(yōu)化的制動抗原質(zhì)粒pcDNA3. 1-iAg是參考臺灣地區(qū)專利
發(fā)明者卜莉亞, 宋延齡, 林彥宏 申請人:宋延齡