專利名稱：利用青霉菌轉(zhuǎn)化巖白菜素為一種特殊含氮衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用青霉屬中具有特殊酶活力的微生物菌種，將巖白菜素(bergenin) 通過微生物轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾為iB) -7- ((6-acety 1-2- (hydroxyimino) -4_met hyl-1, 2-dihydropyridin-3-yl) methyl)3, 4, 8, 10-tetrahydroxy-2-(hydroxymethy 1)-9-methoxy-2, 3, 4, 4a-tetrahydropyrano[3, 2~c] iso chromen-6 (10b H)-one, 艮口 (￡V7-((6-乙?；?2-(肟基)-4-甲基-1，2-二氫吡啶-3-烴基)甲基)_3，4，8， 10-四羥基-2-(羥甲基)-9-甲氧基-2，3，4，4a-四氫[3，2~c]異苯并吡喃_6 (10b H)-酮的方法。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為(Z )-7-((6-乙?；?2-(肟基)-4-甲基-1，2-二氫吡啶-3-烴基)甲基)_3，4，8，10-四羥基-2-(羥甲基)-9-甲氧基-2，3，4，4a_四氫[3，2~c] 異苯并吡喃-6 (10b H)-酮。
背景技術(shù)：
巖白菜素(bergenin)是一種天然存在的芳香族碳苷，是吡喃葡萄糖基沒食子酸的二氫異香豆素衍生物，分子中含有環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。已發(fā)現(xiàn)存在于30多種植物中，是一種豐產(chǎn)易得的天然有效成分。特別是在虎耳草科的巖白菜屬(Zfer^^ia)、紫金牛科的紫金牛屬C^i/isia)、大戟科的野桐屬(Medlotus)植物中含量豐富。在虎耳草科的厚葉巖白菜 {Bergenia crassifolia) Λ Q ^ {β. purpurascens)中禾口紫金牛禾斗的百兩金(Ardisia crispa)等植物中，得率高達(dá)4.5%。其它很多植物的巖白菜素含量在1%以上。結(jié)構(gòu)命名為 3, 4，8, 10-tetrahydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-3, 4，4a, 10b-tetrahydropyrano [3，2-c]isochromen-6(2H)-one。在《中華人民共和國藥典》中，已經(jīng)將其收載為鎮(zhèn)咳祛痰藥，在臨床上用于慢性支氣管炎。其優(yōu)點(diǎn)是僅對咳嗽中樞有選擇性的抑制作用，毒副作用小，不良反應(yīng)少，連續(xù)使用不產(chǎn)生耐藥性。除了此功能外，還有很多已經(jīng)報道但尚未用于臨床的生物活性和藥理作用， 例如抗關(guān)節(jié)炎、抗?jié)?、保肝、抗丙型肝炎病毒、抗HIV病毒、防糖尿病、抗心率失常、抑制蛋白酪氨酸磷酸酶IB(FTPlB)、抗心律失常、促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合、促進(jìn)病變組織恢復(fù)、殺錐蟲、 抗凝血、抗氧化、增強(qiáng)免疫、降血脂等多種作用。巖白菜素在植物中分布廣泛，含量高，容易提取分離，價格低廉。但巖白菜素水溶性差，很多活性不很顯著，非常有必要進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。通過結(jié)構(gòu)改造，發(fā)現(xiàn)新的巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，可望解決其口服吸收差、生物利用度低、生物活性不高的問題。同時也豐富了活性篩選的化合物庫，拓展新的生物活性和藥理功能。因此，巖白菜素是理想的天然產(chǎn)物材料和生物轉(zhuǎn)化底物。到目前為止，對巖白菜素的微生物轉(zhuǎn)化研究相對較少，僅見過1例報道， 2005年，Wang等利用真菌/^etfrotos os treat us將巖白菜素轉(zhuǎn)化為二聚體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種巖白菜素特殊酶化結(jié)構(gòu)修飾的微生物轉(zhuǎn)化方法篩選獲得可催化巖白菜素(bergenin)進(jìn)行特殊酶化結(jié)構(gòu)修飾成為(幻_7_ ((6-aCetyl-2-(hydroxyimino)-4-methyl-l, 2-dihydropyridin-3-yl) methyl)3, 4,8,10-tetrahydroxy-2-( hydroxymethyl)-9-methoxy-2, 3, 4, 4a-tetrahydropyrano [3,2~c] iso chromen-6 (10b H)-one，S卩依)-7-((6-乙酰基-2-(肟基)-4-甲基-1，2-二氫吡啶-3-烴基)甲基)_3， 4，8，10-四羥基-2-(羥甲基)-9-甲氧基-2，3，4，4a_四氫[3，2~c]異苯并吡喃_6 (10b H)-酮的微生物菌株，以便采用微生物轉(zhuǎn)化的方法，獲得巖白菜素的特殊轉(zhuǎn)化產(chǎn)物訪 )-7- ((6-acetyl-2- (hydroxyimino)-4-methyl-l,2-dihydropyridin-3-yl) methyl)3， 4，8, 10-tetrahydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-2, 3, 4，4a-tetrahydropyrano[3, 2 ~c] iso chromen-6 (10b H)_one0巖白菜素(bergenin)及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)式見

圖1。本發(fā)明采用具有巖白菜素結(jié)構(gòu)修飾特殊酶活力的微生物菌種接種到培養(yǎng)液中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵中期，向發(fā)酵液中加入含有巖白菜素(bergenin)的底物轉(zhuǎn)化液，使巖白菜素(bergenin)通過微生物轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行特殊的酶化結(jié)構(gòu)修飾成為(幻-7-((6_ acetyl-2- (hydroxyimino)-4-methyl-l, 2-dihydropyridin-3-yl) methyl)3, 4, 8, 10_t etrahydroxy-2-(hydroxymethyl)_9_methoxy_2，3, 4, 4a-tetrahydropyrano[3, 2~c] iso chromen-6 (10b H)-one，即依)-7-((6-乙?；?2-(肟基)-4-甲基-1，2-二氫吡啶-3-烴基)甲基)_3，4，8，10-四羥基-2-(羥甲基)-9-甲氧基-2，3，4，4a_四氫[3，2~c] 異苯并吡喃-6 (10b H)-酮的方法；轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌絲體，上清液用有機(jī)溶劑萃取，萃取液經(jīng)濃縮、硅膠層析分離、Sephadex純化或再經(jīng)HPLC制備，可得到含有該轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的溶液，再將該溶液經(jīng)濃縮、或低溫干燥處理后，可得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物晶體或粉末。利用青霉屬 {Penicillium spp.)菌株轉(zhuǎn)化巖白菜素為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物示意圖見圖1。上述具有巖白菜素結(jié)構(gòu)修飾特殊酶活力的青霉屬(Penicilliim spp.)菌種， 購自中國普通微生物保藏管理中心，為皮殼青霉(/^fliciBiws crustosum, CGMCC編號 3. 7142)。上述用于發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)液的營養(yǎng)物質(zhì)沒有特別的限制，可以是任何一種適合于該微生物生長的營養(yǎng)介質(zhì)，如真菌發(fā)酵培養(yǎng)液。上述具有巖白菜素結(jié)構(gòu)修飾特殊酶活力的微生物發(fā)酵培養(yǎng)條件是J8°C，180r/ min搖瓶振蕩或通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，培養(yǎng)48小時。上述的用于巖白菜素特殊酶化結(jié)構(gòu)修飾的微生物轉(zhuǎn)化的底物溶液，可在有機(jī)相中配制，可選有機(jī)溶劑為二甲基亞砜，或其他對細(xì)胞毒性較小、溶解度較大的有機(jī)溶劑。上述的轉(zhuǎn)化發(fā)酵液與菌絲體分離，采用過濾分離或離心分離的方法。上述的巖白菜素特殊酶化結(jié)構(gòu)修飾的微生物轉(zhuǎn)化條件轉(zhuǎn)化溫度為^°C，180r/ min搖瓶振蕩通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，反應(yīng)時間96 120小時，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液與菌絲體過濾或離心分開，可獲得含有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化液。在上述含有該巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的溶液中加入乙酸乙酯或任何其他可萃取產(chǎn)物的有機(jī)溶劑，振蕩、萃取，靜置或離心分層后，萃取液經(jīng)濃縮后，經(jīng)過重結(jié)晶，可得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物晶體；或者萃取液經(jīng)濃縮后，經(jīng)硅膠層析分離、Sephadex純化或再經(jīng)HPLC制備，可得到含巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的溶液，再將含轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的溶液經(jīng)濃縮、或重結(jié)晶、或低溫干燥處理后，可得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的粉末或晶體(純度> 90%)。巖白菜素的HPLC圖、不添加底物巖白菜素的空白對照發(fā)酵液的HPLC圖、添加巖白菜素的發(fā)酵液HPLC圖，分別見圖2、圖3和圖4。制得的巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物各項圖譜解析結(jié)果如下
ESI MS給出巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的準(zhǔn)分子正負(fù)離子峰分別為 /^ 507 ([M + H]+)和 505 ([M - ΗΓ)，可知其分子量為506。HRESI MS給出的準(zhǔn)分子離子峰為507.1398 [Μ + Y^Wm/z 529.1432 [Μ + Na]+和1035. 3194 [2Μ + Na]+，巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的 ESI MS譜圖和HRESI MS譜圖分別見圖5和圖6。在巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的1H NMR譜中，δΗ 3. 70 (3Η, s)處的譜線可認(rèn)為是OCH3 上的H-12 ；在低場區(qū)出現(xiàn)兩個質(zhì)子信號δ H 5. 39 (1Η, d, /=6. 0Hz)和δΗ 5.68(1 d, /=5. 4Hz)可分別認(rèn)為 3-0H 和 4-0H 上氫質(zhì)子信號。δΗ 4. 88 (1Η，t，/=4. 8 Hz) ,4. 70 (1H, d, /=15. 0 Hz)、3· 92(1H, d, /=15. 0 Hz)、3· 59 (1H, m)、3.21(lH，m)、3.65(lH，m)、3.85(lH， t, /=9.6 Hz)、4. 91(1H, d, /=10.2 Hz)、3. 40(1H, m)和 3. 83(1H, d, /=9. 6Hz)為巖白菜素碳苷上的特殊信號或是新增片段上的氫信號。δΗ2.08(3Η，s)和2.48(3H，s)為新增片段上的013的信號。δΗ8.45(1Η，s)和7.4(1H，s)可能是連接在苯環(huán)上的活潑氫。從巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的13C NMR譜，DEPT 90°和DEPT 135°譜確認(rèn)化合物中有碳苷上的五個 CH 峰(δ c 70. 4，72. 5，73. 6，79. 6，81. 4)和一個 CH2 峰(δ c 61. 9)，一個 OCH3 ( δ。59. 9)，一個 CH 峰(δ。130. 4)，一個 CH2 峰(δ。19. 3)，兩個 CH3 ( δ。16. 7， 26. 6) ο 12 個季碳峰(δ。111. 6，113.7，114.9，116.3，118.6，122.3，138.8，145.0， 149.7，161.3，164. 1,202.3)，其中 δ。202. 3 為羰基上的碳峰。結(jié)合巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的1H NMR和13C NMR中氫和碳的數(shù)據(jù)，初步確定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為巖白菜素的衍生物，其元素組成和分子式為C23H26O1凡。巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的屮NMR、13C NMR和DEPT 90°、DEPT 135°圖譜分別見圖7、圖8和圖9、圖10。巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的1H-1H COSY譜顯示δ H 5. 39 — δΗ3. 21，δ Η 5. 68 — δ η3· 65處耦合關(guān)系，δ η3· 21和3. 65處的譜線分別為Η-3和Η_4 ；由δ Η 3. 21 — δ Η3· 65 —δ Η3. 85耦合關(guān)系，5113.85處的譜線為!1-乜；由δ Η 3. 65 — δ Η3. 85 — δΗ4.91耦合關(guān)系，δΗ3. 85處的譜線為H-10b。由δΗ 3. 65 — δ Η 3. 21 — δΗ 3. 59耦合關(guān)系，可知 Sh 3. 59 處的譜線為 Η-2 ；由 δ Η 3.42 — δ Η 3. 59和 δ Η 3. 85 — δ Η 3. 59 耦合關(guān)系，δ Η 3. 42和3. 85處的譜線為H-11。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1H-1H COSY圖譜見圖11。在巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HSQC譜中，H-2，H_3，H_4，H-4a, H-IOb, H-Il的相關(guān)的碳峰為 δ c81. 4,70. 4,73. 6,79. 6,72. 5,61. 9，可確定為 C_2，C_3，C_4，C_4a，ClOb, C-Il0 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物HSQC圖譜見圖12。結(jié)合1H NMR, 13C NMR, DEPT 90，DEPT 135 譜的特征以及 1H-1H COSY 和 HSQC 中的相關(guān)關(guān)系可以確定 δΗ 3. 59(δε81.4), δΗ 3. 21 ( δ JO. 4)，δΗ 3· 65 ( δ c73. 6)，δΗ 3. 85 ( δ c 79. 6), δΗ4·91(δ。72·5)，δ Η3· 92，4· 70 ( δ c19. 3)，δ Η 3· 70 ( δ。59. 9)分別為 C_2，C-3， C-4, C-4a, ClOb, C-11, C-12 位所連的 H。在HMBC 譜中，季碳峰 δ。138. 8 與 Η-12 相關(guān)，歸屬 δ。138. 8 為 C-9 ； δ H 8. 45 與 C-9，季碳峰 δ c 145. 1,114.9 相關(guān)，可歸屬 δΗ 8. 45 為 10-0Η 上的 H，δ c 145. 1 為 C-10， δ c 114. 9 為 C-IOa ；與 H-IOb 相關(guān)的碳峰有 C_2，C_4，C_4a，C-9, C-10, C-IOa, δ c 118. 6， 122. 3，149. 7，164. 1，可歸屬季碳峰 δ c 118. 6 為 C_6，δ c 122. 3 為 C_7，δ c 149. 7 為 C_8。 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物部分HMBC圖譜A和B分別見圖13、圖14和圖15。
在進(jìn)行全面的1H NMR禾口 13C匪R檢測的基礎(chǔ)上，通過DEPlVH-1H COSY、HSQC和HMBC 等2D NMR技術(shù)對該化合物所有的屮和13C NMR信號進(jìn)行詳細(xì)的歸屬(見表1)。表1 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的NMR數(shù)據(jù)及譜峰歸屬(DMS0-d6，600 MHz)
權(quán)利要求
1.利用青霉菌轉(zhuǎn)化巖白菜素為一種特殊含氮衍生物的方法，所述的方法是將具有巖白菜素結(jié)構(gòu)修飾特殊酶活力的微生物菌種接種到培養(yǎng)液中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵中期，向發(fā)酵液中加入含有巖白菜素的底物轉(zhuǎn)化液，使巖白菜素通過微生物轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行特殊的酶化結(jié)構(gòu)修飾成為依)-7-((6-乙?；?2-(肟基)-4-甲基-1，2-二氫吡啶-3-烴基)甲基)_3，4，8，10-四羥基-2-(羥甲基)-9-甲氧基-2，3，4，4a_四氫 [3，2-c]異苯并吡喃-6 (10b H)-酮；轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌絲體，上清液用有機(jī)溶劑萃取， 萃取液經(jīng)濃縮后，經(jīng)過重結(jié)晶，可得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物晶體；或者萃取液經(jīng)濃縮后，經(jīng)硅膠層析分離、Sephadex純化或再經(jīng)HPLC制備，可得到含有該轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的溶液，再將該溶液經(jīng)濃縮、 或結(jié)晶、或低溫干燥處理后，可得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物晶體或粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用青霉菌轉(zhuǎn)化巖白菜素為一種特殊含氮衍生物的方法，其特征在于所述的具有巖白菜素結(jié)構(gòu)修飾特殊酶活力的微生物菌種是青霉屬 (Mcillium spp.)真菌，或者是任何可使巖白菜素進(jìn)行特殊酶化結(jié)構(gòu)修飾的微生物或混合微生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用青霉菌轉(zhuǎn)化巖白菜素為一種特殊含氮衍生物的方法， 其特征在于所述的青霉屬iPenicilliwn spp.)真菌，為菌株皮殼青霉iPenicillium crustosum, ) CGMCC 編號 3. 7142。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用青霉菌轉(zhuǎn)化巖白菜素為一種特殊含氮衍生物的方法，其特征在于所述的用于發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)液，是真菌發(fā)酵培養(yǎng)液或其他任何適合青霉屬真菌或其他能使巖白菜素進(jìn)行特殊酶化結(jié)構(gòu)修飾的微生物的營養(yǎng)介質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用青霉菌轉(zhuǎn)化巖白菜素為一種特殊含氮衍生物的方法， 其特征在于所述的向發(fā)酵液中加入含有巖白菜素的轉(zhuǎn)化液，用于巖白菜素特殊酶化結(jié)構(gòu)修飾的微生物轉(zhuǎn)化的底物溶液，是在有機(jī)相中配制；有機(jī)相為二甲基亞砜，或其他對細(xì)胞毒性較小、溶解度較大的有機(jī)溶劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用青霉菌轉(zhuǎn)化巖白菜素為一種特殊含氮衍生物的方法， 其特征在于所述轉(zhuǎn)化發(fā)酵反應(yīng)條件為轉(zhuǎn)化溫度范圍在觀 301，160 180 r/min搖瓶振蕩通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，反應(yīng)時間96 120小時，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液與菌絲體過濾或離心分開，可獲得含有巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用青霉菌轉(zhuǎn)化巖白菜素為一種特殊含氮衍生物的方法， 其特征在于所述發(fā)酵轉(zhuǎn)化液與菌絲體分離，采用過濾分離或離心分離的方法；上清液用有機(jī)溶劑萃取。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用青霉菌轉(zhuǎn)化巖白菜素為一種特殊含氮衍生物的方法， 其特征在于所述的萃取含有巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化液的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯，或任何其他可萃取產(chǎn)物的有機(jī)溶劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用青霉菌轉(zhuǎn)化巖白菜素為一種特殊含氮衍生物的方法， 其特征在于所述的萃取液，經(jīng)濃縮后，經(jīng)過重結(jié)晶，可得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物晶體；或者萃取液經(jīng)濃縮后，經(jīng)硅膠層析分離，S^hadex純化，或再經(jīng)HPLC制備，可得到含巖白菜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的溶液，再將該溶液經(jīng)濃縮、或結(jié)晶、或低溫干燥處理后，可得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的粉末或晶體。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用青霉菌轉(zhuǎn)化巖白菜素為一種特殊含氮衍生物的方法，該項法是將具有巖白菜素結(jié)構(gòu)修飾特殊酶活力的微生物菌種接種到培養(yǎng)液中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵中期，向發(fā)酵液中加入含有巖白菜素的底物轉(zhuǎn)化液；轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌絲體，上清液用有機(jī)溶劑萃取，萃取液經(jīng)濃縮后，經(jīng)過重結(jié)晶，可得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物晶體；或者萃取液經(jīng)濃縮后，經(jīng)硅膠層析分離、Sephadex純化或再經(jīng)HPLC制備，可得到含有該轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的溶液，再將該溶液經(jīng)濃縮、或結(jié)晶、或低溫干燥處理后，可得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物晶體或粉末。本發(fā)明的產(chǎn)物具有比巖白菜素更強(qiáng)的清除DPPH·的能力、抗氧化能力以及對脂質(zhì)過氧化的抑制效果。
文檔編號C12P17/18GK102337308SQ201110308478
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月12日
發(fā)明者冉昇, 崔桂友, 朱志雄, 陸廣念 申請人:揚(yáng)州大學(xué)